一种具有修复功能的miRNA冻干保护剂及其冻干球制备方法与流程

一种具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法
技术领域
1.本发明涉及护肤品技术领域，具体为一种具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法。


背景技术：

2.micrornas(mirnas)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码rna，其大小约长20-25个核苷酸。mirna是外泌体中的sirna中最主要的一部分，其中成熟的mirna结合到与其互补的mrna的位点通过碱基配对调控基因表达。mirnas在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的mirnas只在特定的组织和发育阶段表达，mirna组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明mirna在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。目前部分的mirna的生理功能有了较深的研究，例如mirnas调节了细胞生长，组织分化，因而与生命过程中的发育、疾病有关。一系列的研究表明：mirnas在细胞生长和凋亡，血细胞分化，同源异形盒基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。
3.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的未分化细胞，其在皮肤创面修复、组织再生中发挥重要作用，是目前最有临床应用价值的医疗手段。而经过研究发现，干细胞在创伤修复和组织再生中的作用主要与它们旁分泌能力有关，而不是与它们的分化能力有关。干细胞的旁分泌主要是通过外泌体来实现的。外泌体是一种细胞分泌的微囊泡，最重要的作用就是传递细胞间的通讯信号。而外泌体调节主要是通过mirna来实现调节免疫反应，调控靶细胞的增殖、迁移、分化、凋亡等生理反应，还可以促进血管再生，维持机体内环境的稳态。
4.目前市面上的化妆品冻干粉或冻干球产品配方和工艺主要以将溶液成分通过冻干成型为主，极少考虑在冻干过程中的预冻和脱水过程中对活性成分结构和性能的保护。冻干球制备在行业中已经比较广泛，主要用模具进行手工制备和分装方法，模具基本会有半球冷冻成型，手工合成球的步骤，操作复杂并且，复杂的步骤会导致大规模生产成本高，重复性差，人力要求高，人为带入较多的污染源等问题。
5.基于上述问题，本发明旨在提供一种可以有效保护mirna冻干过程中活性，并兼具护肤品保湿、美白修复等功能的冻干保护剂及其冻干球制备方法，以获得活性高、易溶解、表面光滑美观、硬度较高的可用于常温保存运输的mirna冻干球制品。


技术实现要素：

6.(一)解决的技术问题
7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法，从而克服活性物质在液体体系中不稳定容易失活等问题，并获得一种对生物活性组分冷冻干燥过程中具有良好保护作用、造型简单、外表光滑美观、硬度高不掉粉、易溶解的冻干球制品。
8.(二)技术方案
9.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种具有修复功能的mirna冻干保护剂，包括寡肽类、氨基酸、透明质酸盐、多糖类和多元醇，所述各成分的质量分数为寡肽类0.1-0.8份、氨基酸1-5份、透明质酸盐0.05-0.1份、多糖类5-20份和多元醇1-5份，所述冻干保护剂混合液的ph值为5-8。
10.优选的，所述寡肽类为三肽-1-铜、乙酰基六肽、乙酰基八肽-1、五肽-3、二肽蛇毒素和五肽-3、棕榈酰五肽-3、棕榈酰三肽-1、棕榈酰六肽-6、棕榈酰三肽-5、六肽-9中的一种或多种。
11.优选的，所述氨基酸为甘氨酸、组氨酸、谷氨酸和精氨酸中的一种或多种。
12.优选的，所述透明质酸盐为酶切水解透明质酸钠。
13.优选的，所述多糖类为麦芽糊精、海藻糖、蔗糖、抗性糊精、麦芽糖、乳糖、麦芽三糖、普鲁多糖、淀粉和纤维素中的一种或多种。
14.优选的，所述多元醇为甘露醇、木糖醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇中的一种或多种。
15.优选的，一种具有修复功能的mirna冻干球制备方法，包括以下步骤：
16.s1.除菌
