一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备抑制糖尿病视网膜病变药物中的用途

1.本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备抑制糖尿病视网膜病变药物中的用途。


背景技术：

2.糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,dr)是最常见的糖尿病微血管并发症之一，是目前成人视力残疾和失明的主要原因。其发病机制主要与糖尿病持续高血糖导致的局部慢性炎症、氧化自由基产物堆积和组织缺氧有关。dr的病理特征主要包括血管内皮细胞的进行性丧失和血管间连接的缓慢溶解，导致血管渗漏和视网膜水肿，晚期进展为炎症细胞浸润、组织破坏和新生血管形成。血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,brb)完整性丧失是dr疾病进展的关键环节，而视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)和炎症因子的升高是导致brb破坏和血管病理性新生的重要因素，目前临床上主要采取玻璃体腔注射糖皮质激素和抗vegf药物的手段治疗dr，且疗效较好。但反复注射抗vegf药物和糖皮质激素也有一定的副作用和局限性，抗vegf药物耐药是dr治疗失败的主要原因之一，而长期使用抗vegf药物还可能导致神经元毒性和潜在的地图样萎缩；糖皮质激素的过度使用可能导致白内障发病率增加和眼压升高等。


技术实现要素：

3.本发明为了解决上述技术问题，提供了一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备糖尿病视网膜病变药物中的用途。
4.一方面，本发明提供了一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备抑制糖尿病视网膜病变药物中的用途，所述的多肽修饰的金纳米颗粒是序列如seq id no:1所示的多肽修饰的金纳米颗粒。
5.进一步的，糖尿病视网膜病变的疾病动物模型包括链脲佐菌素模型和氧诱导视网膜病变模型。
6.进一步的，所述抑制糖尿病视网膜病变包括抑制视网膜乏血管低氧造成的血管新生、抑制视网膜血管渗漏、抑制视网膜炎症中的一个或多个方面。
7.另一方面，本发明提供了一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备抑制视网膜乏血管低氧造成的血管新生的药物中的用途，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如seq id no:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。
8.第三方面，本发明提供了一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备抑制视网膜血管渗漏的药物中的用途，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如seq id no:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。
9.进一步的，所述抑制视网膜血管渗漏包括抑制视网膜周皮细胞丢失。
10.第四方面，本发明提供了一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备抑制视网膜炎症的药
物中的用途，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如seq id no:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。
11.进一步的，所述抑制视网膜炎症包括抑制内皮细胞炎症反应、减少炎症细胞向内皮细胞趋化黏附以及防止炎症细胞损伤内皮细胞中的一个或多个方面。
