一种提升石菖蒲油稳定性的Pickering乳剂

一种提升石菖蒲油稳定性的pickering乳剂
技术领域
1.本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种提升羚珠散中石菖蒲油稳定性的pickering乳剂。


背景技术：

2.小儿热性惊厥是儿科常见疾病，其首次发作后再次病发率为30％～40％，主要表现为突发的局部或全身肌群阵挛性、强制性抽搐。反复的惊厥再发作除了有导致癫痫的可能，还会引起患儿不可逆的脑损伤、智力低下。羚珠散是由雷允上药业集团有限公司生产的百年经方，被申为国家非物质文化遗产，在治疗小儿热性惊厥、外感风寒上的临床使用率极高。羚珠散药方由羚羊角粉、珍珠粉、牛黄粉、僵蚕、朱砂、琥珀粉、胆南星、冰片和石菖蒲油组成，方中的石菖蒲油存在易氧化、挥发、逸散的问题，会直接影响羚珠散制剂的稳定性，进而影响制剂疗效。因此，提高石菖蒲油的稳定性是羚珠散质量提升亟需解决的现实问题。
3.文献(石菖蒲挥发油包合工艺优选及稳定性考察，齐齐哈尔医学院学报，2011年，第32卷第11期)报道了一种由β-环糊精和石菖蒲挥发油制备而成的包合物，该包合物的制备方法为：采用饱和水溶液法，精密称取β-环糊精3.00g制成饱和溶液，置于磨口锥形瓶中，利用集热式恒温磁力搅拌器恒温搅拌，用胶头滴管逐滴加入挥发油乙醇溶液，搅拌一定时间后，静置冷藏24h，滤过，沉淀用石油醚洗涤，晾置24h，干燥后即得白色粉末状包合物；其中，β-环糊精与挥发油的比例为8∶1，包合温度为30℃，搅拌时间为2h。虽然该包合物能够在一定程度上提高石菖蒲挥发油的稳定性，但是，β-环糊精不是羚珠散药方中原有的组分，在羚珠散中引入β-环糊精存在以下问题：(1)环糊精类成分具有导致肾脏易结晶、引发肾毒性的风险；(2)β-环糊精包合技术载药量较低，会导致大量辅料引入制剂，增大服用剂量；(3)在制备β-环糊精和石菖蒲挥发油的包合物时，需要采用石油醚洗涤，存在有机溶剂残留的问题；(4)包合后会影响石菖蒲挥发油的体外溶出、体内吸收等行为。
4.为了解决上述问题，亟需开发出一种新的提升羚珠散中石菖蒲油稳定性的方法。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的在于提供一种提升羚珠散中石菖蒲油稳定性的pickering乳剂组合物。
6.本发明的另一个目的在于提供一种石菖蒲油稳定性显著提升的羚珠散制剂。
7.本发明提供了一种组合物，它包含石菖蒲油、珍珠和水，其中，石菖蒲油、珍珠和水的比例为(4-8)ml：(0.1-1.6)g：(6-15)ml。
8.进一步地，所述石菖蒲油、珍珠和水的比例为(5-7)ml：(1.3-1.6)g：(13-15)ml。
9.进一步地，所述石菖蒲油、珍珠和水的比例为6ml：1.3g：14ml。
10.进一步地，所述珍珠是珍珠粉。
11.进一步地，所述石菖蒲油是石菖蒲的挥发油。
12.进一步地，所述组合物为pickering乳剂。
13.本发明还提供了上述组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将石菖蒲油、珍珠和水混合均匀，即得。
14.进一步地，所述混合均匀的方法为高压均质法。
15.进一步地，所述高压均质法中，均质压力为400-600bar，均质时间为10-30min。
16.进一步地，所述高压均质法中，均质压力为500bar，均质时间为20min。
17.本发明还提供了上述组合物在制备羚珠散制剂中的用途。
18.本发明还提供了一种羚珠散制剂，它是以羚羊角、珍珠、牛黄、僵蚕、朱砂、琥珀、胆南星、冰片和上述组合物为原料制备而成的制剂。
19.进一步地，所述羚珠散制剂中原料的重量份数为：羚羊角100-200份，珍珠100-200份，牛黄250-400份，僵蚕250-400份，朱砂100-200份，琥珀250-400份，胆南星550-650份，冰片20-40份，组合物35-55份。
