含有类纤维连接蛋白多肽和脱细胞真皮基质的组合物及其用途的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有类纤维连接蛋白多肽和脱细胞真皮基质的组合物及其用途。


背景技术：

2.皮肤作为人体最大的器官，与外界的接触最为广泛。在其众多功能中，最重要的功能就是保护功能。由于环境变化、空气污染、不健康的生活习惯以及护肤品的不当使用，皮肤常常受到损害。随着技术的不断进步，“医学美容”变得越来越流行。透明质酸注射、微针、超声刀、激光等医学美容后的皮肤修复，直接推动了皮肤修复市场的增长。皮肤填充和修复产品的使用可以加速伤口的修复，保持皱纹的填充效果，提高医学美容的效果。
3.纤维连接蛋白是一种广泛存在于组织和组织液中的高分子蛋白。它们能促进细胞粘附、迁移、生长、增殖和分化，具有细胞再生和修复的生物学功能。猪脱细胞真皮基质（padm）是去除皮肤表皮的所有层和真皮的所有细胞成分后，仅保留猪真皮胶原成分、基本结构以及基膜成分。因皮肤移植的排斥反应主要是由细胞介导的免疫引起，基质中去除强免疫原性的细胞成分后，padm基质几乎不会引起任何宿主排斥反应，并可能诱导正常组织重塑。现有研究发现，padm可促进成纤维细胞和内皮细胞的快速增殖、以达到最佳的医美填充效果。尚未公开有将类纤维连接蛋白多肽应用在脱细胞真皮基质中的相关报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有类纤维连接蛋白多肽和脱细胞真皮基质的组合物及其用途。使得所述组合物中多肽序列较短，具备协同作用，促进伤口愈合成纤维细胞增殖和血管再生活性；无急性或慢性毒性作用，多肽序列较短，具有广阔的临床应用价值和前景。
5.为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：一方面，本发明提供了一种含有类纤维连接蛋白多肽和脱细胞真皮基质的组合物，所述组合物包含有类纤维连接蛋白多肽和脱细胞真皮基质；所述多肽包括如seq_1-10所示氨基酸序列中的一种或多种。
6.优选的，所述类纤维连接蛋白多肽包括如seq_ 2、6、9所示氨基酸序列中的一种或多种。
7.所述组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
8.另一方面，本发明还提供了前文所述组合物在制备医美制剂领域中的用途。
9.优选的，所述的制剂为皮下填充剂。
10.本发明还提供了一种类纤维连接蛋白多肽，所述多肽包括seq_1、seq_2、seq_3、seq_4、seq_5、seq_6、seq_7、seq_8、seq_9或seq_10所示的氨基酸序列。
11.优选的，所述多肽包括seq_2、seq_6或seq_9所示的氨基酸序列。
12.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括一种类纤维连接蛋白多肽，所述多肽包括seq_2、seq_6或seq_9所示氨基酸序列中一种或多种。
13.优选的，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的组合物包含有纤维连接蛋白多肽保守序列和提高稳定性的多个多肽以及脱细胞真皮基质。本发明的多肽基本上与哺乳动物猪和人的纤维连接蛋白的一部分同源或类似，生物安全性好。经验证，本发明所提供的多肽为小分子多肽，具有显著的促进伤痕愈合、成纤维细胞增殖和血管再生的能力；而且其特异性高、易于皮肤吸收、不易蛋白纤维化、易于分散。将padm和类纤维连接蛋白多肽相组合可显著的提高皮肤填充效果。本发明所提供的多肽序列较短，且较为稳定，整个多肽生产过程耗时短、成本低、操作易行，作为三维软组织填充物易于实现规模化生产，在医美产品研发方面具有重要的商业价值，临床应用前景广阔。
