中药复方制剂的制备方法、该制剂及其药物用途

1.本发明涉及一种中药复方制剂的制备方法，该中药复方制剂具体应用于治疗癌前病变药物领域，本发明还涉及该中药复方制剂在制备治疗抑制肺腺癌肿瘤增长的药物中的用途。


背景技术：

2.肺癌发病率和死亡率一直居恶性肿瘤首位。随着ct影像诊断技术的发展与广泛应用以及人们健康意识的提高，越来越多的肺部结节被发现。而肺癌的早期影像学表现常为肺结节形式。早期科学地评价肺结节，对肺结节良恶性进行判断,具有重要的临床价值。
3.大部分的肺结节是在检查时偶然发现的，患者大多无临床症状，肺内小结节绝大部分属于良性病变，但35％为恶性病变。目前对肺结节的评估主要综合其影像学、实验室检查及穿刺病理学检查，其中最重要的是影像学随访与观察。许多肺小结节影像学表现缺乏特异性,病因复杂，病灶较小，临床特征和影像学特点往往不典型。
4.对于大多数的肺部小结节而言目前不推荐手术治疗，而非手术穿刺活检敏感性及准确性较低，许多指南建议随访观察。而ct随访良恶性鉴别较为困难，对良性肺小结节诊断假阳性率较高，会导致过度诊断和治疗及医疗资源浪费。长期ct随访及后续的过度治疗，不仅给患者带来身体心灵上的伤害，还使患者长期处于焦虑恐慌中，亦增加患者的经济负担。
5.肺小结节的诊治是目前临床上棘手的医学问题,随着肺结节患者越来越多,探索其有效治疗方法，具有重要的现实意义。
6.根据结节的大小分类，直径《5mm的肺结节称为微小结节，直径为5～10mm称为小结节。根据密度可分为实性肺结节(solid nodule,psn)和纯磨玻璃结节(pure ground-glass nodule,pggn)。根据病变程度主要包括良性肿瘤、结核病或结节病、炎性假瘤或炎性结节或机化性肺炎、真菌病或寄生虫病及血肿或血管性病变等，而恶性病变主要指肺癌、肺腺癌、转移瘤、淋巴瘤等。
7.对于肺腺癌的增敏免疫治疗药物，目前的研究正在广泛展开。
8.紫锥菊原产于北美和加拿大南部，属于松果菊属植物。近年来，我国部分地区亦有引种。紫锥菊中含多糖、菊苣酸、咖啡酸、生物碱等活性物质，有增强免疫力、消炎镇痛等作用。紫锥菊长期以来被认为可以作为免疫促进剂使用，它的提取物在西方国家医药市场长期占据较高份额。在美国、欧洲等西方国家和地区，目前紫锥菊提取物通常用于治疗外伤、虫兽叮咬、头部以及肌肉疼痛等。有报道中认为，与传统镇痛药物或抗生素相比，紫锥菊提取物的耐抗药性和药源性反应抑制效果都更为优异。
9.然而，目前并未有报告紫锥菊及其提取物可以用于肺腺癌肿瘤等的治疗。
10.冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌(cordyceps sinensis(berk)sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，是我国传统名贵滋补中药。据《本草从新》记载，其具有补肺益肾、止血化痰的功效，用于治疗肺虚咳嗽、咯血盗汗等症。
11.目前，冬虫夏草仍作为滋补品使用，对于其对癌症肿瘤、特别是肺腺癌是否有疗
效，并未见到报道。


技术实现要素：

12.本发明要解决的技术问题
13.本发明的发明人针对紫锥菊的药理活性以及在肿瘤疾病的治疗进行了深入研究，发现，通过特定的冷冻干燥方式制备紫锥菊干粉和冬虫夏草干粉，并将二者混合，得到的复方制剂对于肺腺癌肿瘤有良好的抑制作用，特别是对于抑制pbmc处理的nsg小鼠肺腺癌肿瘤增长，取得了非常优异的效果。
