补锌制剂在制备治疗或预防肺动脉高压的药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及补锌制剂在制备治疗或预防肺动脉高压(ph)药物中的应用。


背景技术：

2.ph是一组罕见的、目前还无法被治愈的肺血管病理综合征，该病的5年死亡率约为50％，比许多癌症都高。根据病因的不同，ph可分为五大类：动脉性ph(pah)，左心疾病引起的ph，缺氧或肺部疾病引起的ph，肺动脉阻塞引起的ph，不明原因的ph。无论病因如何，该疾病的特征是肺血管壁肌化和远端肺动脉闭塞，这导致肺血管阻力和右心压力负荷的进行性增加，进而引起右心室纤维化和扩张，并最终导致失代偿性右心衰竭和死亡。
3.目前临床上常用的血管扩张剂在一定程度上改善了患者的预后和生活质量，但它们已被证明在解决肺脉管系统和心脏重塑方面的能力有限。
4.锌是一种重要的微量元素，在人体的含量仅次于铁，具有重要的生理功能，锌缺乏导可致脱发，免疫功能障碍，味觉异常和发育迟缓等。锌离子以锌信号的形式调控多种生物活性分子的表达及活化，如转录因子、酶、生长因子受体及配体等，被认为是一种重要的抗炎、抗氧化因子。目前已有许多研究表明，锌在许多心血管疾病中具有保护作用。但有关锌与ph发病机制的研究极少，补锌制剂在治疗或预防ph药物中的应用目前还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题，在于提供补锌制剂在制备治疗或预防ph的药物中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
7.本发明提供了补锌制剂在制备治疗或预防ph的药物中的应用，所述补锌制剂为可吸收的锌化合物。
8.作为本发明的一个优选实施方案，所述药物还包括药学中可接受的辅料或辅助性成分。
9.作为本发明的一个优选实施方案，所述药物为口服制剂。
10.作为本发明的一个优选实施方案，所述口服制剂为口服溶液。
11.所述药物通过抑制肺动脉平滑肌细胞过度增殖、迁移引起的肺血管重构，从而起到对ph发病的保护作用。具体地，所述肺动脉平滑肌细胞过度增殖、迁移是由缺氧引起的。
12.所述药物还包括用于治疗ph的标准药物。
13.作为本发明的一个优选实施方案，所述补锌制剂包括氯化锌、硫酸锌、醋酸锌、葡萄糖酸锌、氧化锌、吡啶甲酸锌、抗坏血酸锌、蛋白锌中的一种或几种。
14.作为本发明的一个优选实施方案，所述标准药物包括西地那非、他达拉非、波生坦、马西替坦、安立生坦、依前列醇、伊洛前列素吸入溶液、曲前列尼尔、司来帕格、利奥西呱中的一种或几种。
15.本发明优点在于：
16.1、与既往传统的ph舒张血管治疗相比，使用不良反应较少的补锌制剂治疗ph患者，通过抗炎、抑制肺动脉平滑肌细胞过度增殖迁移引起的肺血管重构，从而起到对ph发病的保护作用，提高患者生活质量。
17.2、开发补锌制剂新的用途，使补锌制剂得到了更好的应用。
18.3、为ph的治疗提供新的药物研究方向，具有很好的应用前景。
附图说明
19.图1为补充zncl2对ph大鼠血流动力学的影响。
20.图2为补充zncl2对ph大鼠右室质量指数的影响。
21.图3为补充zncl2对ph大鼠肺组织形态学的影响。
22.图4为补充zncl2对ph大鼠血清炎症因子tnf-α的影响。
23.图5为锌离子对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。
24.图6为锌离子对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞迁移的影响(ns：无统计学差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
具体实施方式
25.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
26.一、实验方法
27.1.动物实验分组设计及ph模型的建立
28.将雄性sd大鼠按随机数字表法随机分为四组：对照组，zncl2组，mct(野百合碱)组，mct+zncl2组。mct组和mct+zncl2组大鼠间隔1周接受两次20mg/kgmct腹腔注射造模，对照组和zncl2组仅给予等量生理盐水皮下注射。mct+zncl2组和zncl2组隔天腹腔注射5mg/kgzncl2，在mct造模后24h开始注射。对照组和mct组给予等量的生理盐水腹腔注射。于第3、4周对大鼠进行血流动力学测量、右心室肥厚指数(rvmi)测定，血清收集以及肺组织学观察，肺组织蛋白提取。
