一种用于治疗特发性肺纤维化的二甲双胍吸入粉雾剂及其制备方法

1.本发明属于治疗特发性肺纤维化领域，特别涉及一种用于治疗特发性肺纤维化的二甲双胍吸入粉雾剂及其制备方法。


背景技术：

2.特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，ipf)是一种病因和发病机制尚不明确的、慢性进行性、纤维化性的一种间质性肺病。病变主要局限于肺部，好发于中老年男性，其肺组织学病理和或胸部高分辨率cthrct特征性地表现为寻常型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia，uip)。其临床特征是局限于肺间质间隙的渐进性瘢痕或纤维化，导致肺功能丧失并最终死亡。其表现的症状包括干咳、劳累性呼吸困难和疲劳。在疾病晚期，随着血氧水平的降低，皮肤可能会出现蓝染(发绀)，手指末端可能变厚或呈棒状。随着病情发展，肺动脉高压和右心衰的征象也会被观察到。
3.目前吡非尼酮和尼达尼布已被批准用于治疗ipf，虽然可以减缓疾病进展，但进行性的纤维化(疤痕)最终会导致死亡，患者诊断后的中位生存期仅为3-5年。intermune公司研发的吡非尼酮是一种小分子口服胶原蛋白(collagen)抑制剂和tgf-β1抑制剂，用于ipf的治疗。2008年10月16日，吡非尼酮获得日本医药品与医疗器械局pmda批准上市。《新英格兰医学杂志》(nejm)的ascend研究(确认吡非尼酮治疗ipf的有效性和安全性的评估)结果显示，治疗52周后，吡非尼酮可以有效减缓ipf患者的疾病进展。尼达尼布是由勃林格殷格翰研发的一种小分子化学合成药，为vegf、fgf、pdgf受体选择性拮抗剂。2014年10月美国fda批准乙磺酸尼达尼布上市用于ipf的治疗。
4.近期研究发现肺部菌群失衡可能是ipf的重要发病机制，而二甲双胍可以通过调控菌群发挥多种生物学功能。动物实验发现吸入二甲双胍可有效减轻肺纤维化的病理损伤，逆转肺纤维化。
5.吸入给药具有起效快、疗效好，可避免首过效应，同时减少不良反应，尤其适合肺部疾病等优点，已成为一种倍受关注的给药方式。干粉吸入剂是指微粉化药物或与载体以胶囊、泡囊或多剂量贮存形式，采用特制的干粉吸入装置，由患者主动吸入雾化药物至肺部，在肺部沉积，发挥局部或全身作用的制剂。相比传统的雾化吸入器和定量吸入器，干粉吸入器具有轻巧、易于携带、使用方便等优点，且对生态环境更加友好，成为临床上很受欢迎的吸入给药工具。
6.然而，由于微细颗粒具有较高的表面自由能，特别是粒径小于20μm的颗粒，受其颗粒间的范德华力的影响，这些颗粒通常易于团聚在一起，且这些团聚物堆密度很低，所以往往表现出很差的流动性，不利于运输和计量。在吸入制剂中，往往希望粉末的粒径在一个很小的尺度但又表现出良好的流动性及分散性。因此，通常这些吸入制剂处方中需要添加大量的分散剂如乳糖、甘露醇等，或是添加第三组分如甘露醇、磷脂、亮氨酸、硬脂酸镁、聚乙二醇6000等以改善流动性。
7.但上述方案对粉末剂的流动性改善效果较为局限，而且很大程度上限制了活性物质的可添加量。将粉末制备成颗粒是一种改善流动性的有效方法，在粉末中添加溶液制粒或利用压力将粉末压制成颗粒是目前常用的方法。但这些方法往往会使粉末不可逆的变成大颗粒，这些大颗粒无法通过气流再破碎成微细颗粒，因而并不适用于吸入领域。


技术实现要素：

8.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂及其制备方法。
9.本发明的技术方案具体如下：
10.一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂的制备方法，包括以下步骤：
11.1)将二甲双胍原料进行预处理，得到微细粉末，备用；
12.2)将步骤1)得到的微细粉末采用摇摆制粒机，在转速200rpm，通过孔径为100-1000μm的筛网，得到松软的颗粒簇团；
13.3)将步骤2)的颗粒簇团在振动频率100-300hz下预球聚化10-300s得到颗粒簇团；
14.4)将步骤3)得到的颗粒簇团在圆盘上滚动，圆盘的转速为5-90rpm，与水平面的角度为0-80
°
，球聚化1-30min，得到球形颗粒簇团；