14.因此，本发明的目的在于提供一种中药复方制剂的制备方法，该制备方法制得的中药复方制剂对于肺腺癌肿瘤有良好的抑制作用，特别是对于抑制pbmc处理的nsg小鼠肺腺癌肿瘤增长，取得了非常优异的效果。
15.解决技术问题的技术方案
16.方案1.一种中药复方制剂的制备方法，所述中药复方制剂的配方为：紫锥菊干粉1重量份以及冬虫夏草干粉0.5～0.8重量份，其特征在于，所述制备方法包括：以冷冻干燥粉碎工艺制备紫锥菊干粉以及冬虫夏草干粉。
17.方案2.方案1所述的中药复方制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：通过冷冻干燥粉碎工艺分别制造紫锥菊干粉以及冬虫夏草干粉，而后进行混合。
18.方案3.方案2所述的中药复方制剂的制备方法，其特征在于，所述混合的时间为2～3小时/千克。
19.方案4.方案1或2所述的中药复方制剂的制备方法，其特征在于，经过所述冷冻干燥粉碎后，所述紫锥菊干粉和冬虫夏草干粉的粒度均为50～100μm。
20.方案5.方案1或2所述的中药复方制剂的制备方法，其特征在于，经过所述冷冻干燥粉碎后，所述紫锥菊干粉的含水量为3～5wt％，冬虫夏草干粉的含水量为5～12wt％。
21.方案6.方案1或2所述的中药复方制剂的制备方法，其特征在于，所述紫锥菊的冷冻干燥粉碎工艺包括：
22.(1)紫锥菊的冷冻干燥
23.(a)在常压环境下将紫锥菊降温至-50℃～-40℃并在该温度维持2～10小时，进行预冷，
24.(b)在预冷温度下，经过60～180秒将压力降低至60～70pa，
25.(c)将温度从上述预冷温度分阶段上升，与此同时，真空气压随温度的阶段性上升而阶段性下降，每个阶段温度上升幅度为10～15℃，真空气压下降幅度为10～20pa，在每个阶段维持2～4小时，直至达到最后一个阶段，最后一个阶段的温度为1～10℃之间，压力为20pa以下，最后一个阶段维持1～2小时；
26.(2)紫锥菊的粉碎
27.将冷冻干燥后的紫锥菊粉碎为粒度达到50～100μm。
28.方案7.方案1或2所述的中药复方制剂的制备方法，其特征在于，相比于紫锥菊原料药材，干燥冷冻粉碎后的紫锥菊干粉中菊苣酸的损失率为5％以下。
29.方案8.一种中药复方制剂，所述中药复方制剂的配方为：紫锥菊干粉1重量份以及冬虫夏草干粉0.5～0.8重量份，其特征在于，其是通过方案1～7中任一项所述的方法制备
的。
30.方案9.一种中药复方制剂在制备治疗肺腺癌小结节的药物中的用途，其特征在于，该中药复方制剂的配方为：紫锥菊干粉1重量份以及冬虫夏草干粉0.5～0.8重量份，并且是通过方案1～7中任一项所述的方法制备的。
31.方案10.一种中药复方制剂在制备抑制pbmc处理的nsg小鼠肺腺癌肿瘤增长的药物中的用途，其特征在于，该中药复方制剂的配方为：紫锥菊干粉1重量份以及冬虫夏草干粉0.5～0.8重量份，并且是通过方案1～7中任一项所述的方法制备的。
附图说明
32.图1：实验组(g2)和对照组(g1)小鼠的体重变化图；
33.图2：实验组(g2)和对照组(g1)的cd4水平对比图；
34.图3：实验组(g2)和对照组(g1)的pbmc处理的nsg小鼠的肿瘤增长变化图。
具体实施方式
35.本发明的发明人在对于紫锥菊的药理活性的研究过程中发现，其经过特定的冷冻干燥粉碎工艺制成干粉并与冬虫夏草干粉进行配伍后，得到的中药复方制剂对于治疗肺腺癌小结节和抑制肺腺癌肿瘤增长有较好的疗效。