29.2.右心导管法血流动力学检测
30.在首次注射mct后第3、4周，采用右心导管法进行血流动力学检测。
31.操作要点为：
32.首先，大鼠腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，将动物放在加热垫上，以在手术过程中保持生理体温。剃去右颈毛发，局部消毒铺巾后，行大鼠颈部前正中切口，血管钳钝性分离周围组织并充分暴露右颈外静脉和右颈总静脉，在远心端结扎颈外静脉,预留牵引线。在右颈外静脉近心端呈45
°
角斜行剪开血管直径的1/3，并迅速沿此切口方向将备用的预先充满含肝素钠生理盐水的右心测压导管插入血管0.5～1.0cm，期间不断调整导管尖端朝向以顺畅通过。随即继续插入2～3cm到达右心房后，再缓慢提拉转动导管，使其进入右心室，待监视器出现典型的右心室波形后，往前再进入约5mm就可以到达肺动脉。当出现典型
的肺动脉压力波形时，予以稳定5min后记录肺动脉收缩压。测压导管末端连接三通管，三通管中的一端连接配有肝素钠盐水的注射器,另一端连接压力传感器,通过压力转换器将不同部位测压导管末端传输的压力信号的变化转化为电信号，可以形成特征性的波形图，并通过powerlab数据采集和分析系统对数据进行处理。
33.3.rvmi测定
34.测压后，处死大鼠，取大鼠整个心脏，并分离去除左右心房、大血管根部，将右心室游离壁剪下用滤纸吸掉水分后予以rv(rightventricule，右心室)及lv+s(leftventriculeplusventricularseptum，左心室+室间隔)重量的称量，最后计算右心室质量指数[rvmi＝rv/(lv+s)]。
[0035]
4.he染色
[0036]
测压结束后，处死大鼠，取左下肺，用4％多聚甲醛固定，并常规脱水、石蜡包埋，切片，he染色，进行形态学分析。具体步骤如下：
[0037]
(1)蒸馏水10min、70％乙醇10min、80％乙醇10min、90％乙醇10min、95％乙醇10min、100％乙醇45min、100％乙醇45min、透明剂ⅰ45min、透明剂ⅱ45min、石蜡ⅰ1h、石蜡ⅱ1h。
[0038]
(2)石蜡包埋，切片。
[0039]
(3)烤片10min、二甲苯ⅰ脱蜡10min、二甲苯ⅱ脱蜡10min、100％乙醇5min、100％乙醇、95％乙醇4min、90％乙醇3min、80％乙醇2min、70％乙醇2min、流动水清洗2min。
[0040]
(4)苏木素染色4min、清水冲洗、1％盐酸乙醇液分化5s、自来水洗30s、0.5％伊红染色、70％乙醇脱水10s、80％乙醇10s、90％乙醇1min、95％乙醇2min、100％乙醇5min、二甲苯ⅰ中透明5min、二甲苯ⅱ中透明5min，中性树脂封片。
[0041]
(5)每张切片在距离肺门处大约2mm处随机选取直径约100μm范围的肺小动脉5支，采用imagej图像分析软件对其进行分析
[0042]
5.免疫组织化学染色
[0043]
(1)取材固定后从烤箱中取出载玻片，置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min。
[0044]
(2)分别置于无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、75％乙醇、50％乙醇中各浸泡5min，放入自来水冲洗，防止其干燥。
[0045]
(3)在高压锅内加入枸橼酸钠修复液至足以漫过切片，加热至沸腾。
[0046]
(4)放入切片，盖上锅并锁定见小阀门升起来，喷气2-3min后关闭电源，置于凉水中冷却。
[0047]
(5)用组化笔在切片正面圈出组织位置，pbs冲洗2min，重复3次。
[0048]
(6)除去pbs，滴加3％h2o2去离子水，37℃孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。
[0049]
(7)pbs冲洗2min，重复3次。
[0050]
(8)滴加10％山羊血清，37℃孵育1h。
[0051]
(9)去除封闭剂。按各抗体说明书稀释，将一抗溶于pbs中。每张切片滴加60-80μl稀释后的一抗，4℃过夜。