20.进一步地，所述羚珠散制剂中原料的重量份数为：羚羊角150份，珍珠150份，牛黄300份，僵蚕300份，朱砂150份，琥珀300份，胆南星600份，冰片30份，组合物44-45份。
21.本发明中，pickering乳剂是指一种使用固体颗粒作为稳定剂的乳剂。
22.本发明基于“药辅合一”思想开发了一种包含石菖蒲油、珍珠粉和水的pickering乳剂，该pickering乳剂能够显著提高石菖蒲油的稳定性。
23.本发明pickering乳剂中采用的珍珠粉是羚珠散药方中原有的药材，没有引入额外的辅料，不会增加制剂的毒性。
24.本发明pickering乳剂的制备方法简单，不涉及对有机溶剂的使用，克服了现有技术中有机溶剂残留的问题。
25.本发明的pickering乳剂对石菖蒲油的载药量较高，而且不会影响石菖蒲油的体外溶出、体内吸收等行为。
26.在pickering乳剂能够显著提高石菖蒲油的稳定性的基础上，本领域技术人员能够合理推论出本发明包含该pickering乳剂的羚珠散制剂中石菖蒲油的稳定性也会显著提升。本发明为改善羚珠散制剂质量提供了一种新的选择。
27.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
28.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
29.图1：各药材成乳类型的鉴别和工艺的优化。a.成乳状态(a.朱砂；b.珍珠粉；c.琥珀)；b.滤纸法鉴别各药材成乳类型(a.珍珠粉；b.琥珀)；c.染色法鉴别各药材成乳类型(染色前：a.珍珠粉；b.琥珀，染色后：c.珍珠粉；d.琥珀)；d.不同珍珠粉浓度成乳体积；e.不同油水比的成乳状态；f.高速分散法制备(
×
100)；g.高压均质法制备(
×
100)。
30.图2：近红外光谱图。a.珍珠粉混悬液；b.pickering乳剂；c.石菖蒲油。
31.图3：各组别间指标变化对比与丙二醛和吸光度标准曲线。a.不同时间段石菖蒲油的保有率；b.丙二醛浓度和吸光度的标准曲线；c.不同时间段下丙二醛的含量；d.不同时间
段下过氧化物的含量。注：与空白组相比
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p＜0.001；与油水混合物组相比
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p＜0.001。图4：石菖蒲油总离子流图、各时间段火山图、差异成分的热图。a.石菖蒲油总离子流图；b.火山图(a.1h与3h的火山图；b.1h与8h的火山图；c.3h与8h火山图)；c.差异成分的热图。
32.图5：差异成分的pca图。a.1h时各组别差异成分的pca图；b.3h时各组别差异成分的pca图；c.8h时各组别差异成分的pca图；d.各组别差异成分的pca图。
33.图6：各组别差异成分-时间变化规律。
34.图7：各组别差异成分箱型图。
具体实施方式
35.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
36.mh-3000型调温型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)，hg-3磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)，jy-3002十万分之一分析天平(上海浦春仪器有限公司)，ika t18digital数显型高速分散机(上海土森视觉科技有限公司)，ah-basic高压均质机(安拓思纳米技术有限公司)，dm3000生物显微镜(徕卡显微系统贸易有限公司)，tensor-27傅里叶变换红外光谱仪(德国布鲁克公司)，antirisii傅里叶变换近红外光谱仪(美国赛默飞公司)，k100c-kruss全自动表面张力及接触角测定仪(德国kruss公司)，紫外分光光度仪(上海佑科仪器仪表有限公司)，酸式滴定管，凯氏烧瓶。
