自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法和装置

1.本发明涉及医学成像技术领域，尤其涉及一种自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法和装置。


背景技术：

2.目前，大规模神经活动记录方式主要包括在限制小动物的运动状态下进行高密度脑电图（electroencephalography，eeg）和功能核磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fmri）等。其中，脑电图eeg通过将电极固定在生物头皮上，用于采集群体神经元活动传导到头皮的电信号，这样的电信号微弱、容易被干扰且空间分辨率低下；功能磁共振成像fmri利用磁振造影来测量神经元活动所引起的脑部血流改变间接的反应神经元的活动，其采样率和获得数据的时间分辨率均很低。其他神经元成像技术中，还包括将生物体受限于固定的显微镜下无法自由活动，采用大范围颅骨切开术将颅骨替换为透明玻璃、将头骨磨薄或化学法透明化等手术方式对整个大脑皮层表面进行成像。前述记录神经元活动的方式需要限制生物体的自由活动，且手术过程复杂且具有极高颅内感染风险，同时还存在因颅骨生长增厚或化学透明试剂的丢失，从而无法保障对神经元进行长期稳定的监测。


技术实现要素：

3.本发明实施例提供一种自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法和装置，以解决记录神经元活动的方式需要限制生物体的自由活动，且手术过程复杂且具有感染风险，同时还存在因颅骨生长增厚或化学透明试剂的丢失，从而无法保障对神经元进行长期稳定的监测的问题。
4.一种自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，包括：在小动物颅骨上方构建无创颅骨视窗，将液体螯合剂和颅骨透明填充液体渗透进入小动物的无创完整颅骨中；在小动物的颅骨上固定一底座，底座上承载一微型显微镜，微型显微镜包括用于发送蓝光的激发光模块和用于成像的图像传感器芯片，在微型显微镜的发射光模块的出口端另外设置与待检测荧光匹配的长通滤光片；结合环境摄像头和微型显微镜，实时对自由移动的小动物的颅骨下荧光信号进行成像，形成动物行为和全皮层尺度下微弱的荧光信号的实时且同步的监测；图像传感器芯片捕获颅骨下荧光信号的变化，并转变成电信号后，通过微型线缆将电信号传输给监测端，实时监测颅骨下荧光信号的荧光变化情况。
5.进一步地，在小动物颅骨上方构建无创颅骨视窗，包括：将微型显微镜设置在小动物的颅骨中线位置，以便在图像传感器芯片上形成可获取小动物完整颅骨下视窗。
6.进一步地，在将液体螯合剂和颅骨透明填充液体渗透进入小动物的无创完整颅骨
中之前，还包括：裸露颅表皮肤的部分表皮并清理，用于留置出用于渗透液体螯合剂和颅骨透明填充液体的渗透位置。
7.进一步地，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，还包括：通过环境摄像头监测与实时荧光变化情况实时对应的小动物自由行为，形成自由移动影像；基于自由移动影像和实时荧光变化情况，对小动物进行神经行为的信号同步记录分析。
8.进一步地，图像传感器芯片捕获颅骨下荧光信号的变化，并转变成电信号后，通过微型线缆将电信号传输给监测端，实时监测颅骨下荧光信号的荧光变化情况，包括：图像传感器芯片将颅骨下荧光信号转化为电信号，并通过微型线缆将电信号发送给监测端，用于基于电信号实现小动物介观尺度皮层的荧光信号和动物自由行为的实时线上监测。
9.进一步地，液体螯合剂为浓度为8%~11%的乙二醇双四乙酸或四乙酸。
10.进一步地，在发射光模块的出口端另外设置与待检测荧光匹配的长通滤光片之前，还包括：根据颅骨下荧光信号的荧光波长，确定不同中心波长的长通滤光片。
11.进一步地，图像传感器芯片捕获颅骨下荧光信号的变化，包括：持续提取颅骨下荧光信号，包括：全皮层尺度微弱的荧光信号和各皮层脑区之间的活动关联；基于颅骨下荧光信号的变化，形成单个脑区和皮层介观尺度的荧光信号的强弱时序变化曲线图。
12.进一步地，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，还包括：按预设时间间隔，通过微型显微镜采集颅内多个脑区对应的时序荧光信号亮度；实时监测不同脑区的时序荧光信号亮度和动物自由行为，生成皮层连接关系图谱，绘制在动物自由行为的状态下不同脑区的荧光变化分布图。