12.第五方面，本发明提供了一种多肽修饰的金纳米颗粒在制备在炎症环境下保护内皮细胞的体外试剂中的用途，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如seq id no:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。
13.第六方面，本发明提供了一种抑制糖尿病视网膜病变的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包含序列如seq id no:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。
14.本发明通过体外实验证明，多肽修饰的金纳米颗粒能抑制内皮细胞的炎症因子表达和炎症细胞对内皮细胞的黏附；进一步，本发明通过小鼠实验证明在糖尿病视网膜病变的链脲佐菌素(streptozotocin,stz)模型和氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,oir)模型中，通过玻璃体腔注射多肽修饰的金纳米颗粒能抑制糖尿病视网膜病变相关模型中的视网膜炎症、血管渗漏和病理性血管新生，对糖尿病导致的视网膜血管损伤起到保护作用，为糖尿病视网膜病变的治疗提供了新的方向。同时，本发明运用的多肽修饰的金纳米颗粒获取方便，制作过程简单，已有较完善的合成方法，且便于保存，稳定性好，尚无在眼内应用的报道，创新性强。综上，本发明提供的抑制糖尿病视网膜病变的方法具有较好的临床转化前景和应用价值。
附图说明
15.图1是本发明中的p12抑制内皮细胞的炎症因子表达和炎症细胞对内皮细胞的黏附的结果图；其中，a：p12干预能显著下降huvec(人脐静脉内皮细胞，human umbilical vein endothelial cells)在tnfα刺激下细胞黏附因子的表达水平的统计图；b:实施例2中黏附在内皮细胞上染色的单核细胞的变化图，比例尺＝20um，可以看出p12干预能显著抑制tnfα刺激导致的huvec与单核细胞的黏附；c：图1b统计结果图，图中各组数值为该组细胞数与ctrl(对照)组细胞数比值；
16.图2是本发明中玻璃体腔注射p12对oir模型中的病理性血管新生以及血管渗漏的影响图；其中，a：凝集素染料isolectin b4标记血管显示p12治疗组与对照组视网膜新生血管面积和无血管区面积的变化图；b-c：图2a新生血管面积和无血管区面积的统计结果图；d：视网膜大体拍照：p12治疗组与对照组视网膜血岛面积的变化图；e：图2d统计结果图；f：p12治疗组较对照组视网膜dextran染料渗漏面积明显减少的变化图，比例尺＝500um；g：图2f统计结果图；h:ter119标记红细胞显示p12治疗组较对照组视网膜红细胞渗漏面积明显减少的变化图，比例尺＝500um；i：图2h统计结果图；
17.图3是本发明中玻璃体腔注射p12对oir模型中视网膜炎性细胞浸润和炎症因子表达的影响图；其中，a：p12治疗组视网膜f4/80
+
标记的细胞数量较对照组明显减少的变化图，比例尺＝500um；b：图3a的统计结果图；c：视网膜炎症因子il-1β、il-6、icam-1、vcam-1、mcp-1的mrna表达水平统计结果图，p12治疗组较对照组各炎症因子的mrna表达水平明显降低；
18.图4是本发明中玻璃体腔注射p12对24周stz模型中视网膜渗漏、周细胞丢失和视
网膜炎症因子表达的影响图；其中，a:视网膜渗漏指数的结果图，p12治疗组较对照组明显下降；b:视网膜dextran染料渗漏区域的变化图，比例尺＝500um，p12治疗组较对照组dextran染料渗漏区域(灰白色)减少；c:视网膜毛细血管周细胞丢失的变化图，p12治疗组较对照组减少；d:视网膜炎症因子il-1β、il-6、icam-1、vcam-1、mcp-1的mrna表达水平统计结果图，p12治疗组较对照组各炎症因子的mrna表达水平明显降低。
具体实施方式
19.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
20.本发明中所述序列如seq id no:1所示的多肽修饰的金纳米颗粒代号为p12，其中seq id no:1为cys leu pro phe phe asp。
21.实施例1 p12的制备
22.金纳米粒子的合成是采用柠檬酸钠还原氯金酸方法，具体操作方法如下：