37.石菖蒲油(相对密度0.9150～0.9700，折光指数1.485～1.508，纯度90％以上)、珍珠粉(纯度90％以上)、人工牛黄(纯度90％以上)、琥珀(纯度90％以上)、朱砂(纯度90％以上)、僵蚕胆南星混合物购自雷允上药业集团有限公司，氯仿(批号20200203，天津市天力化学试剂有限公司)、2-硫代巴比妥酸(tba，上海科丰实业有限公司，批号20170921)、三氯乙酸、1，1，3，3-四乙氧基丙烷(上海麦克林生化科技有限公司，批号c10050555，纯度≥97％)，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
38.实施例1：制备pickering乳剂
39.取1个45ml离心管，加6ml石菖蒲油、14ml蒸馏水和1.3g珍珠粉，使用高压均质机制备(高压均质参数：均质压力500bar，均质时间20min)，得到pickering乳剂。
40.实施例2：制备包含pickering乳剂的羚珠散制剂
41.配方如下：羚羊角粉150g，珍珠粉150g，牛黄300g，僵蚕300g，朱砂150g，琥珀300g，胆南星600g，冰片30g，实施例1的pickering乳剂44.44g。
42.制备方法如下：朱砂水飞或粉碎成极细粉，牛黄、琥珀、冰片分别研成细粉，过筛；胆南星、僵蚕加水煎煮2次，每次1小时，合并煎液，静置，取上清液浓缩成稠膏，与羚羊角粉、珍珠粉、牛黄、琥珀混匀，干燥，粉碎成细粉，再与冰片、朱砂配研；然后加入实施例1所制备的石菖蒲油pickering乳剂，过筛，混匀，即得。
43.以下通过实验例证明本发明的有益效果。
44.实验例1：pickering乳剂中稳定剂粉体性质表征、筛选及pickering乳剂的制备工艺优化
45.1.溶解度、粒径、接触角测定
46.受试样品：珍珠粉、琥珀、朱砂、人工牛黄、羚羊角、僵蚕胆南星混合物。
47.溶解度：使用jy-3002十万分之一分析天平分别称取0.01g的珍珠粉、琥珀、朱砂、人工牛黄、羚羊角、僵蚕胆南星混合物于100ml水中，每隔5min强力振摇30s；观察30min内的溶解状态。
48.粒径：借助马尔文激光粒度仪的干法测定项测定珍珠粉粒子的粒度。设定样品测量时间为12s，背景测量时间为10s，分散气压为200kpa，遮光度范围0.8％～3.0％，进样速度为50％，加入适量样品粒子，开始测量并记录各样品粒子粒径分布特征值d
90
。
49.接触角：取0.2g样品粒子用直径为10mm的红外压片机(设定压力为6n)压制成片，以水为测试溶液，运用kruss测定珍珠粉粒子的润湿性能。
50.表1.各饮片的溶解度、粒径、接触角对比(n＝3)
[0051][0052]
结果见表1，各饮片均为难溶性物质，成乳时溶解到水里的消耗可以忽略。羚羊角和僵蚕胆南星混合物粒径过大(》100μm)不易于制备pickering乳，人工牛黄的接触角过小不易用于形成pickering乳。初步筛选出珍珠粉、琥珀和朱砂作为pickering乳的稳定剂。
[0053]
2.稳定剂的筛选及pickering乳剂的工艺优化
[0054]
(1)稳定剂的筛选实验
[0055]
方法：乳剂的制备：量取适量石菖蒲油与水于烧杯中，共3份，分别加入适量珍珠粉、琥珀、朱砂，使用高速分散机成乳，分离乳相，观察乳层颜色。
[0056]
滤纸法：吸取适量乳液滴至滤纸上，观察展开现象。
[0057]
染色法：将乳剂样品涂在载玻片上，用苏丹-iii和亚甲蓝各染色一次，观察染色结果。
[0058]
结果：根据图1a可以观察到，朱砂存在于水层壁上或沉于底部无法形成pickering乳，使用滤纸法和染色法可以得出珍珠粉形成的pickering乳为o/w型，琥珀形成的pickering乳为w/o型，如图1b、c。最终确定使用珍珠粉作为pickering的稳定剂。
[0059]
(2)稳定剂浓度的筛选实验
[0060]