13.一种自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测装置，包括：微型显微镜、监测端，以及用以连接微型显微镜和监测端用于传输颅骨下荧光信号的微型线缆；其中，微型显微镜的激发光的出口端设置有用于分离激发光和发射光的长通滤光片，自由移动小动物无创颅骨下荧光成像实时监测装置实现前述的自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法。
14.上述自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法和装置，通过将液体螯合剂渗入无创完整颅骨中，避免传统需开颅进行监测荧光的方式，给小动物的颅骨顶上的发射光模块的出口端放置长通滤光片的微型显微镜，可保障小动物的自由移动的同时，无需进行绿光矫正，在进行荧光成像时及过滤掉杂质反射光，提高信噪比，过滤系统光源或大量反射光造成的噪音，显著地提高信号特异性，避免了传统开颅检测方案中过强的反射光，造成的包括视觉皮层的皮层大量脑区，荧光信号变化无法直接实时监测，且在线下分析中也无法有效提取，造成皮层信号丢失的风险；避免全皮层尺度的颅骨移除完成的感染风险和手术挑战。长期以来，完整颅骨下微弱荧光信号的应用，一直局限于受限的或固定动物的实验方案和设置。本技术的操作方式简单，仪器成像不需损伤自由移动小动物的颅骨，实现了小动
物在自由运动下全皮层尺度的颅骨下荧光信号和动物自由行为的长期稳定、清晰的且无感染风险的同步且实时的监测。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1绘示本发明一实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法的监测环境示意图；图2绘示本发明第一实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法的第一流程图；图3绘示本发明第一实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法中微型显微镜的结构示意图；图4绘示本发明第二实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法的第二流程图；图5绘示本发明第一实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法中小动物在自由移动下全皮尺度荧光信号采集环境图；图6绘示本发明第一实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法中小鼠右侧鼻子相关的脑区在自由移动时荧光信号强度变化曲线图；图7绘示本发明第一实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法中采用本技术提供的荧光成像实时监测装置拍摄的颅骨下荧光信号对比图；图8绘示本发明第一实施例中自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法中六个月的颅内荧光信号的荧光变化稳定采集变化图。
17.附图标号说明：1、自由移动的小动物；2、微型显微镜；3、直径《1mm且50欧的微型线缆；4、监测端；4、圆锥形镜体；5、蓝色带通滤光片；6、绿色或红色的525nm带通滤光片；7、图像传感器芯片；8、与待检测荧光匹配的长通滤光片；9、完整的小动物颅骨；10、平凸透镜。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.在动物进化的历程中，进化程度越高的物种，其适应周围环境的能力越强。高等动物能对周围环境的变化迅速做出反应，得益于它们发达的神经系统。神经系统中负责信号传递和处理的一类神经细胞叫做神经元。高等动物的智能水平，取决于其体内神经元的数量多少和神经元相互连接的复杂度。低等动物如水螅，其体内仅有数百个神经元，相互连接组成了简单的神经网。
20.意识是动物感知到的使其大脑发生思想活动的思想内容。不同种类的动物具有的神经元的数量明显不同，同类动物具有的神经元的数量也存在一定的差异，可以说几乎每一个动物具有的神经元数量都不尽相同，因此动物个体的意识的数量跟它的大脑中的神经元数量有关，这也正是使不同的动物之间的思想活动及其对应的行为出现数量上的差异的原因。