23.(1)制备金纳米颗粒：将柠檬酸钠溶液(2ml,38.8mm)加入煮沸的haucl4溶液(20ml,1.0mm)中，搅拌煮沸10min，冷却至室温，得到直径约13nm的金纳米颗粒悬液，室温保存。
24.(2)合成p12：将合成好的多肽(氨基酸序列为clpffd)溶解于去内毒素的超纯水中，浓度为1mm，同时将制备好的金纳米颗粒悬液浓度调整至11nm，二者按多肽与金纳米颗粒体积比1：10混合，避光保存，24小时后用0.22μm滤器过滤除菌，离心14000rpm，30min，无菌pbs清洗3次，去除未结合肽段，用相应溶液重悬至所需浓度备用。
25.实施例2体外实验p12能显著抑制内皮细胞的黏附因子表达和炎症细胞对内皮细胞的黏附
26.视网膜血管内皮细胞在炎症、受损条件下会释放黏附分子如细胞间黏附分子-1(intracellular cell adhesion molecule-1，icam-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，vcam-1)和e-选择素(e-selectin)等，促进炎症细胞趋化渗出并聚集于受损血管周围，进一步加重血管内皮损伤。
27.为了观察p12在血管内皮细胞中的作用，从胎盘脐静脉分离得到人原代脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,huvec)，分离方法如下：
28.(1)超净台内将脐带倒进高压灭菌过的大平底皿中，找到一端的脐静脉并将鲁尔接头插入其中，尼龙扎带扎紧固定，连接装有1
×
hepes缓冲液的注射器，用1
×
hepes缓冲液冲洗，直至液体清亮或血液和凝块完全冲出；
29.(2)注射器中加入胰酶，脐带一端用注射器连接封闭，另一端封闭，随后将胰酶缓缓注入脐带直至充盈；烧杯内37℃孵育脐带7-8分钟；无菌纱布包裹并轻揉按摩脐带2-3分钟，反复抽吸脐带内胰酶1-2次，加速内皮细胞脱落；将注射器中的胰酶小心灌入10ml含20％血清培养基的50ml离心管中，随后用培养基反复冲洗脐带；
30.(3)抽出冲洗液，离心，1100rpm，5分钟；弃去上清，用3ml培养基重悬细胞沉淀；将细胞悬液均匀的滴入已包被过i型胶原的10cm培养皿中，37℃孵箱培养，约6-8小时后换液；待细胞融合度达到90％以上时按1:3比例传代，到p2时冻存备用。
31.在huvec中给予肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,tnfα，10ng/ml，arco公司)刺激，并予以实施例1中制备得到的p12(5nm)干预，检测内皮细胞中黏附分子
icam-1、vcam-1和e-selectin的mrna表达水平，引物序列由5’端到3’端为：
32.seq no.2:icam1上游引物:tcttcctcggccttcccata；
33.seq no.3:icam1下游引物:aggtaccatggccccaaatg；
34.seq no.4:vcam1上游引物:taacggggagctacagcc；
35.seq no.5:vcam1下游引物:cagcctggttaattccttcac；
36.seq no.6:e-selectin上游引物:ggcagtggacacagcaaatc；
37.seq no.7:e-selectin下游引物:tggacagcatcgcatctca。
38.实验分为对照组、p12组、tnfα组和tnfα+p12组，结果发现tnfα+p12组相较tnfα组黏附分子表达水平明显下降(图1a)。
39.同时通过单核细胞黏附实验检测在p12干预组和非干预组中人脐静脉内皮细胞趋化炎症细胞黏附的能力，通过bcecf荧光染料标记thp-1细胞(人单核细胞白血病细胞，天津医科大学总医院神经研究所赠予)，并用tnfα/p12处理人脐静脉内皮细胞3h，随后在人脐静脉内皮细胞培养基(ecgm基础培养基+2％fbs，biotech公司)中加入thp-1细胞(1
×
10^6个/孔)，共同培养3h后弃去培养基，pbs洗去未黏附细胞，4％多聚甲醛固定，显微镜下观察并统计黏附在人脐静脉内皮细胞上的单核细胞数量。结果发现tnfα+p12组较tnfα组黏附单核细胞数量明显减少(图1b，图1c)。这说明p12在炎症环境下能起到保护内皮细胞的作用，能抑制内皮细胞炎症反应，并减少炎症细胞向内皮细胞趋化黏附，防止炎症细胞损伤内皮细胞的作用。