方法：量取14ml水和6ml石菖蒲油，共16份，再分别加入0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1.0g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g的珍珠粉，使用高速分散机制乳，观察油的包载量和成乳量，确定最优pickering乳浓度。
[0061]
结果：随着珍珠粉浓度的递增，形成的乳层也逐步增加，如图1d，在浓度超过0.065g
·
ml-1
后成乳量趋于稳定且形成的乳层随着放置时间的增加出现分层现象，得出在1.3g及浓度为0.065g
·
ml-1
时其形成的pickering乳为最优浓度。
[0062]
(3)油水比例的筛选实验
[0063]
方法：取5个45ml离心管，加入6ml石菖蒲油，在分别加入14ml、11.14ml、9ml、7.33ml、6ml蒸馏水，再依次加入1.30g、1.11g、0.96g、0.87g、0.78g的珍珠粉，使用高速分散机成乳，观察成乳量和包油量，确定最优油水比例。
[0064]
结果：观察不同油水比例下的成乳状态，在油占比为30％、35％、40％时出现乳层和水层分层，在油占比为50％时出现乳层和油层分层，在油占比为45％时乳增稳定，无分层现象，如图1e，得出在油占比为45％(v9：v11)时为形成pickering乳为最优油水比例。
[0065]
(4)工艺的优化
[0066]
方法：取3个45ml离心管，加6ml石菖蒲油、14ml蒸馏水和1.3g珍珠粉，分别使用磁力搅拌器、高速分散机和高压均质机(高压均质参数：均质压力500bar，均质时间20min)制备，使用dm3000生物显微镜观察pickering乳形态，确定最优制备工艺。
[0067]
结果：磁子搅拌法无法成乳，再使用dm3000生物显微镜观察高速分散机和高压均质法的成乳，如图1f、g，得出使用高压均质法的成乳效果最佳。
[0068]
上述实验结果表明，本发明pickering乳剂的最佳制备工艺为：取1个45ml离心管，加6ml石菖蒲油、14ml蒸馏水和1.3g珍珠粉，使用高压均质机制备，得到pickering乳剂。
[0069]
实验例2：pickering乳剂的近红外光谱特征分析
[0070]
1.实验方法
[0071]
将适量石菖蒲油(购自雷允上药业集团有限公司)、珍珠粉混悬液(制备方法：取珍珠粉适量，加水配制成浓度为0.065g
·
ml-1
的悬液，即得)和pickering乳剂(实施例1制备而成)样品置于2mm的石英比色皿中进行光谱采集，光谱采集范围为4000cm-1-1000cm-1
，采集温度为室温，扫描次数为32，分辨率为8cm-1
、增益为1
×
。以空气为参比扣除背景采集光谱图，每个样品重复采集3次，得平均近红外光谱。
[0072]
2.实验结果
[0073]
如图2，通过观察近红外图谱可以得出在波数4 413cm-1
、5 888cm-1
和7065cm-1
处石菖蒲油的特征吸收峰在pickering乳剂中均被弱化，同时pickering乳剂中未产生明显的新吸收峰，说明pickering乳剂可将石菖蒲油包裹住且没有新的化学键形成。
[0074]
实施例3：稳定性实验
[0075]
受试样品：原油(即石菖蒲油，购自雷允上药业集团有限公司)、油占比为45％的油水混合物(制备方法：取石菖蒲油9ml，加入蒸馏水11ml，充分混匀，即得)、pickering乳剂(实施例1制备而成)。
[0076]
1.热稳定性实验中挥发油保有率的测定
[0077]
方法：将原油、油占比为45％的油水混合物、pickering乳剂分别置于100ml蒸发皿中，在40℃的烘箱中放置1h、3h和8h，取出后记录原油体积，将油水混合物和pickering乳使用水蒸气蒸馏法蒸馏8h，分离油相，平行三组实验并记录油相体积。
[0078]
结果：在40℃放置1h、3h和8h的条件下，pickering乳组与原油组和油水混合物组相比挥发油保有率均极显著提高(p《0.0001)，如图3a。
[0079]