21.小鼠大脑约有7100万个神经元。随着脑科学研究的发展，越来越多的研究表明：单一行为背后往往有多个脑区的众多神经元协同编码。因此迫切的需求大规模光学成像技术的新工具和新方法，去解析小动物在自由行为下，皮层尺度的神经元活动状态和行为学之间的关联。
22.而现有记录神经元活动的方式需要固定小动物来限制生物体的自由活动，且手术过程复杂且具有感染风险，同时还存在因颅骨生长增厚或化学透明试剂的丢失，从而无法保障对神经元进行长期稳定的监测。基于如此现状，本技术提出一种实施例，在如图1所示的实验环境下，提供一种自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，如图2所示，具体包括如下步骤：s10.在小动物颅骨上方构建稳定持久且无创的颅骨视窗，将液体螯合剂和颅骨透明填充液体渗透进入小动物的无创完整颅骨中，形成持久稳定的颅骨视窗。
23.具体地，液体螯合剂用于在不打开颅骨的情况下螯合颅骨中的钙离子。其中，螯合作用(chelation)指金属离子以配位键与同一分子中的两个或更多的配位原子（非金属）连结而形成含有金属离子的杂环结构（螯环）的一种作用。螯环的形成使螯合物比组成和结构相近的非螯合络合物具有更大的稳定性和通透性。
24.钙离子在很多生理活动中都发挥着重要作用，除了在肌肉细胞收缩中扮演着重要角色，钙离子也是神经元活动的重要“风向标”之一：当神经元膜电位发生去极化，产生的动作电位传导到神经元轴突末梢时，细胞膜上的电压门控钙离子通道打开，大量钙离子内流，包含神经递质的囊泡由突触前膜释放至后膜，下游神经元就得以接收到上游的信号。因此，钙离子成像可以追踪神经元动作电位，从而帮助了解神经元集群的活动，用于感知觉，学习记忆，社会性行为等各种各样的研究中。
25.进一步地，手术过程中移除头皮后，采用颅骨透明填充液体，比如502胶水或者牙科水泥，可填补颅骨孔隙，防止颅骨水分蒸发，提升头皮移除后颅骨光学通透性。颅骨上有空洞，平时里面是生理液体，打开头皮后会蒸发使得颅骨变得不透明。采用颅骨透明填充液体可填补空洞，就能让颅骨再次透明，同时也能起到防止水分蒸发让颅骨重新透明的作用。比如，若添加502胶水，需等颅骨干燥后滴加，固定后就形成薄薄的镜面，可形成用于成像的稳定视窗。液体螯合剂和颅骨透明填充液体使得颅骨再次透明，同时，阻止颅骨水分的蒸发，在完整颅骨上方构建成长期稳定的视窗。
26.本实施例对小动物无颅内感染的风险，同时增加颅骨透明度、稳定性并通过牙科水泥或502等长期维持颅骨的透过率，保持颅骨的长期可监测性。
27.s20.在小动物的颅骨上固定一底座，底座上承载一微型显微镜，微型显微镜包括用于发送蓝光的激发光模块和用于成像的图像传感器芯片，在发射光模块的出口端另外设置与待检测荧光匹配的长通滤光片。
28.具体地，在小动物的颅表皮肤上固定底座，通过微型显微镜成像小动物自由移动
时颅骨下微弱的荧光信号，微型显微镜包括用于发送蓝光的激发光模块和用于成像的图像传感器芯片，在发射光模块的出口端另外设置与待检测荧光匹配的长通滤光片，用于滤除小动物的颅骨过强的杂质反射光，提升颅骨下微弱荧光信号的信噪比实现动物自由移动下皮层介观水平神经活动的实时监测。
29.本实施例在小动物颅骨上固定了一个小而轻的基板，做监测的时候，把微型显微镜卡到该基板上。实验后，可将微型显微镜卡从基板上取下，减轻小动物的移动负重。
30.现有成像设备未装设长通滤光片，导致整体非特异性荧光亮度高，其成像结果中激发光的反射极强，在小动物自由行为时，脑区的实时荧光信号很难直接观测。
31.本实施例通过微型显微镜上发射蓝光，如图3所示，透过完整颅骨下视窗对自由移动下的小动物皮层浅层荧光蛋白或分子激发，并通过在传统的长通滤光片，比如et525/50nm，的前方额外添加长通滤光片，比如et500lp或者jb510等，用于滤除视野中过强的反射激发光，提升颅骨下待检测荧光信号的信噪比，提高透过完整颅骨的微弱的荧光信号的特异性。待检测荧光对应的蓝光或其他波长激发光，滤光用与待检测荧光匹配的长通滤光片，如绿色长通滤光片。本实施例也适应其他颜色的荧光检测，只需替换激发光和滤光片。
32.s30.结合环境摄像头和微型显微镜，实时对自由移动的小动物的颅骨下荧光信号进行成像，形成动物行为和全皮层尺度下微弱的荧光信号的实时且同步的监测。
33.s40.图像传感器芯片捕获颅骨下荧光信号的变化，并转变成电信号后，通过微型线缆将电信号传输给监测端，实时监测颅骨下荧光信号的荧光变化情况。
