利用LB技术模块化组装胶原膜的方法

利用lb技术模块化组装胶原膜的方法
技术领域
1.本发明属于生物医用材料制备技术领域，涉及一种利用lb技术模块化组装胶原膜的方法，特别是利用lb技术模块化组装3d仿生各向异性胶原膜的方法。


背景技术：

2.各向异性微架构在生物系统中广泛存在，如肌肉、皮肤、关节软骨、木材等，以执行特定的生物功能。仿生天然材料的结构与功能特性，在传感器、致动器、细胞培养、组织工程等领域具有巨大的应用前景，因而得到广泛的关注。由于天然组织结构的复杂性，仿生天然材料各向异性结构的精准调控一直是具有挑战性的热点课题。胶原是构成动物结缔组织的重要组成结构蛋白，具有低抗原性、良好生物相容性和独特的生物功能，是一种理想的重要生物质材料，已被广泛应用于组织工程、生物医药、整形修复等领域。动物体内，胶原分子以1/4错列方式自组装形成具有67nmd周期结构的各向异性结构微架构：如，肌腱中的胶原纤维平行于单一方向，角膜中的胶原纤维每层呈正交排列，骨骼中的胶原纤维具有分层结构。
3.为了获得具有更好方向性的胶原纤维，许多调控方式被相继提出，如静电纺丝、流体剪切、磁场辅助、旋涂技术等。静电纺丝和流体剪切是最常用的方法，利用机械变形诱导胶原形成一定的方向性,以具有足够迁移率的高浓度胶原溶液为加工材料，所形成的“胶原纤维”实质为胶原分子的纤维状聚集体，并不存在67nm特征d周期结构(y.wakuda,s.nishimoto,s.suye,et al.native collagen hydrogel nanofibres with anisotropic structure using core-shell electrospinning[j]scientific reports,2018,8(1):6248-6248；s.kwak,a.haider,k.c.gupta,et al.nano multilayered scaffolds of plga and collagen by alternately electrospinning for bone tissue engineering[j].nanoscale research letters,2016,11(1):323-323.)。磁场辅助以添加了磁性纳米微粒的胶原复合溶液为加工材料，在外环境磁场作用下，溶液中的胶原分子形成2d(二维)单轴排列的聚集纤维。旋涂技术可实现2d胶原纤维层之间不同方向的3d叠层，但2d胶原纤维层上的纤维生长方向易逆转或产生“钩”状(m.antmanpassig,o.shefi.remote magnetic orientation of 3d collagen hydrogels fbr directed neuronal regeneration[j].nano letters,2016,16(4):2567-2573.；c.guo,l.j.kaufrnan.flow and magnetic field induced collagen alignment[j].biomaterials,2007,28(6):1105-1114.)。然而，目前的调控技术所形成的“胶原纤维”实质均为胶原分子形成的纤维状聚集体，并不存在67nm特征d周期结构。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用lb技术模块化组装胶原膜的方法，该制备方法条件温和，在不超过胶原变性温度下通过调控胶原溶液聚集态结构、亚相溶剂体系、滑障移动速度和表面压的协同作用，高度耦合界面胶原分子自组装驱动力与表面宏观力，构建具有67nm d周期且有序定向排列的保持了生物活性的胶原膜；并且该制备
方法条件温和，不破坏胶原结构，其制备所得的胶原膜具有67nm d周期、高度定向、生物相容性好、无毒性的特点，可直接作为生物医学材料应用于生物医学领域。