2.挥发油中丙二醛物质测定
[0080]
方法：标准曲线测定：分别精确移取丙二醛标准溶液(0.315g 1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水溶解稀释至1000ml)0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08ml至10ml容量
瓶中，蒸馏水定容至10.00ml，既得浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08μg
·
ml-1
的丙二醛标准溶液。分别吸取上述各标准溶液各5.00ml，加5ml的硫代巴比妥酸(tba)溶液(0.288g硫代巴比妥酸加水稀释至100ml，0.02mol
·
l-1
)，混匀，于90℃水浴加热40min，取出，冷却后加入5.00ml氯仿，摇匀，静止1h，取上清液于532nm下测定吸光度，以标准系列溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
[0081]
样品制备及测定：分别取上述三组样品500μl于10ml容量瓶中，三氯乙酸混合溶液(37.5g三氯乙酸及0.50g乙二胺四乙酸钠，用水溶解，稀释至500ml)定容至刻度，超声10min，过滤取续滤液5.00ml于锥形瓶中，加入5.00ml的tba溶液，于90℃加热4h，取出，避光冷却1h，加入5.00ml氯仿，充分振摇，静置1h。取上清液，在532nm处测定其吸光度并计算丙二醛含量。
[0082]
结果：使用1，1，3，3-四乙氧基丙绘制出丙二醛浓度/吸光度的标准曲线，其线性回归方程为y＝0.088 9x-0.000 7、r＝0.998 9，如图3b。
[0083]
依据标准曲线计算不同样品中丙二醛浓度，可知在40℃放置1h、3h、8h后，相较于原油组，pickering乳组丙二醛含量显著降低(p《0.05，p《0.01)，如图3c。
[0084]
3.挥发油中过氧化物值测定
[0085]
方法：分别取上述三组样品500μl于离心管，取10ml三氯甲烷-冰乙酸混合液(v/v＝4：6)10ml洗涤至具塞锥形瓶，准确加入1ml饱和碘化钾溶液，密塞，振摇0.5min，暗处放置3min，取出，加入30ml水，加入1ml饱和碘化钾溶液，密塞，振摇0.5min，暗处放置3min，取出，加入30ml水，加入1ml1％淀粉指示剂，用0.001mol
·
l-1
硫代硫酸钠标准溶液(26g硫代硫酸钠与0.20g无水碳酸钠共溶于1000ml水中，缓缓煮沸10min，冷却后稀释所得)滴定至溶液蓝色消失为终点，记录消耗硫代硫酸钠标准溶液体积并计算pov值。
[0086]
结果：在40℃放置1h、3h、8h后，pickering乳组相比于油水混合物组和原油组过氧化物含量显著降低(p《0.05，p＜0.01)，如图3d。
[0087]
上述实验结果表明，在40℃放置1h、3h、8h后，与原油和油水混合物相比，本发明pickering乳剂能够显著提高挥发油保有率，显著降低丙二醛和过氧化物含量，显著提高石菖蒲油的稳定性。
[0088]
实验例4：通过气质联用分析挥发油变化成分
[0089]
1.实验方法
[0090]
受试样品：原油(即石菖蒲油，购自雷允上药业集团有限公司)、油占比为45％的油水混合物(制备方法：取石菖蒲油9ml，加入蒸馏水11ml，充分混匀，即得)、pickering乳剂(实施例1制备而成)。
[0091]
(1)gc-ms测定经不同条件下干预后的挥发油成分
[0092]
gc-ms检测条件：采用hp-5ms石英毛细管柱(30m
·
0.25mm，0.25um)，载气为氦气(纯度为99.999％)，流量1ml
·
min-1
；进样量1ul；分流比10：1；进样口温度230℃；升温程序：50℃保持2min，以5℃
·
min-1
升至110℃保持2min，继续以2℃
·
min-1
升至120℃保持5min，再以0.5℃