34.具体地，全皮层视窗长期稳定可视化，结合小质量，约3克的微型显微镜，在实验期间固定在颅骨上方，长期稳定进行全皮层尺度厘米级的荧光信号实时成像技术。
35.通过滤光片分离激发光和发射光，用于滤除激光反射光后，将小动物在移动状态下的钙荧光信号在图像传感器芯片的表面，比如钙信号进行荧光成像，形成颅骨下荧光信号。
36.本实施例提供的自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，通过将液体螯合剂渗入无创完整颅骨中，避免传统需开颅进行监测荧光的方式，给小动物的颅骨顶上的发射光模块的出口端放置长通滤光片的微型显微镜，可保障小动物的自由移动的同时，无需进行绿光矫正，在进行荧光成像时及过滤掉杂质反射光，提高信噪比，过滤系统光源或大量反射光造成的噪音，显著地提高信号特异性，避免了传统开颅检测方案中过强的反射光，造成的皮层大量脑区，比如视觉皮层，荧光信号变化无法直接实时监测，且在线下分析中也无法有效提取，造成皮层信号丢失的风险。避免全皮层尺度的颅骨移除完成的感染风险和手术挑战。长期以来，完整颅骨下微弱荧光信号的应用，一直局限于受限的或固定动物的实验方案和设置。本技术的操作方式简单，仪器成像不需损伤自由移动小动物的颅骨，实现了小动物在自由运动下全皮层尺度的颅骨下荧光信号和动物自由行为的长期稳定、清晰的且无感染风险的同步且实时的监测。
37.在一具体实施例中，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法还具体包括如下步骤：将微型显微镜设置在小动物的颅骨中线位置，以便在图像传感器芯片上形成可获取小动物完整颅骨下视窗。
38.具体地，颅骨中线位置也即在完整颅骨上方，在动物自由移动的情况下，通过微型
显微镜实时监测动物行为和各皮层脑区清晰的荧光信号的变化，成像分辨率在50-150微米。
39.在一具体实施例中，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，在步骤s10之前，即在将液体螯合剂和颅骨透明填充液体渗透进入小动物的无创完整颅骨中之前，还具体包括如下步骤：裸露颅表皮肤的部分表皮并清理，用于留置出用于渗透液体螯合剂和颅骨透明填充液体的渗透位置。在完整颅骨上形成长期稳定透明视窗，用于透过颅骨成像颅骨下微弱荧光实时变化。
40.具体地，液体螯合剂和颅骨透明填充液体可通过注射器等注入渗透位置上，并经颅表皮肤渗透进入全皮层，实现无创式加强荧光反应。
41.在一具体实施例中，如图4所示，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，还具体包括如下步骤：s40.通过环境摄像头监测与实时荧光变化情况实时对应的小动物自由行为，形成自由移动影像。
42.s50.基于自由移动影像和实时荧光变化情况，对小动物进行神经行为的信号同步记录分析。
43.具体地，将荧光信号在微型显微镜的成像芯片上，形成颅骨下荧光信号。实现动物自由移动且颅骨完整的情况下，通过上述微型显微镜装置和实验时普通的环境摄像头可以监测动物行为，实现小动物自由行为，和颅骨下荧光信号的实时线上的同步监测。该装置监测的荧光信号特异性突出，因此无需线上校正（如绿光校正）或离线的计算，在完整颅骨下荧光信号便可实时可视。
44.在一具体实施例中，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，在步骤s40中，即图像传感器芯片捕获颅骨下荧光信号，并通过微型线缆将颅骨下荧光信号传输给监测端，具体包括如下步骤：图像传感器芯片将颅骨下荧光信号转化为电信号，并通过微型线缆将电信号发送给监测端，用于基于电信号实现小动物介观尺度皮层的荧光信号和动物自由行为的实时线上监测。
45.在一具体实施例中，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法中，液体螯合剂为浓度为8%~11%的乙二醇双四乙酸或四乙酸。
46.具体地，在颅表皮肤剪开清理干净后，液体螯合剂在完整颅骨上形成稳定长期荧光透过率良好的视窗，结合荧光成像装置，在动物自由移动下实时监测颅骨下方的荧光信号。液体螯合剂可为8%~11%的乙二醇双四乙酸（egta）或四乙酸（bapta）增透颅骨。
47.在一具体实施例中，在步骤s20之前，即在发射光模块的出口端另外设置与待检测荧光匹配的长通滤光片之前，还具体包括如下步骤：根据颅骨下荧光信号的荧光波长，确定不同中心波长的长通滤光片。