15.5)将步骤4)得到的球形颗粒簇团用胶囊充填机充填于胶囊中，即得二甲双胍吸入粉雾剂。
16.优选地，二甲双胍原料为二甲双胍或其盐。
17.优选地，微细粉末中d90＜5μm。
18.优选地，步骤2)还包括辅料，微细粉末与辅料采用摇摆制粒机制粒，辅料为一水乳糖和/或甘露醇。
19.优选地，二甲双胍原料与辅料的质量比为(10-100)：(0-90)。
20.优选地，辅料d90＜30μm。
21.优选地，二甲双胍吸入粉雾剂所用的干粉吸入器包括防尘盖、吸嘴、药仓、底盖以及两个针刺单元；吸嘴、药仓、底盖顺次连接；吸嘴上设置有通道，该通道为螺旋通道结构，通道的底部设置有栅格滤网；吸嘴上设置有防尘罩；药仓顶部开设有放置二甲双胍吸入粉雾剂的药物盛放仓；药仓下部左右两侧均设置有与药物盛放仓连通的通孔；
22.两个针刺单元对称设置在药仓下部两侧，且均包括按钮、钢针、针座、弹簧，按钮内侧设置有针座，针座的内侧设置有钢针，钢针另一端伸入至通孔内，针座与药仓外壁之间的钢针上套设有复位弹簧。
23.本发明还提供了一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂，由上述制备方法制备得到的。
24.本发明提出了一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂及其制备方法，与传统的粉雾剂制粒工艺相比，不需要使用溶剂或粘合剂就可以制备球形颗粒，制备的颗粒具有一定的强度能够满足运输灌装需要，且球形颗粒簇团粒径小于1000μm，可以提高流动性，又能在气流作用下重新分散成微细颗粒，对ipf有较好的治疗效果。
80
°
，优选为30-50
°
；预球聚化时间1-30min，优选3-15min。
47.为了提高二甲双胍吸入粉雾剂中球形颗粒簇团的递送剂量和微细粒子比例，参见图1-2，二甲双胍吸入粉雾剂所用的干粉吸入器包括防尘盖、吸嘴1、药仓2、底盖3以及两个针刺单元4；吸嘴1、药仓2、底盖3顺次连接；吸嘴1上设置有通道，该通道为螺旋通道结构，通道的底部设置有栅格滤网11；吸嘴1上设置有防尘罩；药仓2顶部开设有放置二甲双胍吸入粉雾剂的药物盛放仓；药仓2下部左右两侧均设置有与药物盛放仓连通的通孔；两个针刺单元4对称设置在药仓2下部两侧，且均包括按钮5、钢针6、针座7、弹簧8，按钮5内侧设置有针座7，针座7的内侧设置有钢针6，钢针6另一端伸入至通孔内，针座7与药仓2外壁之间的钢针6上套设有复位弹簧8。使用时打开药仓2，将二甲双胍吸入粉雾剂放置于药物盛放仓内，关闭药仓2并按压按钮5，按钮5顶出针将胶囊扎破。吸气时，气流从两个中心对称的流道进入，形成旋转气流，将药粉从胶囊带出，进入吸嘴1内的螺旋通道。其中吸气时胶囊将会被气流带出限定仓，在限定仓上方随气流方向旋转。
48.本发明的干粉吸入器在breezhaler基础上改良得到，将二甲双胍原料制备成可用于吸入的球形颗粒簇团，配合在干粉吸入器来治疗ipf，在保障低阻力的同时实现较高的微细粒子比例，保障肺部沉积率。本发明的吸嘴1内部为具有一层栅格滤网11的螺旋通道，即同时具有栅格与螺旋的流道，微细粒子fpf比例高达70％以上，对治疗ipf有更好的效果。
49.需要说明的是，吸嘴1仅仅具有螺旋的流道和仅仅具有栅格的流道，微细粒子fpf比例为50％左右，低于本发明干粉吸入器的效果。
50.另外，为了不使胶囊壳破裂，钢针6的针尖为由三面组成，即针尖呈三棱锥，能够使得钢针6在刺破胶囊时能形成可供药物进出的小洞，同时胶囊壳不破裂。
51.在本发明中，为了在保障低阻力的同时实现较高的微细粒子比例，通道为双螺旋通道结构。该双螺旋通道优选为由间隔环绕在通道内壁的扇形旋转筋10和长方形螺旋筋9组成。
52.本发明还提供了一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂，包括上述制备方法制备得到的二甲双胍吸入粉雾剂。
53.本发明制备得到的粉雾剂采用干粉吸入器吸入，起效快、疗效好、同时减少不良反应，可避免首过效应，尤其适合肺部疾病。本发明原料易得，便宜；可不含辅料，制备成球形颗粒，流动性优异，低阻力，借助双螺旋通道在低阻力下获得优异的分散效果。
54.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
55.实施例1