[0005]
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
[0006]
在一方面，本发明提供了一种利用lb技术模块化组装胶原膜的方法，其主要工艺步骤如下：
[0007]
s1、lb制膜用胶原溶液的配置：
[0008]
将胶原配置为胶原溶液，调节胶原溶液的ph值，并添加包括有机溶剂配置得到胶原聚集体的平均粒径不大于2000nm的lb制膜用胶原溶液；
[0009]
s2、基底lb膜的制备：
[0010]
将步骤s1配置所得lb制膜用胶原溶液温度调节至24～30℃，利用注射器将500～1500μl的lb制膜用胶原溶液均匀分散于lb膜分析仪的亚相表面，经静置待膜压趋近于平衡后，以1～10cm/min的帐片移动速度进行压膜，最后在表面积达10～20cm2的时候帐片停止移动，使表面压稳定在10～30mn/m；
[0011]
其中，所述亚相包括离子强度为0.2～0.5的金属离子溶液，且温度控制在24～30℃，ph值5～9；
[0012]
s3、模块化组装胶原膜：
[0013]
采用竖直拉提法，在保持表面压稳定在10～30mn/m的条件下，将胶原转移至基片上，形成lb单层胶原膜，将基片上的lb单层胶原膜经洗净干燥后，再次采用竖直拉提法，重复上述步骤，将胶原转移至基片上，形成lb叠加胶原膜，即得到胶原膜。
[0014]
如本文中，步骤s1中所述胶原是动物源胶原蛋白，本领域技术人员可选择现有技术中所记载的工业用/实验用动物源胶原蛋白种类，可以通过市售购买，也可以通过自制获得，优选为富含天然胶原的动物生物体组织部分，包括但不限于牛皮、猪皮、鱼皮、羊皮、牛蛙皮、鼠尾、牛跟腱、猪跟腱和羊跟腱中任意一种。
[0015]
在一个技术方案中，步骤s1中所述lb制膜用胶原溶液，其胶原具体浓度可参考本领域胶原lb制膜相关现有技术文件，也可以在0.1～0.7mg/ml质量浓度范围内任意选择。
[0016]
在一个技术方案中，步骤s1中所述调节胶原溶液的ph值，其具体ph值的选择基于本发明主题及技术目的中的胶原自组装，本领域技术人员可根据本领域现有文献记载，清楚知晓胶原的常规的自组装适用ph范围，例如ph值调节至5～9；也应清楚知晓在不破坏胶原结构的前提下常规的胶原用ph调节试剂，例如醋酸溶液。
[0017]
在一个技术方案中，步骤s1中所述有机溶剂为有助于胶原溶液于亚相上的均匀分散，其具体选择可以参考本领域胶原lb制膜的现有文献记载，可以是小分子醇类溶剂(碳链长度不高于c4)，包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙三醇、正丁醇。
[0018]
在一个技术方案中，步骤s1中所述添加包括有机溶剂，可以是仅添加有机溶剂，也可以是添加有机溶剂与其它助剂，其它助剂包括但不限于甲酸、三氯醋酸、酰胺类助剂(例如n-甲基乙酰胺)，其它助剂的使用方法与技术效果以本领域现有技术文件记载为准。
[0019]
请注意的是，上述对于包括ph调节试剂、有机试剂的具体选择和浓度，应满足聚集态指标表征范围为准，即胶原聚集体的平均粒径不大于2000nm。
[0020]
在一个技术方案中，步骤s2中所述亚相包括离子强度为0.2～0.5的金属离子溶液，可以是由该金属离子溶液单独构成亚相，也可以是金属离子溶液与其它亚相助剂共同
构成亚相。所述金属离子溶液，基于本发明主题及技术目的中的胶原自组装，金属离子的选择可以是过渡金属离子，也可以是非过渡金属离子，优选非过渡金属离子，例如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子。所述其它亚相助剂，为lb制膜工艺中所常规使用的亚相助剂，例如edc、nhs、琥珀酸酐，月桂酰氯，其它亚相助剂的使用方法与技术效果以本领域现有技术文件记载为准。