48.具体地，传统所用绿色滤光片的中心波长为500nm~550nm且带宽为45nm~60nm的滤光片。
49.本实施例根据待检测荧光波长，如绿色，选择绿色长通滤光片的500nm或510nm以上通过，500nm或510 nm以下截止。如红色则选择红色长通滤光片，540nm以上通过，540nm以
下截止。
50.透过颅骨的生物荧光相当微弱，激发光比如470nm，二者共存于测试样品中，并且荧光的激发光谱与发射光谱波长间隔很小，比如15nm左右时，通过额外带通滤光片，可提高激发光和发射光之间的隔离度，提升微量荧光的特异性，使得在颅骨完整情况下，可以实时的监测颅骨皮层的荧光信号，用以同步评估全皮层尺度荧光变化和动物自由行为之间的实时监测的微型显微镜装置。
51.在一具体实施例中，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，在步骤s40中，即图像传感器芯片捕获颅骨下荧光信号的变化，具体包括如下步骤：s41.持续提取颅骨下荧光信号，包括：全皮层尺度微弱的荧光信号和各皮层脑区之间的活动关联。
52.s42.基于颅骨下荧光信号的变化，形成单个脑区和皮层介观尺度的荧光信号的强弱时序变化曲线图。
53.具体地，皮层浅层为约100微米深度的皮下层。颅骨下荧光信号包括钙荧光和/或神经递质荧光探针等。
54.如图5所示小动物在自由移动下全皮尺度荧光信号采集环境图，举例说明，在图中的小鼠右侧鼻子相关的脑区r-no处为目标观测位置，通过持续提取目标观测位置的钙离子反射的颅骨下荧光信号，可获取r-no处如图6所示的基于时序的荧光信号强弱变化曲线图，也即小鼠右侧鼻子相关的脑区在自由移动时荧光信号强度变化。
55.在一具体实施例中，该自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法，还具体包括如下步骤：s40.按预设时间间隔，通过微型显微镜采集颅内多个脑区对应的时序荧光信号亮度。
56.s50.实时监测不同脑区的时序荧光信号亮度和动物自由行为，生成皮层连接关系图谱，绘制在动物自由行为的状态下不同脑区的荧光变化分布图。
57.本实施例还提供一种自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测装置，包括：微型显微镜、监测端，以及用以连接微型显微镜和监测端用于传输颅骨下荧光信号的微型线缆。其中，微型显微镜的激发光的出口端设置有用于分离激发光和发射光的长通滤光片，自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测装置实现如前述的自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测方法。如图7所示，图中左侧为未采用本技术提供的荧光成像实时监测装置拍摄的颅骨下荧光信号图，右侧为采用本技术提供的荧光成像实时监测装置（包含激发光波段的截止滤光片对系统信噪音比的提升）拍摄的颅骨下荧光信号图。
58.本实施例提供的自由移动小动物无创颅骨下荧光成像监测装置，通过将液体螯合剂渗入无创完整颅骨中，避免传统需开颅进行监测荧光的方式，给小动物的颅骨顶上的发射光模块的出口端放置长通滤光片的微型显微镜，可保障小动物的自由移动的同时，无需进行绿光矫正，在进行荧光成像时及过滤掉杂质反射光，提高信噪比，过滤系统光源或大量反射光造成的噪音，显著地提高信号特异性，避免了传统开颅检测方案中过强的反射光，造成的皮层大量脑区，比如视觉皮层，荧光信号变化无法直接实时监测，且在线下分析中也无法有效提取，造成皮层信号丢失的风险。避免全皮层尺度的颅骨移除完成的感染风险和手术挑战。长期以来，完整颅骨下微弱荧光信号的应用，一直局限于受限的或固定动物的实验
方案和设置。本技术的操作方式简单，仪器成像不需损伤自由移动小动物的颅骨，实现了小动物在自由运动下全皮层尺度的颅骨下荧光信号和动物自由行为的长期稳定、清晰的且无感染风险的同步且实时的监测。
59.具体地，如图8所示长达六个月的颅内荧光信号的荧光变化稳定采集变化图。
60.应理解，上述实施例中各步骤的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本发明实施例的实施过程构成任何限定。
61.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。