56.干粉吸入器包括防尘盖、吸嘴1、药仓2、底盖3以及两个针刺单元4；吸嘴1、药仓2、底盖3顺次连接；吸嘴1上设置有通道，该通道为双螺旋通道结构，双螺旋通道是由间隔环绕在通道内壁的扇形旋转筋10和长方形螺旋筋9组成，通道的底部设置有栅格滤网11；吸嘴1上设置有防尘罩；药仓2顶部开设有放置二甲双胍吸入粉雾剂的药物盛放仓；药仓2下部左右两侧均设置有与药物盛放仓连通的通孔；
57.两个针刺单元4对称设置在药仓2下部两侧，且均包括按钮5、钢针6、针座7、弹簧8，按钮5内侧设置有针座7，针座7的内侧设置有钢针6，钢针6的针尖呈三棱锥，钢针6另一端伸
入至通孔内，针座7与药仓2外壁之间的钢针6上套设有复位弹簧8。
58.实施例2
59.一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂的制备方法，包括以下步骤：
60.1)将二甲双胍进行预处理，得到粒度为d90＜5μm的微细粉末，备用；
61.2)将步骤1)得到的微细粉末采用摇摆制粒机，在转速200rpm，通过孔径为300μm的筛网，得到松软的颗粒簇团；
62.3)将步骤2)的颗粒簇团在振动频率200hz下预球聚化80s得到颗粒簇团；
63.4)将步骤3)得到的颗粒簇团在圆盘上滚动，圆盘的转速为40rpm，与水平面的角度为40
°
，球聚化10min，得到球形颗粒簇团；
64.5)将步骤4)得到的球形颗粒簇团用胶囊充填机充填于胶囊中，即得二甲双胍吸入粉雾剂。
65.实施例3
66.一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂的制备方法，包括以下步骤：
67.1)将二甲双胍进行预处理，得到粒度为d90＜5μm的微细粉末，备用；
68.2)将步骤1)得到的微细粉末和粒度为d90＜30μm的一水乳糖采用摇摆制粒机，在转速200rpm，通过孔径为100μm的筛网，二甲双胍原料与一水乳糖的质量比为1:9，得到松软的颗粒簇团；
69.3)将步骤2)的颗粒簇团在振动频率10hz下预球聚化300s得到颗粒簇团；
70.4)将步骤3)得到的颗粒簇团在圆盘上滚动，圆盘的转速为5rpm，与水平面的角度为80
°
，球聚化30min，得到球形颗粒簇团；
71.5)将步骤4)得到的球形颗粒簇团用胶囊充填机充填于胶囊中，即得二甲双胍吸入粉雾剂。
72.实施例4
73.一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂的制备方法，包括以下步骤：
74.1)将二甲双胍原料进行预处理，得到粒度为d90＜5μm的微细粉末，备用；
75.2)将步骤1)得到的微细粉末和粒度为d90＜30μm的甘露醇采用摇摆制粒机，在转速200rpm，通过孔径为1000μm的筛网，二甲双胍与甘露醇的质量比为1:1，得到松软的颗粒簇团；
76.3)将步骤2)的颗粒簇团在振动频率300hz下预球聚化10s得到颗粒簇团；
77.4)将步骤3)得到的颗粒簇团在圆盘上滚动，圆盘的转速为90rpm，与水平面的角度为0
°
，球聚化1min，得到球形颗粒簇团；
78.5)将步骤4)得到的球形颗粒簇团用胶囊充填机充填于胶囊中，即得二甲双胍吸入粉雾剂。
79.实施例5
80.一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂的制备方法，包括以下步骤：
81.1)将二甲双胍盐酸盐进行预处理，得到粒度为d90＜5μm的微细粉末，备用；
82.2)将步骤1)得到的微细粉末采用摇摆制粒机，在转速200rpm，通过孔径为200μm的筛网，得到松软的颗粒簇团；
83.3)将步骤2)的颗粒簇团在振动频率100hz下预球聚化120s得到颗粒簇团；
84.4)将步骤3)得到的颗粒簇团在圆盘上滚动，圆盘的转速为30rpm，与水平面的角度为50
°
，球聚化15min，得到球形颗粒簇团；
85.5)将步骤4)得到的球形颗粒簇团用胶囊充填机充填于胶囊中，即得二甲双胍吸入粉雾剂。
86.实施例6
87.一种用于治疗ipf的二甲双胍吸入粉雾剂的制备方法，包括以下步骤：
88.1)将二甲双胍盐酸盐进行预处理，得到粒度为d90＜5μm的微细粉末，备用；