17.将可以高温的物质高温灭菌处理冷却后加入寡肽、透明质酸和mirna溶解后，溶液充分溶解并混合混匀，保证其流动性，并通过0.25um过滤除菌、制成mirna冻干混合液；
18.s2.冷冻成型
19.利用带0.7mm针头的无菌自动分液器，将上述混合mirna混合液定量注入顶部开孔1mm直径为7-20mm的可以上下分离的冻干球模具中，分液过程中，模具置于液氮深冻环境，以保证与模具接触部分较快冻结，防止溢出影响表面光滑度；
20.s3.分装
21.冷冻1h后，将模具在无菌环境中取出，待温度上升后，打开模具，利用自动分装装盖设备分装至西林瓶中；
22.s4.预冻
23.将分装后的成型冻干球置于冻干机预冻板层上，在-50℃～-70℃预冻1-4h；
24.s5.升华干燥
25.将预冻处理后的冻干球进行升华干燥，升华干燥升温速率在30min升温至-35℃～-20℃，并保持20-36h，真空度保持在0-10pa；
26.s6.解析干燥
27.将升华干燥处理后的冻干球进行解析干燥，解析干燥升温速率为1℃/h,升温至10℃-25℃，保持5-15h，真空度为10-30pa；
28.s7.压盖包装
29.冷冻结束后，在真空环境中充入惰性气体，并在位压塞密封后取出压盖包装。
30.优选的，所述冻干球成品内充入的惰性气体为氮气、二氧化碳中的一种。
31.优选的，所述各类修复成分及保护剂混合液制备的冻干球成品的含水量在1～4％之间。
32.优选的，所述各类修复成分及保护剂混合液制备的冻干球成品，冻干保护剂优化后，核心成分mirna等更加稳定。
33.(三)有益效果
34.本发明提供了一种具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法。具备以下有益效果：
35.1、本发明提供的具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法，通过各类修复成分及保护剂混合液制备的冻干球成品，在经过冻干工艺优化和冻干保护剂优化后，冻干球的表面无裂纹，表面更加光滑，通过寡肽铜离子的蓝色加入，使冻干球的外观呈现光滑蓝色的球体，更加美观、漂亮。
36.2、本发明提供的具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法，通过各类修复成分及保护剂混合液制备的冻干球成品，在经过冻干程序和冻干保护剂的优化后，有更优秀的硬度，不易掉粉、掉屑和劈裂成块，并且可以长期常温储存，可以减少运输成本和延长用户的使用保质期，使用更方便，操作更简单。
37.3、本发明提供的具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法，通过该方法制作的各类化妆品液体产品，均可以通过该方法的冻干工艺和保护剂冻干成固体制剂，操作方法简单，利于扩大化大规模生产，并且各类化妆品的使用成分均可以进行冻干，在干燥成型后，只需要与溶媒溶解后即可以使用，操作非常简单便捷。
38.4、本发明提供的具有修复功能的mirna冻干保护剂及其冻干球制备方法，该方法制备的冻干球解决了mirna产品的稳定性问题，同时在保证产品的功能性物质高活性的情况下，解决了冻干球的水溶性差、硬度和外观光滑度等问题，该方法的制备，对功能性冻干球进行了大量的创造性探索和优化，保证了冻干球产品的功能性、溶解性和较好的外观。
附图说明
39.图1为本发明冻干前后各配方的mirna的ct值变化图；
40.图2为本发明冻干前后各配方的qpcr的ct值变化图。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.实施例1：
43.本发明实施例提供一种具有修复功能的mirna冻干保护剂，包括寡肽类、氨基酸、透明质酸盐、多糖类和多元醇，各成分的质量分数为寡肽类0.1-0.8份、氨基酸1-5份、透明质酸盐0.05-0.1份、多糖类5-20份和多元醇1-5份，冻干保护剂混合液的ph值为5-8。
44.寡肽类为三肽-1-铜、乙酰基六肽、乙酰基八肽-1、五肽-3、二肽蛇毒素和五肽-3、棕榈酰五肽-3、棕榈酰三肽-1、棕榈酰六肽-6、棕榈酰三肽-5、六肽-9中的一种或多种，氨基酸为甘氨酸、组氨酸、谷氨酸和精氨酸中的一种或多种，透明质酸盐为酶切水解透明质酸钠，多糖类为麦芽糊精、海藻糖、蔗糖、抗性糊精、麦芽糖、乳糖、麦芽三糖、普鲁多糖、淀粉和纤维素中的一种或多种，多元醇为甘露醇、木糖醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇中的一种或多种。