·
min-1
升至125℃保持10min，继续以4℃
·
min-1
升至200℃保持2min，再以10℃
·
min-1
升至250℃保持2min。质谱条件：电离方式ei，离子模式esi，电子能量为70ev，四级杆温度150℃，离子源温度230℃，扫描范围m/z35～500，溶剂延迟为3min。
[0093]
样品溶液的配制：分别取上述三组样品100ul于10ml棕色容量瓶，用乙醚定容，加
适量无水硫酸钠，精密称取2ml样品，过滤膜于液相小瓶中，使用gc-ms测定。
[0094]
(2)差异成分的筛选
[0095]
gc-ms数据采集完成后，经安捷伦数据库分析软件data analysis调用nist14.0数据库对各组成分进行定性，汇总27组数据并使用r语言limma包筛选不同受热时间下的差异成分，去重后使用差异成分绘制热图、pca图、时间变化图和箱型图。
[0096]
2.实验结果
[0097]
石菖蒲油gc-ms分析总离子流图如图5a所示。依据各组火山图，分别得到5、11、5个差异成分，如图4b，去重后一共得到12个差异成分。分别绘制这12个差异成分的热图和在1h、3h、8h以及不同组别的pca图，如图5，根据聚类信息组别可分为两组：
①
3h-pickering乳组、8h-pickering乳组、1h-原油组、1h-油水混合物组、3h-原油组、1h-pickering乳组、8h-油水混合物组。
②
8h-原油组。变化成分可分为二组：
①
α-卡迪涅(023515-88-0)、γ-莫罗林(030021-74-0)、1-十四烷醇(000112-72-1)、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烷(001879-07-8)、1-乙烯基-1-甲基-2-(1-甲基乙烯基)-4-(1-甲基亚乙基)-环己烷(029873-99-2)、阿拉斯克内(028400-12-6)、(+)-三角洲-卡迪涅(000483-76-1)，
②
1-甲基-4-(1-甲基亚乙基)-2-(1-甲基乙烯基)-1-乙烯基环己烷(003242-08-8)、4-(2，4-二氯苯基)-5-甲基-1，3-噻唑-2-基]-3-乙基-5-甲基-1，2-恶唑-4-甲酰胺(997220-78-8)、d-柠檬烯(005989-27-5)、4-(2，4-二氯苯基)-5-甲基-1，3-噻唑-2-基]-3-乙基-5-甲基-1，2-恶唑-4-甲酰胺(997220-96-6)、环十二烷(000294-62-2)。依pca图可知，相比于原油组，pickering乳组在各时间段中组内的三个点更聚集，所占范围更小，表明其组内重复性要优于原油组组间的差异性要小于原油组，在不同时间段下的热稳定性要优于原油组。对比各组别线形图和箱型图，得出相比于原油组，000294-62-2、005989-27-5、997220-96-6在pickering乳组中的下降趋势都得到减缓，000112-72-1、000483-76-1、001879-07-8、023515-88-0、028400-12-6、029873-99-2、030021-74-0的上升趋势都得到减缓，如图6、7。
[0098]
上述实验再次证明，与原油和油水混合物相比，本发明pickering乳剂能够显著提高石菖蒲油的稳定性。
[0099]
综上，本发明提供了一种提升石菖蒲油稳定性的pickering乳剂以及一种包含该pickering乳剂的羚珠散制剂。本发明基于“药辅合一”思想开发了一种包含石菖蒲油、珍珠粉和水的pickering乳剂。实验结果表明，该pickering乳剂能够显著提高石菖蒲油的稳定性。该pickering乳剂中采用的珍珠粉是羚珠散药方中原有的药材，没有引入额外的辅料。在pickering乳剂能够显著提高石菖蒲油的稳定性的基础上，本领域技术人员能够合理推论出本发明包含该pickering乳剂的羚珠散制剂中石菖蒲油的稳定性也会显著提升。本发明为改善羚珠散制剂质量提供了一种新的选择。