[0052]
(10)pbs冲洗2min，重复3次。
[0053]
(11)滴加试剂1，37℃孵育10-20min；pbs冲洗2min，重复3次；滴加试剂2，37℃孵育
10-20min；pbs冲洗2min，重复3次。
[0054]
(12)按说明书配制dab溶液(二氨基联苯胺)，每张切片加一滴新鲜配制的dab液，静置5min，肉眼观察组织呈淡黄色，或置于显微镜下观察呈棕黄色后，自来水流水冲洗5-10min。
[0055]
(13)加即用型苏木素复染1-2min，自来水流水冲洗，可根据组织染色程度反复染色，直到满意为止。
[0056]
(14)切片分别置于75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇中各浸泡5min，再置于全新二甲苯中浸泡20min。
[0057]
(15)从二甲苯中取出盖玻片，滴加中性树脂，覆上盖玻片，注意去除气泡，置于显微镜下观察并拍照。
[0058]
6.肺动脉平滑肌细胞的原代培养
[0059]
雄性spf级sd大鼠，颈椎脱臼处死后，剃除胸部毛发，碘伏、75％酒精消毒，在无菌条件下依次切开胸部皮肤、胸壁、肌层，剪断肋骨，暴露胸腔，用眼科镊提起肺叶，剪断肺门。分离的肺叶立即放入装有双抗及pbs的培养皿中，迅速转入细胞培养室的超净工作台。在超净台内迅速分离出肺动脉，剔除纤维结缔组织，沿肺动脉纵轴剪开暴露内壁，用弯镊在肺动脉内壁小心擦拭以去内皮，剪碎贴壁后倒置，加入含15％胎牛血清的dmem/f12培养基，置37℃，5％co2培养箱培养。3～4h后翻转培养瓶，使培养液浸没组织块，每3天更换一次培养基，约1周后，细胞融合达到70～80％，以0.25％胰蛋白酶消化制成细胞悬液，传代，细胞计数，分别以2
×
105/孔及3
×
103/孔的密度接种于6孔板和96孔板中，用于后续干预实验。
[0060]
7.edu细胞增殖检测
[0061]
(1)配制2
×
的edu工作液：用细胞培养液1:500稀释edu(10mm)即可得到2
×
的edu工作液(20μm)。
[0062]
(2)将37℃预热的2
×
的edu工作液，等体积加入6孔板中，使6孔板中的edu终浓度变为1
×
，孵育4h。
[0063]
(3)去除培养液，加入1ml4％多聚甲醛，室温固定15min。
[0064]
(4)去除4％多聚甲醛，每孔用1ml3％bsa洗涤细胞3次，每次3-5min。
[0065]
(5)去除3％bsa，每孔用1ml0.3％tritonx-100，室温孵育10-15min。
[0066]
(6)去除0.3％tritonx-100，每孔用1ml3％bsa洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。
[0067]
(7)配置click反应液：按6孔板每孔所需反应液比例为
[0068]
clickreactionbuffer430μl、cuso420μl、azide5551μl、clickadditivesolution50μl，在配置后15min内使用。
[0069]
(8)去除上一步骤中的3％bsa，每孔加入0.5mlclick反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品，室温避光孵育30min。
[0070]
(9)吸除click反应液，用3％bsa洗涤3次，每次3-5min。
[0071]
(10)细胞核染色：按1:1000比例用pbs稀释hoechst33342，吸除3％bsa后每孔加1
×
hoechst33342溶液1ml，室温避光孵育10分钟。
[0072]
(11)吸除1
×
hoechst33342溶液，用3％bsa洗涤3次，每次3-5分钟。
[0073]
(12)荧光检测：hoechst33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。azide555为红色荧光，最大激发波长是555nm，最大发射波长是565nm。
[0074]
(13)使用imagej软件进行细胞计数。
[0075]
8.细胞划痕实验
[0076]
(1)先用marker笔在6孔板底部，用直尺比着，均匀划出横线，大约每隔0.5-1.0cm一条，横线穿过孔，每孔约划5条横线。