45.该具有修复功能的mirna冻干球制备方法，包括以下步骤：
46.s1.除菌
47.将可以高温的物质高温灭菌处理冷却后加入寡肽、透明质酸和mirna溶解后，溶液充分溶解并混合混匀，保证其流动性，并通过0.25um过滤除菌、制成mirna冻干混合液；
48.s2.冷冻成型
49.利用带0.7mm针头的无菌自动分液器，将上述混合mirna混合液定量注入顶部开孔1mm直径为7-20mm的可以上下分离的冻干球模具中，分液过程中，模具置于液氮深冻环境，以保证与模具接触部分较快冻结，防止溢出影响表面光滑度；
50.s3.分装
51.冷冻1h后，将模具在无菌环境中取出，待温度上升后，打开模具，利用自动分装装盖设备分装至西林瓶中；
52.s4.预冻
53.将分装后的成型冻干球置于冻干机预冻板层上，在-50℃～-70℃预冻1-4h；
54.s5.升华干燥
55.将预冻处理后的冻干球进行升华干燥，升华干燥升温速率在30min升温至-35℃～-20℃，并保持20-36h，真空度保持在0-10pa；
56.s6.解析干燥
57.将升华干燥处理后的冻干球进行解析干燥，解析干燥升温速率为1℃/h,升温至10℃-25℃，保持5-15h，真空度为10-30pa；
58.s7.压盖包装
59.冷冻结束后，在真空环境中充入惰性气体，并在位压塞密封后取出压盖包装。
60.冻干球成品内充入的惰性气体为氮气、二氧化碳中的一种，各类修复成分及保护剂混合液制备的冻干球成品的含水量在1～4％之间，各类修复成分及保护剂混合液制备的冻干球成品，冻干保护剂优化后，核心成分mirna等更加稳定。
61.实施例2：
62.冻干保护混合液配置
63.分别配置以下mirna的冻干保护混合液：
64.混合液a：麦芽糊精10份、海藻糖5份、山梨醇2份、甘露醇3份、甘氨酸3份、酶解透明质酸钠0.1份、三肽-1-铜0.2份、乙酰基六肽0.2份；
65.混合液b：麦芽糊精5份、海藻糖10份、山梨醇2份、甘露醇3份、甘氨酸3份、酶解透明质酸钠0.1份、三肽-1-铜0.2份、乙酰基六肽0.2份；
66.混合液c：麦芽糊精5份、海藻糖5份、山梨醇5份、甘露醇5份、甘氨酸3份、酶解透明质酸钠0.2份、三肽-1-铜0.1份、乙酰基六肽0.2份；
67.混合液d：抗性糊精10份、海藻糖5份、山梨醇4份、甘露醇1份、甘氨酸3份、酶解透明质酸钠0.1份、三肽-1-铜0.2份、乙酰基六肽0.2份；
68.混合液e：麦芽糊精10份、海藻糖5份、甘氨酸3份、山梨醇2份、甘露醇2份、高分子透明质酸钠0.1份、乙酰基六肽0.2份；
69.混合液f：麦芽糊精10份、海藻糖4份、甘氨酸3份、山梨醇2份、甘露醇2份、三肽-1-铜0.1份、乙酰基六肽0.2份。
70.实施例3：
71.冻干球的制备与冻干过程：
72.1)保护剂混合液制备：将配方a、b、c、d、e、f各自配出的保护剂物质分别分步溶解和除菌，先将多糖和多元醇高温灭菌处理防止污染，冷却后加入寡肽、透明质酸和核心成分溶解后，溶液充分溶解并混合混匀，保证其流动性，并通过0.25um-0.45um微孔滤膜过滤除菌、制成mirna冻干保护剂混合液a、b、c、d、e、f；
73.2)冻干球成型与分装：将除菌后的冻干保护剂混合液提前在4℃下保温1.5h，然后利用带0.7mm针头的无菌自动分液器，将上述混合mirna冻干保护剂混合液定量注入提前预冷置于液氮深冻环境冻干球模具中，冷冻3h后，将模具在无菌环境中取出，快速冻干球脱模后，利用自动分装装盖设备分装至西林瓶中；
74.3)预冻：分装后的成型冻干球，置于冻干机预冻板层中，设置温度升温至共晶点温度保持2h，随后降温至-65℃预冻3h；
75.4)升华干燥：将预冻处理后的冻干球进行升华干燥，升华干燥升温速率在30min升温至-30℃，保持25h，真空度保持在10pa；
76.5)解析干燥：将升华干燥处理后的冻干球进行解析干燥，解析干燥升温速率为1℃/h，升温至20℃，保持10h，真空度为30pa；
77.6)灌装：真空冷冻干燥结束后，在真空环境中充入惰性气体，并在位压塞密封后取出压盖包装。
78.对比例：
79.1)保护剂混合液制备：目前化妆品的冻干球产品，产品混合液主要是赋形剂，核心成分的保护注重少，或较少有生物活性物质保护，更多的事注重产品的重量和颜色；
80.2)冻干球成型与分装：目前冻干球产品，直径小、加液量较低的冻干球一般使用分液体系，利用液氮成型，可以实现自动分液成型和分装，然而直径超过8mm以上的冻干球制品，主要依靠模具成型方式制作球形或者其他形状，特别是球形，主要依靠半球形成型后，两个半球组合冷冻形成球形，成型和分装更多的需要依靠人工操作，操作复杂，效率较低，难以满足大规模批量化生产需求；