[0021]
在本文中，所述lb膜分析仪，应为采用langmuir-blodgett和langmuir-技术的仪器。
[0022]
在一个技术方案中，在本文中所述lb膜分析仪，其基片是按照竖直拉提法的标准操作规定，将基片竖直夹持。在重复竖直拉提法、形成lb叠加胶原膜过程中，可以一直保持基片的夹持方位，形成取向度一致排布的lb叠加胶原膜；也可以选择调整基片的夹持方位，即滚转基片后转移下一层胶原膜(即在每次胶原转移至基片上前调整基片的夹持方位)，从而达到构建3d结构胶原纤维支架的效果。
[0023]
在一个技术方案中，在本文中所述lb膜分析仪，其基片可以是无机材料基片，包括但不限于硅片、云母片、玻璃片、细胞爬片、铝片、钛片其中任意一种；其基片也可以是有机材料基片，包括但不限于胶原膜片、聚乙烯醇(pva)膜片、明胶海绵片其中任意一种。
[0024]
在一个技术方案中，在本文中所述lb膜分析仪，其基片可以是任意形状的，例如长方形、正方形、梯形、圆形、椭圆形、球形。
[0025]
请注意的是，基于lb制膜的原理常识，基片的单面表面积应小于或等于压膜所设置的表面积。
[0026]
在本文中，所述竖直拉提法，为lb膜分析仪的一种常规操作，具体可以参考lb膜分析仪的操作说明，也可以参考本领域胶原lb制膜的现有文献记载。
[0027]
在一个技术方案中，步骤s3所述采用竖直拉提法，具体提拉速度可以参考本领域胶原lb制膜的现有文献记载，也可以在1～10mm/min的提拉速度范围内任意选择。
[0028]
在一个技术方案中，步骤s3所述将基片上的lb单层胶原膜经洗净干燥后，其具体的洗净干燥方式，可以选择本领域常规的胶原干燥方式或方法，例如低温干燥、真空干燥；洗净方式同理，例如去离子水洗净。
[0029]
在一个优选的技术方案中，步骤s3所述竖直拉提法，保持基片的夹持方位，经重复形成层数为3～5层的lb叠加胶原膜，可以应用于生物医学领域，例如作为皮肤辅料使用。
[0030]
在一个优选的技术方案中，步骤s3所述竖直拉提法，保持基片的夹持方位，经重复形成层数为10～15层的lb叠加胶原膜，可以应用于生物医学领域，例如作为人造类角膜组织使用。
[0031]
在一个优选的技术方案中，步骤s3所述竖直拉提法，定义基片在转移第单数次胶原膜时，基片的夹持方位为角度0
°
，基片在转移第双数次胶原膜时，通过调整基片的夹持方位，滚转基片角度90
°
，经重复形成层数为15～20层的lb叠加胶原膜，可以应用于生物医学领域，例如作为人造类肌腱组织使用。
[0032]
在一个技术方案中，因考虑到步骤s3中多次重复操作，在形成lb叠加胶原膜后，还包括对形成lb叠加胶原膜的灭菌处理，该灭菌处理可以是生物材料领域中常规的灭菌处理方式，例如辐照灭菌。
[0033]
本发明的原理在于，利用lb技术的界面水平推力，耦合胶原组装重排驱动力作用，
从调控胶原聚集态结构出发，达成各关键因素的高度契合，系统构建具有67nm d周期且有序定向排列的2d仿生胶原纤维结构模块，进而模块化组装胶原膜，特别是3d仿生各向异性天然胶原纤维微架构。
[0034]
其中，漂浮于界面的棒状胶原分子受亚相自组装驱动力发生分子重排的同时，由于受到膜障移动产生的水平反方向力，而趋于与膜障平行，从而实现有序定向的生长。
[0035]
在另一方面，本发明提供了上述方法制备所得胶原膜。
[0036]
本发明具有如下有益效果：
[0037]
1、本发明条件温和，在24～30℃低温条件下制备，所得胶原膜保留了未变性胶原特有的三股螺旋结构，保证了胶原蛋白的生物活性。在经过灭菌处理后，安全性高，重金属含量≤10mg/kg，可广泛应用于生物医学领域。
[0038]
2、本发明制备的胶原膜具有各向异性，其天然胶原纤维微架构不仅保持了组织的生物学和结构完整性，且其结构模块呈现的67nmd周期性和有序定向排列的双重结构特征。仿生各向异性胶原纤维微架构的精准调控，对其在细胞培养和组织工程等领域的应用具有重要的指导意义。