[0077]
(2)6孔板每孔接种2
×
105个细胞，培养至融合约90％时，去除培养基，更换0.2％fbs培养基24h，去除培养基。
[0078]
(3)用枪头比着直尺，尽量垂直于6孔板底部的横线划痕，注意保持枪头垂直。
[0079]
(4)pbs清洗3遍，洗净划下的细胞，加入10％fbs的培养基，继续培养。
[0080]
(5)48h后置于倒置显微镜下拍照。运用imagej对结果进行分析，计算细胞迁移率，细胞迁移率(％)＝(初始划痕面积-现划痕面积)/初始划痕面积
×
100％。
[0081]
二、实验结果
[0082]
1.大鼠右心血流动力学结果
[0083]
如图1所示，通过右心导管法检测获得四组大鼠血流动力学数据rvsp和mpap。mct组大鼠的rvsp以及mpap较对照组显著升高[rvsp：(27.85
±
4.08)比(51.96
±
9.82)mmhg，p《0.001；mpap：(19.27
±
2.88)比(39.09
±
5.07)mmhg，p《0.001]，与mct组比，mct+zncl2组大鼠rvsp和mpap水平降低(rvsp：(51.96
±
9.82)比(47.40
±
8.61)mmhg，p《0.05；mpap：(39.09
±
5.07)比(31.14
±
4.17)mmhg，p《0.05)，而对照组较zncl2组rvsp和mpap无明显差异。以上结果表明，zncl2能降低mct诱导的ph大鼠的rvsp以及mpap。
[0084]
2.rvmi
[0085]
与血流动力学的改变相对应，mct组大鼠的rvmi(％)较对照组显著升高[22.74
±
5.87)％比(56.11
±
13.51)％，p《0.001]，与mct组比，mct+zncl2组大鼠rvmi(％)水平降低[(56.11
±
13.51)％比(48.72
±
12.00)％，p《0.05)]，而对照组较zncl2组rvmi(％)无明显差异。以上结果表明，zncl2能降低mct诱导ph大鼠的右心室重构。
[0086]
3.大鼠肺组织形态学改变
[0087]
如图3的肺组织he染色及α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)免疫组化染色结果显示，mct组肺动脉内膜较对照组明显增厚，血管腔变窄，mct+zncl2组较mct组血管壁增厚，而单独zncl2干预对血管壁无明显影响。
[0088]
4.大鼠血清炎症因子tnf-α浓度
[0089]
elisa结果表明(图4)，与对照组相比，mct组大鼠血清炎症因子tnf-α水平显著升高。与mct组相比，mct+zncl2组大鼠tnf-α水平降低。
[0090]
5.肺动脉平滑肌细胞增殖
[0091]
肺动脉平滑肌细胞的异常增殖是肺血管重构的重要机制之一，运用原代培养的肺动脉平滑肌细胞，我们研究了锌对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞异常增殖的影响。如图5所示，运用edu法检测细胞增殖水平我们发现，缺氧48h能促进肺动脉平滑肌细胞增殖，而缺氧的同时给予40μmzncl2干预能部分抑制缺氧引起的细胞增殖，以上结果表明zncl2能抑制缺氧引起的肺动脉平滑肌细胞的增殖。
[0092]
6.肺动脉平滑肌细胞迁移
[0093]
肺动脉平滑肌细胞迁移率增加可促进肺血管的重塑，我们研究了锌对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞迁移水平的影响。如图6所示，我们发现缺氧可促进肺动脉平滑肌细胞的
迁移，而zncl2部分抑制缺氧引起的肺动脉平滑肌细胞迁移水平的提高。
[0094]
三、实验结论
[0095]
补锌制剂通过抗炎、抑制肺动脉平滑肌细胞过度增殖迁移引起的肺血管重构从而起到对ph发病的保护作用。
[0096]
基于研究结果，补锌制剂联合标准药物治疗预期会明显改善ph患者的临床转归，指导临床治疗。
[0097]
本发明与既往传统的扩血管治疗相比，使用不良反应较少，可改善ph肺血管重构从而达到降低ph的目的；本发明开发了补锌制剂新的用途，使补锌制剂得到了更好的应用；为ph提供新的药物研究方向，具有很好的应用前景。
[0098]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。