81.3)预冻：分装后的成型冻干球，置于冻干机预冻板层中，设置温度至-65℃预冻3h；
82.4)升华干燥：将预冻处理后的冻干球进行升华干燥，，升华干燥升温速率在30min升温至-40℃，保持40h，真空度保持在10pa；
83.5)解析干燥：将升华干燥处理后的冻干球进行解析干燥，解析干燥升温速率为1℃/h,升温至10℃，保持20h，真空度为30pa；
84.6)灌装：真空冷冻干燥结束后，在真空环境中充入惰性气体，并在位压塞密封后取出压盖包装。
85.上述工艺中，存在以下问题：
86.第一，在成型过程中主要依靠手动合成冻干球，操作时间长，易导致冻干球在此过程中融化、或者升温过高超过共晶点温度，使得玻璃态状态变化使得活性mirna或其他活性物质失活，同时融化导致产品形状变形、人工带入微生物污染等问题，而且该方法效率较低，无法满足大规模生产需求；
87.第二，预冻过程简单，没有经过预冷和共晶点温度升温在降温的预冻过程，经试验
表明，通过4℃预冷在低温成型、预冻前升温至共晶点温度保持2h后在降温预冻的过程会使得预冻更均匀，冻干后的产品表面光滑、而直接预冻冻干产品易萎缩、开裂和表面起皮褶皱；
88.第三，冻干程序温度设置表面，测试共晶点温度、玻璃态转化温度tg以及崩解温度tc，有利于设定冻干程序，减少冻干时间提高冻干效率。
89.实施例4：
90.冻干球的外观测试
91.将冻干完成后的配方a、b、c、d、e、f制作的冻干球，进行表观检测，检测指标包括冻干球的球体完整度、表面光泽度、球体裂纹、冻干球色泽表现以及球体颜色与均匀度，测试主要通过肉眼观察记录，测试结果如下表1：
92.表1冻干球的外观测试结果
[0093][0094]
上表结果表明，配方a、d、e三个配方的制作的冻干球的外形美观，颜色明亮，冻干球的完整度较高。
[0095]
冻干球的脆碎度测试
[0096]
将冻干完成后的配方a、b、c、d、e、f制作的冻干球。进行脆碎度检测，为了检测冻干
球的配方对于冻干后成品的运输过程中是否能够保持优秀的外观，测试方法采用滚轮法进行测试，具体为：将冻干球10颗进行精确称重后放入脆碎度测试仪测试滚轮中，测试滚轮尺寸为直径为289mm，厚度为34mm，25转/分钟，测试4分钟。滚轮测试结束后，观察冻干球的形态和完整性并测量冻干球的重量，测试结果如下表2：
[0097]
表2冻干球的脆碎度测试结果
[0098][0099]
上表结果表明，上述配方中，大部分的配方均具有较高的机械强度，在经过机械里的作用下，保持了较好的完整度，其中a、d、e、f均表现优秀,表明上述配方的冻干球在产品中，足以抵抗运输使用等过程中的外力作用，减少因外力破损掉粉的可能性，时较好的冻干保护剂和赋形剂选择。
[0100]
冻干球的溶解性测试
[0101]
将冻干完成后的配方a、b、c、d、e、f制作的冻干球，进行溶解速度检测，为了对比不同配方的冻干球的对于冻干后成品的水溶性和溶解速度影响，并选择最优的配方，测试方法为：将5ml无菌水加入至冻干球西林瓶中，并开始计时，在不进行任何震荡条件下，测试冻干球静置于水溶液中的完全崩解时间和完全溶解时间，测试结果如下表3：
[0102]
表3冻干球的溶解性测试结果
[0103]
qpcr)，比较qpcr的ct值来作为mirna的量。
[0114]
mirna冻干球冻干后活性测试：将冻干混合液a、b、c、d、e、f配方物质，多糖和多元醇溶解混匀后灭菌处理，冷却后加入氨基酸、透明质酸和寡肽混匀后加入mirna低温下充分混匀，并微孔过滤后进行冻干球成型，成型分装后，采用低温预冻升温共晶点在降温的方式预冻，并进行真空冷冻干燥，通过一次升华干燥和解析干燥后，充入惰性气体封盖包装。冻干前将各配方进行mirna的ct值测试，干燥后同样方法进行ct值检测，对比其变化来确定mirna的冻干损伤程度，ct值越高，表明mirna的量越少。
[0115]
测试结果如附图1所示，结果表明，保护剂配方a、e、f对于mirna的保护效果比较明显，冻干前后的ct值变化较小。
[0116]
mirna冻干球产品稳定性测试：将干燥后的冻干球产品置于45℃相对湿度75％条件下进行保存期的加速实验，保存6个月进行稳定性实验，保存期到后，采用mirna的茎环法
‑‑
qpcr方法测定ct值来评价稳定性。
[0117]
测试结果如附图2所示，结果表明，冻干后的mirna在常温下比较稳定，干燥环境下，保存的稳定性较好，在产品的水分和水活度较低情况下，具有较好的稳定性。
[0118]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。