40.实施例3体内实验p12能有效抑制糖尿病视网膜病变
41.为了进一步验证p12在体内对于糖尿病视网膜病变的治疗效果，使用实施例1中制备得到的p12在两种动物疾病模型中进行体内实验。
42.在糖尿病视网膜病变对应的两种动物疾病模型—链脲佐菌素(streptozotocin,stz)模型和氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,oir)模型中：玻璃体腔注射p12对糖尿病导致的视网膜血管损伤起到保护作用，能抑制糖尿病视网膜病变模型中的视网膜炎症、血管渗漏和病理性血管新生。
43.一、氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,oir)模型
44.构建oir小鼠模型：将7日龄(p7)乳鼠与其哺乳鼠共同放入高氧(75％氧)的氧舱中，使其连续处于高氧环境5天，并将乳鼠于第12日龄(p12)放回正常氧气环境(21％氧)中，出舱后第二天即第14日龄(p14)，对乳鼠进行玻璃体腔注射p12(500nm，0.5ul)，或同体积pbs作为对照组。
45.a)p12在减少oir模型中视网膜乏血管低氧造成的血管新生中的作用
46.1.实验方法
47.于第十七日龄(p17)取小鼠眼球，剥取视网膜，进行视网膜铺片免疫荧光染色，用凝集素染料isolectin b4标记血管内皮，观察视网膜新生血管及血管回退情况。
48.2.实验结果
49.发现在oir小鼠中，p12治疗组的视网膜新生血管面积和无血管区面积均较对照组明显减少(图2a，图2b)，提示p12可减轻oir模型中视网膜乏血管低氧造成的血管新生。
50.b)p12在减少oir模型中视网膜血管渗漏中的作用
51.新生血管是糖尿病视网膜病变在增殖期的重要特点之一，病理性的新生血管无正
常血管屏障功能且易渗漏出血，表现为小分子物质的渗出和红细胞的漏出。视网膜出血渗漏会严重损害视网膜结构和功能，加重视网膜组织缺氧和局部炎症产物的堆积。
52.1.实验方法
53.于p17取小鼠眼球，剥取视网膜，拍照观察视网膜大体相中出血面积(即血岛面积＝视网膜大体相中出血面积/视网膜总面积
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100％)；为观察oir小鼠视网膜血管渗漏情况，通过心脏注射荧光染料fitc-dextran(分子量为70kda)，循环10min后取视网膜，进行视网膜铺片免疫荧光染色，isolectin b4标记血管，观察视网膜中漏出血管外的fitc-dextran面积；另外利用ter119(红细胞单克隆抗体)标记红细胞，与isolectin b4共染，观察渗漏出视网膜血管外的红细胞面积。
54.2.实验结果
55.我们发现p12治疗组小鼠视网膜血岛面积较对照组明显减少(图2c)，同时p12治疗组较对照组视网膜血管外fitc-dextran和红细胞面积均明显减少(图2d,e)，提示p12可减少oir模型中的视网膜血管渗漏。
56.c)p12在抑制oir模型中视网膜炎症中的作用
57.血管功能障碍和新生血管会导致炎症的发生，同时炎症也会进一步促进病理性视网膜血管新生。
58.为观察p12对oir小鼠视网膜炎症细胞浸润的作用，我们对17日龄的oir小鼠视网膜进行视网膜铺片免疫荧光染色，并通过f4/80
+
标记巨噬细胞和激活的小胶质细胞，观察视网膜炎性细胞浸润计数情况。
59.结果发现p12治疗组视网膜f4/80
+
数量较对照组明显减少，即巨噬细胞数和激活的小胶质细胞数量减少(图3a,图3b)。
60.同时通过qrt-pcr检测了pbs组和p12组oir小鼠视网膜的炎症因子il-1β、il-6、icam-1、vcam-1、mcp-1mrna水平，引物序列由5’端到3’端为：
61.seq no.8:il1-β上游引物:gcaactgttcctgaactcaact；
62.seq no.9:il1-β下游引物:atcttttggggtccgtcaact；
63.seq no.10:il-6上游引物:ccaagaggtgagtgcttccc；