附图说明
15.图1是多肽1~10促进伤痕愈合的统计图；图2是多肽组促进伤痕愈合对比图；图3是多肽促进成纤维细胞增殖对照图；图4是植入不同材料10天后的填充结果图；图5是植入不同材料30天后的填充结果图；图6是小鼠padm+多肽组的植入物形态图；图7是padm+多肽组的植入物不同部位的he染色图。
具体实施方式
16.本发明公开了一种含有类纤维连接蛋白多肽和脱细胞真皮基质的组合物及其用途。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
17.试剂：hff-1人皮肤成纤维细胞株来自于上海宾穗生物，dmem培养基、15%胎牛血清均来自于赛默飞，0.25%胰蛋白酶来自于biosharp公司，dispase分散酶来自于罗氏。
18.实施例1：多肽的筛选分别对人和猪的纤维连接蛋白序列做blast同源性分析，取种间序列保守程度较高的序列，并按照多肽稳定性更高的原则，设计纤维连接蛋白的多肽。多肽序列委托金斯瑞公司合成。设计得到10个多肽，分别记为多肽1~10；其氨基酸序列如seq_ 1~10所示。即分别对应：多肽1：d-gly d-glu d-trp thr cys ile ala tyr ser d-gln d-leu d-arg；
多肽2: d-val asp ala val d-pro多肽3: d-val d-thr d-leu ser asp d-leu d-gln d-pro多肽4: d-ala d-gln gln thr thr d-lys d-leu多肽5: d-asp d-ala pro ile val asn d-lys d-val多肽6: d-ile d-lys tyr glu d-lys多肽7: d-tyr d-pro d-leu arg d-asn d-leu d-gln多肽8: d-glu d-tyr asn val ser val tyr d-thr d-val多肽9: d-lys d-val arg glu glu多肽10: d-lys d-pro gly val val tyr d-glu d-gly。
19.实施例2：多肽的伤痕愈合能力验证在37℃含有5% 的co2培养箱中培养hff-1人皮肤成纤维细胞株，使用dmem培养基，培养基中血清含量为15%胎牛血清。在24孔板上种18
×
104个细胞，500μl/孔，细胞吹打混匀，置于37℃的co2细胞培养箱中过夜培养。细胞培养16 h左右，待细胞完全贴壁，使用10μl枪头在孔底均匀划出划痕，用移液枪吸弃孔内的培养基，再加适量的培养基轻轻清洗一遍，然后添加1ml含有1%fbs血清的培养基和0.25 μmol/ml多肽生理盐水溶液，置于37℃的co2细胞培养箱中培养。培养24 h后拍照，使用显微镜拍摄划痕愈合照片，计算相对的伤痕愈合宽度。图1是多肽1~10促进伤痕愈合的统计图；如图1可见，多肽2、6和9显著增加了皮肤细胞的伤痕愈合能力。将多肽2、6和9按等量混合形成多肽组，以氨基酸序列如seq_ 11（gly arg ala asp ser pro）所示的多肽为对照组，重复上述划痕愈合实验。图2是多肽组促进伤痕愈合对比图；如图2可见，在24 h内与对照组相比，多肽组的伤痕几乎完全愈合，多肽组显著增加了皮肤细胞的伤痕愈合能力。需要说明的是，本实施例中将多肽2、6和9按等量混合仅是为了便于实验操作，不应作为对多肽各组分含量的限制。
20.实施例3：多肽组合物对成纤维细胞增殖的影响在37
°
c的co2培养箱中培养hff-1人皮肤成纤维细胞株，使用dmem培养基，培养基中血清含量为15%胎牛血清，培养箱中为5%co2。在96孔板上种3
×