36.对于采用特定的冷冻干燥粉碎工艺制备的紫锥菊干粉与冬虫夏草干粉进行混合后获得上述效果的具体机理，目前尚无定论。本发明的发明人推测可能是如下机理。
37.在以往的技术中，对于紫锥菊的药物利用方式主要是通过有机溶剂提取紫锥菊的活性成分，再加以利用。但是，这样的方式对于紫锥菊的活性成分的损失非常之大，有些情况下，损失率甚至可以达到20％以上，部分对于溶剂溶解度不佳的活性成分可能完全丢失。这样的情况下，紫锥菊的提取物可能并不能发挥出其药物作用和效果。另外，这样提取得到的提取物通常为有机液体溶液，基本上无法与冬虫夏草干粉进行混合，因此，以往的技术中，并不存在紫锥菊干粉与冬虫夏草干粉的复方制剂。而在本发明中，通过特定的冷冻干燥粉碎工艺对紫锥菊进行粉碎，从而最大限度地保留了其活性成分，损失率可以降至5％以下，因此，可以极大地发挥出其药物作用和效果。另外，得到的紫锥菊干粉可以容易地与冬虫夏草干粉混合，制备散剂、片剂、胶囊剂等，通过二者配伍的复方制剂，可以实现对肺腺癌肿瘤增长的抑制。
38.下面，对本发明进行具体说明。
39.本发明涉及一种中药复方制剂的制备方法，所述中药复方制剂的配方为：紫锥菊干粉1重量份以及冬虫夏草干粉0.5～0.8重量份，其特征在于，所述制备方法包括：以冷冻干燥粉碎工艺制备紫锥菊干粉以及冬虫夏草干粉。所述中药复方制剂的优选配方为：紫锥菊干粉1重量份以及冬虫夏草干粉0.7～0.8重量份
40.本发明的中药复方制剂是紫锥菊干粉和冬虫夏草干粉混合制剂。虽然其机理尚不明晰，但从确保活性成分的浓度以及防止出现拮抗作用的观点出发，本发明的中药复方制剂优选仅包含紫锥菊干粉和冬虫夏草干粉这两种活性成分，而不包括其他中药、西药活性成分。
41.在一个实施方式中，优选本发明的中药复方制剂进一步与帕博利珠单抗
(pembrolizumab)联用。通过联合使用本发明的中药复方制剂和帕博利珠单抗，能够进一步凸显增敏免疫治疗的效果。
42.在上述制备方法中，优选通过冷冻干燥粉碎工艺分别制造紫锥菊干粉以及冬虫夏草干粉，而后进行混合。如上所述，该冷冻干燥粉碎工艺可以最大限度地保留紫锥菊的活性成分，从而与冬虫夏草配伍后发挥出对肺腺癌肿瘤增长的抑制效果。
43.将经过以上的冷冻干燥粉碎步骤分别制备的紫锥菊干粉和冬虫夏草干粉进行混合。混合可以采用本领域常用的混合方法和机器。混合的条件优选为2～3小时/千克，这样的条件下可以确保二者混合均匀，从而确保剂量一致性。
44.经过所述冷冻干燥粉碎后，所述紫锥菊干粉和冬虫夏草干粉的粒度均为50～100μm。当所述紫锥菊干粉和冬虫夏草干粉的粒度在100μm以下时，小结节的治疗效果和肿瘤的抑制效果更为明显，疗效显现时间更短。而粒度在50μm以上时，粉碎工艺较为简单，紫锥菊和冬虫夏草在粉碎过程中的损失较少，可以提高成本效益。更为优选的是，紫锥菊干粉的粒度为50～80μm，更为优选60～70μm；冬虫夏草干粉的粒度为50～80μm，更为优选60～70μm。优选的是，二者的粒度相同或接近，这样可以使得混合更为均匀，从而防止剂量偏差。
45.经过所述冷冻干燥粉碎后，所述紫锥菊干粉的含水量为3～5wt％，冬虫夏草干粉的含水量为5～12wt％。控制含水量的目的主要在于防止药物在储存过程中发生性状变化，另外，降低药物原料的含水量，可以降低打粉难度，提高打粉细度，从而发挥更好的药效。
46.本发明中，在制备所述中药复方制剂时，需要将紫锥菊和冬虫夏草分别制成干粉后再进行混合。这是因为，紫锥菊和冬虫夏草的原料的硬度、脆性、解构性均不相同，如果先将二者混合后进行打粉，则会出现二者粉末粒度不均匀、打粉时间延长等情况。
