一种重组人生长激素水粉组合剂的制作方法

1.本发明涉及机械设备技术领域，具体涉及一种重组人生长激素水粉组合剂。


背景技术：

2.人生长激素(hgh)是一种由垂体前叶促生长细胞产生和分泌的蛋白激素。人生长激素通过对蛋白质、碳水化合物和脂肪的代谢作用，在儿童身体生长和成人的代谢中起着关键作用。
3.人生长激素为由191个氨基酸组成的单链多肽(bewly等，1972)，具有两个二硫键。一个在cys—53和cys—165之间，在分子内形成大环。另一个在cys—182和cys—189之间，在c端附近形成小环。在溶液中生长激素是一种不稳定的大分子蛋白质，hgh主要以单体形式存在，含小部分二聚体或更高分子量的寡聚体。在某些条件下比如剧烈震荡，可诱发hgh形成大量的二聚体、三聚体或更高的寡聚体。人生长激素多聚体的形成会引起免疫原性增强，进而在体内导致安全问题。
4.重组人生长激素含有11个精氨酸和9个赖氨酸，很容易发生氧化脱氨反应。
5.氧化反应：重组人生长激素中的met—14和met—125可发生磺化氧化反应(becker等，1988)。met—14和met—125为hgh中主要的氧化位点；与天然hgh相比较，met—14和met—125氧化产生的亚枫结构降低了hgh的稳定性。
6.脱氨反应：在温度偏高的条件下，蛋白质中的天冬酰胺和谷氨酰胺残基易发生脱酰胺反应。已有文献报道，hgh发生这种反应，导致asn—152转变为天冬氨酸，gln—137转变为谷氨酸(lewis等，1981)；已知在某些贮存条件下，生物合成的hgh可发生降解，导致另一个天冬酰胺(asn—149)发生脱酰胺反应；asn—152、gln—137以及asn—149为发生脱酰胺反应的主要位点。
7.针对重组人生长激素在溶液中不稳定现象，国际专利公开号w094/03198、国际专利公开号w093/19776、国际专利公开号w02005/105148、国际专利公开号w097/39768、美国专利公开号us6448225、中国专利公开号cn20110267989.9等均采用柠檬酸盐作为缓冲体系ph在6.0-6.3，但酸性条件注射时有轻微疼痛感，同时针对氧化脱氨现象采用了多种酸性氨基酸和碱性氨基酸作为保护剂，虽然取得了显著进展，但温度对液体制剂影响非常大，储存和运输过程中只能保持2-8℃环境中。