64.seq no.11:il-6下游引物:ctgttgttcagactctctccct；
65.seq no.12:icam-1上游引物:gtgatgctcaggtatccatcca；
66.seq no.13:icam-1下游引物:cacagttctcaaagcacagcg；
67.seq no.14:vcam-1上游引物:agttggggattcggttgttct；
68.seq no.15:vcam-1下游引物:cccctcattccttaccaccc；
69.seq no.16:mcp-1上游引物:ttaaaaacctggatcggaaccaa；
70.seq no.17:mcp-1下游引物:gcattagcttcagatttacgggt。
71.结果发现相较对照组，p12治疗组视网膜中il-1β、il-6、icam-1、vcam-1、mcp-1水平均明显下降(图3c)。以上结果说明p12能减轻oir小鼠视网膜炎症反应，减少炎症因子和炎性细胞对视网膜血管的损伤。
72.二、链脲佐菌素(streptozotocin,stz)模型
73.构建stz小鼠模型：通过腹腔注射链脲佐菌素(150mg/kg，1次)破坏胰岛b细胞诱发小鼠糖尿病，于注射后1周检测小鼠尾血血糖，随机血糖≥16.8mmol/l时造模成功，随后予
以玻璃体腔注射p12或pbs(500nm,1ul,给药时间为stz腹腔注射后1周即成模当天、成模后4周、20周，共三次)，并于成模后24周取材观察p12对stz诱导的糖尿病小鼠模型中视网膜病变的作用。
74.a)p12在减少stz模型中视网膜血管渗漏中的作用
75.1.实验方法
76.向stz小鼠的心脏注射小分子量fitc-dextran(3kd)，循环15min后取自体血200-300ul,随后pbs全身灌流去除血管内残留fitc-dextran；取其中一眼进行视网膜渗漏指数检测：取视网膜于ep管中，称重，加入100ul pbs研磨制成匀浆；自体血离心10000g*10min，取上层血清。将以上样品加入96孔板，酶标仪检测视网膜及血清中荧光强度，计算视网膜渗漏指数，计算方法如下：
[0077][0078]
另一眼4％pfa室温固定2h后，直接剥取视网膜铺片显微镜拍照，观察从血管渗漏并残留在视网膜上的dextran区域大小。
[0079]
2.实验结果
[0080]
结果发现在糖尿病24周的小鼠中，p12治疗组视网膜渗漏指数较对照组明显下降(图4a)；相应的，视网膜铺片中dextran的渗漏区域面积也较对照组减少(图4b)。
[0081]
b)p12在减少stz模型中视网膜周皮细胞丢失中的作用
[0082]
周皮细胞异常和丢失会导致视网膜血管渗漏、闭塞和新生血管形成，将stz小鼠视网膜进行视网膜铺片免疫荧光染色，用结蛋白(desmin)标记周皮细胞，cd31标记血管内皮，两者共染，观察毛细血管周皮细胞覆盖情况，发现p12治疗组血管周皮细胞覆盖率高于对照组，提示p12治疗能抑制糖尿病视网膜病变导致的周皮细胞丢失(图4c)。
[0083]
c)p12在抑制stz模型中视网膜炎症的作用
[0084]
通过qrt-pcr检测注射pbs组和p12组糖尿病24周小鼠视网膜炎症因子il-1β、il-6、icam-1、vcam-1、mcp-1mrna表达水平，引物序列与氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,oir)模型中用于检测相应视网膜炎症因子的引物序列相同。结果发现p12治疗组较对照组视网膜炎症因子il-1β、il-6、icam-1、vcam-1、mcp-1表达水平明显降低(图4d)。
[0085]
以上结果说明在p12能改善stz模型小鼠视网膜的血管渗漏和周皮细胞丢失，抑制视网膜炎症因子表达。
[0086]
综上，p12能抑制内皮细胞的炎症因子表达和炎症细胞对内皮细胞的黏附，玻璃体腔注射p12能抑制糖尿病视网膜病变相关模型中的视网膜炎症、血管渗漏和病理性血管新生，对糖尿病导致的视网膜血管损伤起到保护作用，为糖尿病视网膜病变的治疗提供了新的方向。
[0087]
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。