47.本发明中，所述紫锥菊的冷冻干燥粉碎工艺包括：
48.(1)紫锥菊的冷冻干燥
49.(a)在常压环境下将紫锥菊降温至-50℃～-40℃并在该温度维持2～10小时，进行预冷，
50.(b)在预冷温度下，经过60～180秒将压力降低至60～70pa，
51.(c)将温度从上述预冷温度分阶段上升，与此同时，真空气压随温度的阶段性上升而阶段性下降，每个阶段温度上升幅度为10～20℃，真空气压下降幅度为10～20pa，在每个阶段维持2～4小时，直至达到最后一个阶段，最后一个阶段的温度为1～10℃之间，压力为20pa以下，最后一个阶段维持1～2小时；
52.(2)紫锥菊的粉碎
53.将冷冻干燥后的紫锥菊粉碎为粒度达到50～100μm。
54.作为紫锥菊真空冷冻干燥的一个例子，可以采用以下的工艺。
55.例如，该工艺开始时，可以将预冷温度设为-40℃时，将真空气压设为60～70pa，并维持该温度、该气压2～4小时；接着，将温度上升至-25℃，真空气压降低为50～60pa，并维持该温度、该气压2～4小时；进一步，将温度上升至-10℃，真空气压降低为30～40pa，并维持该温度、该气压2～4小时；进一步地，将温度上升至5℃，真空气压降低为20pa左右，并维持该温度、该气压1～2小时，从而完成真空干燥冷冻。
56.本发明的发明人对紫锥菊中的菊苣酸在冷冻干燥过程中的行为进行了研究，结果发现，在紫锥菊的冷冻干燥过程中，紫锥菊中的菊苣酸有可能会随冷冻水分而损失，导致产
品中菊苣酸浓度降低。因此，本发明中采用了上述的新型冷冻干燥工艺。
57.在本发明的上述冷冻干燥工艺中，可以将紫锥菊中的菊苣酸的损失量控制在非常低的水平，可以控制在5％以下，甚至可以控制在2％以下。其中具体的原理目前尚不清楚，但本发明的发明人推测，有可能是上述的真空冷冻干燥中通过控制温度和真空气压，调整了水分的析出和升华形态，使得菊苣酸没有机会随水分析出，从而最大限度地被保留在紫锥菊干燥品中。
58.另外，发明人认为，上述的真空冷却干燥还能够实现一个前所未有的技术效果。以往的中药材的真空冷却干燥之后，中药材温度非常低，通常为-30℃甚至-40℃以下。干燥完毕后，中药材与大气接触之后，迅速在中药材表面形成冷凝水，导致中药材返潮。然而，通过本发明的上述真空冷冻干燥，当干燥完毕之后，紫锥菊的温度已经为1℃以上的较高温度。这样温度的紫锥菊在进入粉碎工艺而暴露在大气中时，不会因为过低的温度而形成冷凝水导致干燥的紫锥菊重新吸收水分而返潮，确保了紫锥菊干粉的低含水量。
59.由此，制备了本发明的中药复方制剂，所述中药复方制剂的配方为：紫锥菊干粉1重量份以及冬虫夏草干粉0.5～0.8重量份。
60.上述制得的中药复方制剂，可以直接制成散剂，也可以通过打片机制成片剂，或填入胶囊中制成胶囊剂，以方便携带和服用。通常而言，按照所述片剂、胶囊剂或散剂中菊苣酸含量为0.5mg～1.2mg/剂的浓度来制备上述剂型。
61.通过本发明的制备方法制得的中药复方制剂、以及由其制成的散剂、片剂和胶囊剂可以用于抑制肺腺癌肿瘤的增长。特别地，本发明的中药复方制剂、以及由其制成的散剂、片剂和胶囊剂可以非常有效地抑制pbmc处理的nsg小鼠肺腺癌肿瘤增长。
62.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
63.实施例
64.1.中药复方制剂的制备
65.取已经经过清洗和简单干燥的紫锥菊进行冷冻干燥粉碎。
66.1-1.紫锥菊干粉的制备