技术实现要素：

8.本发明针对现有技术存在的问题，本发明采用了双腔卡式瓶替代了现有的储存液体制剂的单腔卡式瓶，该组合剂包括前腔组合物和后腔组合物，分别分装在双腔卡式瓶的密封容器的前腔和后腔内。本发明的技术方案为：
9.一种重组人生长激素水粉组合剂，该组合剂存放在双腔卡式瓶内，双腔卡式瓶包括设置有前腔和后腔，该组合剂包括前腔组合物和后腔组合物，所述前腔组合物包括重组人生长激素、甘氨酸、甘露醇、蔗糖、维生素c、组氨酸、磷酸盐组成的无菌冻干粉末，后腔组
0.32mg。
24.当前腔组合物中重组人生长激素为2mg时，为小规格装量，可以一次性注射完毕，后腔组合物采用0.3-0.5ml的0.9％生理盐水。
25.制备方法：制备规格为每支产品含2mg重组人生长激素，数量1000支。
26.(1)称量：按照配方含量称取重组人生长激素粉末2000mg；甘氨酸2000mg；甘露醇400mg；蔗糖800mg；维生素c400mg；组氨酸1500mg；磷酸二氢钠和磷酸氢二钠各160mg；
27.(2)溶解定容：将上述称量后的粉末混合在一起，用500ml注射水定容。
28.(3)过滤除菌：将定容液用0.22um pvdf针筒过滤器进行除菌过滤。
29.(4)灌装：将过滤后混合液用蠕动泵灌装至已经加好中塞的双腔卡式瓶前腔内，每支灌装量为：前腔组合物灌装量为0.3ml。
30.(5)冻干充氮：将灌装产品放入冻干机对双腔卡式瓶内前腔组合物真空冷冻干燥，完成后在冻干箱内将双腔卡式瓶前腔充入氮气，氮气纯度99％；
31.(6)前腔轧盖：将卡式瓶前腔用轧盖机封口；
32.(7)后腔封装：将卡式瓶后腔用蠕动泵灌装0.9％生理盐水，每支灌装量为，后腔组合物灌装量为0.5ml；用灌装加塞机将后塞加入卡式瓶进行封口。
33.实施例2
34.一种重组人生长激素水粉组合剂，该组合剂存放在双腔卡式瓶内，双腔卡式瓶包括设置有前腔和后腔，所述前腔和后腔之间设置有中塞，该组合剂包括前腔组合物和后腔组合物，所述前腔组合物包括重组人生长激素、甘氨酸、甘露醇、蔗糖、维生素c、组氨酸、磷酸盐组成的无菌冻干粉末，后腔组合物为甘露醇和间甲酚混合溶液，前腔组合物储存在双腔卡式瓶的前腔内，所述双腔卡式瓶的前腔内充入氮气，后腔组合物储存在双腔卡式瓶的后腔内。
35.前腔组合物包括重组人生长激素为12mg、甘氨酸为2-12mg、甘露醇为4-24mg、蔗糖为8-24mg、维生素c4mg、组氨酸1.5-3.0mg、磷酸氢二钠0.16-0.32mg、磷酸二氢钠0.16-0.32mg。
36.当前腔组合物中重组人生长激素大于2mg时，大规格装量，可反复多次使用，后腔组合物采用1-1.14ml浓度为60mg/ml的甘露醇和占比0.3％的间甲酚，甘露醇为保护剂，间甲酚为防腐剂。
37.制备方法：制备规格为每支产品含12mg重组人生长激素，数量1000支。
38.(1)称量：按照配方含量称取重组人生长激素粉末12g；甘氨酸12g；甘露醇2.4g；蔗糖4.8g；维生素c2.4g；组氨酸9g；磷酸二氢钠和磷酸氢二钠各0.32g；
39.(2)溶解定容：将上述称量后的粉末混合在一起，用1000ml注射水定容。
40.(3)过滤除菌：将定容液用0.22um pvdf针筒过滤器进行除菌过滤。
41.(4)灌装：将过滤后混合液用蠕动泵灌装至已经加好中塞的双腔卡式瓶的前腔内，每支灌装量为：前腔组合物灌装量1ml。
42.(5)冻干充氮：将灌装产品放入冻干机对双腔卡式瓶内前腔组合物真空冷冻干燥，完成后在冻干箱内将双腔卡式瓶内前腔内充入氮气，氮气纯度99％；
43.(6)前腔轧盖：将卡式瓶前腔用轧盖机封口；
44.(7)后腔封装：将卡式瓶后腔用蠕动泵灌装甘露醇溶液，浓度为60mg/ml，其中含有
0.3％的间甲酚，每支灌装量为为：后腔组合物灌装量为1ml；用灌装加塞机将后塞加入卡式瓶进行封口。
45.对比例1
46.市售重组人生长激素组合剂，其有效成分为重组人生长激素4mg，甘氨酸40，蔗糖20，甲硫氨酸5，磷酸氢二钠0.523，磷酸二氢钠0.16。
47.各实施例和对比例的组成成分和稳定性如表1、表2和表3所示：
48.表1各实施例和对比例的成分组成表
[0049][0050]
表2各实施例和对比例25℃60％rh稳定性实验表
[0051][0052]
重组人生长激素相关蛋白为考察重组人生长激产品质量的重要指标，25℃60％rh条件稳定性考察试验中，hplc法检测各实施例制备样品相关蛋白，检验结果见表2，升速趋势见图2。
[0053]
表3各实施例和对比例的40℃60％rh加速稳定性实验表
[0054][0055]
在40℃60％rh加速稳定性考察试验中，相关蛋白检测结果见表3，相关蛋白升速趋
势见图3。
[0056]
通过上述评估可以发现本发明提供的重组人水粉组合剂具有更高的稳定性。
[0057]
本发明提供的组合剂装在双腔卡式瓶的密封容器内，所述双腔卡式瓶结构如图1所示，包括前腔和后腔，所述前腔和后腔之间设置有中塞，前腔组合物包括重组人生长激素、甘氨酸、甘露醇、蔗糖、维生素c、白蛋白、磷酸盐组成的无菌冻干粉末，里面充入氮气；后腔组合物为生理盐水或甘露醇和间甲酚混合溶液。将rhgh药物通过真空冷冻干燥形式制作成冻干粉末，置于前腔内，中间用硅胶制中塞隔离开，后腔内灌装后腔组合物为0.9％生理盐水或甘露醇和间甲酚混合溶液作为溶媒水，其在使用前非常方便溶解，即解决了rhgh的稳定性和活性问题，又同时解决了rhgh的液体制剂便利性的问题。
[0058]
针对现有技术中存在的氧化问题，本发明选取抗氧化剂维生素c和充入惰性气体氮气组合来加以保护。
[0059]
针对现有技术中存在的脱氨问题，本发明选取甘氨酸、组氨酸和甘露醇组合来加以保护。
[0060]
针对现有技术中存在的物理震荡产生聚合问题，本发明选取蔗糖来做保护剂。
[0061]
针对现有技术中存在的柠檬酸盐缓冲液ph偏低引起的注射疼痛问题，本发明选取磷酸盐缓冲体系ph中性7.0
[0062]
本发明提供的重组人生长激素水粉组合物明显降低了氧化脱氨以及高分子聚合，前腔组合物灌装量为0.3-1.0ml，经真空冷冻干燥后，冻干粉外观成型较好，结构致密均一，不会因运输过成震荡产生碎屑，造成生长激素聚合体的产生，集水剂和冻干粉剂优势于一身，有效的阻止了生长激素水剂极易氧化脱氨的不利因素，常温下有效期可达2年。
[0063]
如本发明提供的实施例中材料及其来源：
[0064]
(1)本发明中使用的重组人生长激素原料来自长春赛恩生物技术有限公司，冻干粉末，纯度为95％；上述重组人冻干粉末制备过程包括如下：将大肠杆菌摇瓶培养，发酵，表达的重组人生长激素蛋白粗提，精纯，制备成原液，除菌过滤，真空冷冻干燥而成。
[0065]
(2)本发明中使用的蔗糖为白色晶体粉末，纯度99％，来自湖南尔康；甘氨酸，甘露醇，维生素c为白色粉末，纯度均为99％，来自东北药；组氨酸为淡黄色粉末，纯度99％，来自上海协和；磷酸氢二钠和磷酸二氢钠为纯度99％白色晶体，来自湖南尔康；0.9％的生理盐水来自科伦药业；间甲酚，纯度为99％液体，来自merk。
[0066]
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本技术的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本技术的一般原则为目的，并非用以限定本技术的范围。本技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0067]
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
[0068]
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非
局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。