89.2)将步骤1)得到的微细粉末和粒度为d90＜30μm的一水乳糖采用摇摆制粒机，在转速200rpm，通过孔径为500μm的筛网，得到松软的颗粒簇团二甲双胍原料与一水乳糖的质量比为7:3，得到松软的颗粒簇团；
90.3)将步骤2)的颗粒簇团在振动频率250hz下预球聚化30s得到颗粒簇团；
91.4)将步骤3)得到的颗粒簇团在圆盘上滚动，圆盘的转速为60rpm，与水平面的角度为30
°
，球聚化3min，得到球形颗粒簇团；
92.5)将步骤4)得到的球形颗粒簇团用胶囊充填机充填于胶囊中，即得二甲双胍吸入粉雾剂。
93.对比例1
94.与实施例1的区别仅在于：吸嘴1上设置有通道，该通道为双螺旋通道结构，双螺旋通道是由间隔环绕在通道内壁的扇形旋转筋10和长方形螺旋筋9组成，通道的底部未设置栅格滤网11，具体参见图3。
95.对比例2
96.与实施例1的区别仅在于：吸嘴1上设置有通道，该通道的底部设置栅格滤网11，具体参见图4。
97.对比例3
98.与实施例3的区别仅在于：二甲双胍进行预处理，得到粒度为d90≥5μm的微细粉末，其余与实施例3完全相同。
99.对比例4
100.与实施例3的区别仅在于：一水乳糖的粒度为d90≥30μm，其余与实施例3完全相同。
101.对比例5
102.与实施例2的区别仅在于：无步骤2)，其余与实施例2完全相同。
103.对比例6
104.与实施例2的区别仅在于：无步骤3)，其余与实施例2完全相同。
105.对比例7
106.与实施例2的区别仅在于：无步骤4)，其余与实施例2完全相同。
107.1、fpf测定
108.参照《中国药典2020》吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法(附录0951)对实施例2-5制备得到的粉雾剂分别采用实施例1、对比例1-2的干粉吸入器进行微细粒子量fpf测定，结果见表1。
109.其中，实验组1-4为实施例2-5分别采用实施例1的干粉吸入器测定；
110.对照组1-2为实施例3采用采用实施例1的干粉吸入器测定；
111.对照组3-4为对比例3-4分别采用实施例1的干粉吸入器测定。
112.表1 fpf测定结果
[0113][0114]
由表1可知，仅仅具有双螺旋的流道和仅仅具有栅格滤网的流道，微细粒子量fpf为50％左右。而本发明同时具有栅格滤网与螺旋的流道，在测试后，微细粒子量fpf高达70％以上。因此，本发明的干粉吸入器在药物沉积肺部的过程中可达到更好的效果。
[0115]
另外采用本发明的制备方法得到的二甲双胍吸入粉雾剂的球形颗粒簇团中，微细粒子量fpf高。
[0116]
2、粒径分布测定
[0117]
参照《中国药典2020》按照筛分法测定实施例2及对比例5-7中的球形颗粒簇团粒径分布，结果见表2
[0118]
表2粒径分布测定结果
[0119]
颗粒粒径/μm实施例2对比例5对比例6对比例7＜1000.95
±
0.080.78
±
0.111.13
±
0.060.95
±
0.08100-2006.03
±
0.114.12
±
0.225.13
±
0.1513.36
±
1.33200-30023.01
±
2.216.27
±
0.547.89
±
0.6220.12
±
1.41300-40022.13
±
0.9814.29
±
1.8215.14
±
0.7455.14
±
3.38400-50045.81
±
3.4515.36
±
2.8921.44
±
1.9910.35
±
1.25500-6002.05
±
0.0923.13
±
4.1331.98
±
3.320.05
±
0.01＞6000.02
±
0.0235.51
±
9.2517.29
±
1.820.03
±
0.01堆密度g/cm30.34
±
0.040.29
±
0.050.32
±
0.040.28
±
0.03
[0120]
由表2可知，采用本发明的制备方法得到的二甲双胍吸入粉雾剂中球形颗粒簇团堆积密度相较于对比例5-7大。
[0121]
3、动物实验
[0122]
肺纤维化模型建立：选用6-8周大的c57bl6小鼠，适应一周；blm组和blm+met组小鼠首天经口滴注博莱霉素(3mg/kg/50μl)，用无菌pbs将博莱霉素干粉配制至所需浓度(博莱霉素经口注入小鼠肺的非手术方法：用异氟烷麻醉小鼠，并将其悬挂在70
°