103个细胞/100μl/孔，细胞吹打混匀，置于37℃的co2细胞培养箱中过夜培养。细胞培养24 h左右，待细胞完全贴壁，分别加入低剂量（0.025μmol/ml）、中剂量（0.25μmol/ml）和高剂量（2.5 μmol/ml）的多肽组合物，对照组中加入多肽的氨基酸序列如seq_ 11所示。96小时后，向孔中加入10
ꢀµ
l 5mg/ml mtt溶液，培养箱内孵育1.5 h后，显微镜下观察细胞有蓝紫色结晶甲瓒形成，吸弃上清，每孔加入100
ꢀµ
l dmso溶液，轻轻拍打96孔板，溶液呈均匀的紫色即可。使用自动酶标分析仪，波长设定550 nm，检测吸光度值。图3是多肽促进成纤维细胞增殖对照图；如图3可见，与对照组相比，多肽组具有更高的相对存活率，尤其中剂量和高剂量的多肽组合物可以显著提升相对存活率，可见，所提供的多肽组可以显著增加成纤维细胞的增殖能力。
21.实施例4：猪脱细胞真皮基质的制备本地屠宰场获得新鲜猪皮彻底清洁、割除真皮下脂肪组织并去除毛发，将所得的皮肤切成5
×5×
0.3 cm3的小块，保存在-20
°
c冰箱中，备用。处理后的猪皮在25℃下用0.25%胰蛋白酶（biosharp公司）溶液处理18小时，去除皮肤表皮，然后将真皮部分切成0.5
×
0.5
×
0.3 cm3的碎片；用0.25%胰蛋白酶溶液在25
°
c下摇床上摇动12小时；室温下用0.1%十二烷基硫酸钠（sds，国药）溶液清洗猪皮12小时，之后在25
°
c下用560 u/l的dispase（分
散酶）溶液（罗氏）清洗12小时。接着，猪皮在室温下用0.1%sds清洗12小时后用磷酸盐缓冲液（pbs）洗两次（每次15分钟）。处理完成后的猪皮用粉碎机进一步粉碎，送至无锡福腾辐照公司进行电子束灭菌得到猪脱细胞真皮基质。将其冷冻干燥后在-80
°
c冰箱中保存。
22.实施例5：多肽组合物和猪脱细胞真皮基质植入后的填充效果将6周龄雄性balb/c小鼠背部脱毛，确认脱毛干净，且无炎症后，随机分为padm组、多肽组以及padm+多肽组，每组6只小鼠；padm组仅注射padm，多肽组仅注射中剂量的多肽组合物，padm+多肽组同时注射padm和中剂量的多肽组合物。多肽剂量为200 μg/kg，padm剂量为10 g/kg（按湿重计算）。在每只小鼠皮下注射相应产品0.5ml，注射后观察有无外流，将注射成功的归笼饲养观察。每天观察小鼠状态。表1是各组小鼠体内毒性观察对比表。
23.表1.多肽和padm在小鼠体内毒性作用的观察
由表1可见，将本发明所提供的多肽及padm注射入小鼠体内后，对小鼠的正常饮食、排泄与运动等因素均未见明显的影响，所记录各项行为学指征均正常，且在注射后一天、一周及30天后均未发现小鼠死亡现象。说明本发明中的多肽及padm植入小鼠体内后，多肽及padm对小鼠没有明显的急性或慢性毒性作用，安全性能好。
24.在10天和30天的时候各测量一次植入物成形大小，30天测量后处死并解剖。图4是植入不同材料10天后的填充结果图；图5是植入不同材料30天后的填充结果图；如图4、图5所示，植入10天后，padm+多肽组和padm组植入物的成形大小差别不大，三个组均无炎症反应。植入30天后，padm+多肽组和padm组植入物均成半球状，padm+多肽组的植入物体积明显大于其它两组，具有显著性差异。可见，本发明所提供的padm+多肽组可显著提高皮肤填充效果。padm和多肽联用具有协同增效作用。
25.对padm+多肽组的植入物进行he染色后拍摄照片。图6是小鼠padm+多肽组的植入物形态图；如图6可见，植入30天后，植入物呈半圆肉球状，不透明，肉眼可见植入物表面有细小的血管；图7是padm+多肽组的植入物不同部位的he染色图（比例尺为100μm）；图中a、b为两个代表性的染色结果图；由图7可见，植入物表面有多层组织结构，有丰富的血管；在胶原架构下，细胞和组织围绕生长。
26.以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。