67.首先，在常压环境下将紫锥菊降温至-40℃并维持8小时，进行预冷。
68.而后，维持预冷温度(-40℃)，经过90秒将气压调整为70pa，并维持该温度、该气压4小时；接着，将温度上升至-25℃，真空气压降低为60pa，并维持该温度、该气压4小时；进一步，将温度上升至-10℃，真空气压降低为40pa，并维持该温度、该气压2小时；进一步地，将温度上升至5℃，真空气压降低为20pa，并维持该温度、该气压1小时，完成真空冷冻干燥。
69.接着，采用哈瑞斯牌小型粉碎研磨机(500g)对经过冷冻干燥的紫锥菊进行粉碎，得到粒度约为65μm的紫锥菊干粉。
70.1-2.冬虫夏草干粉的制备
71.对冬虫夏草原料药材喷雾低温雾化水分子，使之达到75～80％的吸水率。而后，进行快速冷冻，在温度-55℃下冷冻5小时。接着，在温度-45℃下真空冷冻干燥15小时，进行真空冷冻干燥，得到含水率为11％的成品。
72.接着，采用哈瑞斯牌小型粉碎研磨机(500g)对经过冷冻干燥的冬虫夏草进行粉碎，得到粒度约为65μm的冬虫夏草干粉。
73.1-3.混合
74.将得到的两种干粉按照紫锥菊干粉1重量份：冬虫夏草干粉0.7重量份的比例进行混合，其中，紫锥菊干粉50g，冬虫夏草干粉35g，合计85g。混合时间为45分钟。
75.得到中药复方制剂。
76.2.动物实验
77.2-1.动物处理过程
78.委托上海立迪生物技术有限公司构建30只lupf116人源化肺腺癌pdx小鼠(pbmc处理的nsg小鼠，6～7周龄，6只备用)，并注射人外周血单个核细胞，重建人源化免疫系统。动物实验开始时，根据动物体重，在第0天通过biobook随机分配功能将小鼠随机分为对照组g1和试验组g2，以达到近似的各组均重，减少组间偏差。从肿瘤传代开始，对照组g1的动物被给予为期44天的中药复方制剂治疗(灌胃；给药方案：第1天到第2天16.67mg(c.a.)/kg，第3天到第44天50mg(c.a.)/kg，每日1次，连续44天)，实验组g2第1天到第44天以合用50mg(c.a.)/kg和帕博利珠单抗(pembrolizumab)10mg/kg的方式给药。其中，c.a.表示菊苣酸。
79.每天观察动物的健康状态及对药物的综合反应，未发现任何外观或行为异常表现。
80.2-2.小鼠病理分析及评价
81.(1)体重水平
82.每周两次对实验组(g2)和对照组(g1)小鼠进行称重，称重结果参见图1。
83.可以看到与对照组相比，实验组中的中药复方制剂对小鼠体重均无显著影响。
84.(2)t细胞亚群检测
85.在第28天收集动物血样(1％～4％异氟烷吸入3-5min麻醉后，通过眼眶采集全血)，edta-k2抗凝，室温静置2小时后于4℃2000xg下离心10min，分离血浆，采用流式细胞仪检测t细胞亚群，测量结果参见图2。
86.可以看到：与对照组相比，实验组cd4水平得以明显提高。说明实验组的小鼠在罹患肿瘤的情况下，免疫力得以显著提高。
87.(3)肿瘤定量分析
88.对每组的12只小鼠，每四天经co2窒息后脱颈椎安乐死一只。取出整个肺腺癌肿瘤组织，用预冷的pbs快速冲洗，吸干水分后，称重，称重结果参见图3。
89.上述实验数据用均数
±
标准误表示(mean
±
s.e.m.)。数据由graphpad prism 9或spss采用相应的统计方法分析，具体分析方案在图例中注明。p《0.05认为有显著性差异。
90.以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。