角的手术板上。使用200μl移液管经口滴注博莱霉素)。
[0123]
其中，blm：博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型组；blm+met：雾化吸入二甲双胍对肺纤维化小鼠肺大体损伤的影响，该组采用干粉吸入器雾化吸入实施例2的二甲双胍吸入粉雾剂治疗；**p《0.01，n＝10。
[0124]
吸入式二甲双胍给药剂量：二甲双胍的上呼吸道局部给药浓度参考值为200mg/kg。根据小鼠体重25g/只，每只小鼠每天实施例2的二甲双胍吸入粉雾剂5mg，为期3周。
[0125]
体重称量：每周上午固定时间称取小鼠体重并做记录，观察各组不同时间小鼠体重变化情况。
[0126]
he染色、masson染色：小鼠肺组织取材后在4％多聚甲醛中固定24h，流水冲洗过夜，常规酒精脱水，石蜡包埋，切成5μm切片，进行he、masson染色，二甲苯透明后中性树胶封片。在光学显微镜下观察肺部病理学变化并拍照。
[0127]
α-sma免疫荧光：肺组织切片65℃烘干，二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水；pbs洗涤3次，每次10min，用滤纸将玻片周边的液体擦净，避免破坏玻片上的组织；向玻片上滴加0.1％的tritonx-100(pbs配制)，室温透膜30min；pbs洗涤3次，每次10min；用5％的bsa(pbs配制)封闭30min，勿洗；加入提前配好的不同种属的一抗(α-sma，1：100)，4℃孵育过夜；pbs洗涤3次，每次10min；在避光环境下，加入相应种属的荧光标记二抗(均为1：200稀释)，室温孵育1h；pbs洗涤3次，每次10min；dapi染色，室温孵育5min；pbs洗涤3次，每次3min；封片，荧光显微镜下观察荧光强度。
[0128]
统计学分析：结果采用graphpadprism9.0软件对各组实验数据进行统计学分析。所有实验数据均进行正态性检验，计量资料以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，多组样本的均数比较采用单因素方差分析(one-way anova)。以p《0.05为差异有统计学意义。结果见图5-7。
[0129]
1)二甲双胍减轻小鼠体重及肺纤维化的大体损伤
[0130]
图5(a)显示：与blm组相比，blm+met组体重下降且随时间增加两者差距更为显著；图5(b)显示：blm组肺部润泽度下降，肺组织充血水肿，颜色加深且不均匀；blm+met组肺部呈粉色，表面光滑，触及有弹性，较blm组病变有明显改变。
[0131]
2)二甲双胍减轻肺纤维化的病理损伤
[0132]
由图6masson和he染色可知，与control组相比，blm组胶原纤维明显增多，纤维化程度明显加重，在支气管周围有大片实变区，肺泡壁异常增厚且肺泡结构紊乱；与blm组相比，blm+met组胶原纤维明显减少，纤维化程度明显改善，肺泡结构完整，间隔正常，肺泡腔内及肺泡间隔无明显炎症细胞。
[0133]
3)二甲双胍降低α-sma的表达水平
[0134]
由图7可知，与control组相比，blm组α-sma表达明显增多；与blm组相比，blm+met组α-sma表达明显降低。
[0135]
4、不同种属间等效剂量
[0136]
根据实验结果与不同种属间等效剂量换算规则(见图8)，将小鼠的noael转化为人
体等效剂量hed，即二甲双胍hed(mg/kg)＝小鼠noael/12.3＝200mg/kg/12.3＝16.3mg/kg，对于一个体重为60kg的成年人，hed＝16.3mg/kg
×
60kg＝978mg，选择安全系数为10，因此人体首次研究最大推荐起始二甲双胍吸入剂量为97.8mg。
[0137]
其中，noael：通过动物临床前毒理学研究获得的未见不良反应剂量；hed：人体等效剂量。
[0138]
因此，根据人体重量，二甲双胍吸入粉雾剂每日吸入剂量为100-4500mg。
[0139]
综上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的某些优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明精神和范围。