[0039]
3、本发明利用lb技术输入界面宏观水平推力，耦合胶原自组装驱动力作用，从调控胶原聚集态结构岀发，系统建立具有67nmd周期且有序定向排列的2d仿生胶原纤维结构模块的调控机制；通过设计叠层方向，模块化组装3d仿生各向异性胶原纤维微架构，进而探究其对细胞行为的指导作用。本发明为仿生各向异性天然胶原纤维的精准调控提供了新的技术策略。
[0040]
说明书附图
[0041]
图1为本发明实施例2制备所得胶原膜的样品照片。因胶原膜层数较少，厚度为纳米级别，几乎完全透明无法肉眼观察。
[0042]
图2为本发明实施例5制备所得胶原膜的afm照片。
[0043]
图3为本发明实施例5制备所得胶原膜的afm照片。通过对图2的进一步放大，从图中可见纤维上出现节状结构，证明自组装形成67nm特征d周期结构。
[0044]
图4为本发明实施例5制备所得胶原膜的afm照片。通过对图3的进一步放大，从图中清晰可见节状结构，证明自组装形成67nm特征d周期结构。
[0045]
图5为本发明对比例5制备所得lb叠加胶原膜的afm照片。可观察到其纤维取向完全混乱。
[0046]
图6为本发明对比例5制备所得lb叠加胶原膜的afm照片。通过对图5的进一步放大，从图中可见纤维上未发现节状结构，证明其未形成自组装67nm特征d周期结构。
[0047]
图7为本发明实施例在制备过程中的照片。图中为lb膜分析仪。
具体实施方式
[0048]
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发
明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。
[0049]
如本文所使用，术语“包括”与“主要包括”同义，并且是包括端点在内或是开放式的，并且不排除额外的未叙述的要素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的技术术语，意思指存在所述要素，但也可以增加其它要素并且仍形成在所述权利要求范围内的要素或方法。
[0050]
本发明提供了一种利用lb技术模块化组装胶原膜的方法，其主要工艺步骤如下：
[0051]
s1、lb制膜用胶原溶液的配置：
[0052]
将胶原配置为胶原溶液，调节胶原溶液的ph值，并添加包括有机溶剂配置得到胶原聚集体的平均粒径不大于2000nm的lb制膜用胶原溶液；
[0053]
s2、基底lb膜的制备：
[0054]
将步骤s1配置所得lb制膜用胶原溶液温度调节至24～30℃，利用注射器将500～1500μl的lb制膜用胶原溶液均匀分散于lb膜分析仪的亚相表面，经静置待膜压趋近于平衡后，以1～10cm/min的帐片移动速度进行压膜，最后在表面积达10～20cm2的时候帐片停止移动，使表面压稳定在10～30mn/m；
[0055]
其中，所述亚相包括离子强度为0.2～0.5的金属离子溶液，且温度控制在24～30℃，ph值5～9；
[0056]
s3、模块化组装胶原膜：
[0057]
采用竖直拉提法，在保持表面压稳定在10～30mn/m的条件下，将胶原转移至基片上，形成lb单层胶原膜，将基片上的lb单层胶原膜经洗净干燥后，再次采用竖直拉提法，重复上述步骤，将胶原转移至基片上，形成lb叠加胶原膜，即得到胶原膜。
[0058]
如本文中，步骤s1中所述胶原是动物源胶原蛋白，本领域技术人员可选择现有技术中所记载的工业用/实验用动物源胶原蛋白种类，可以通过市售购买，也可以通过自制获得，优选为富含天然胶原的动物生物体组织部分，包括但不限于牛皮、猪皮、鱼皮、羊皮、牛蛙皮、鼠尾、牛跟腱、猪跟腱和羊跟腱中任意一种。
[0059]
在一个实施方案中，步骤s1中所述lb制膜用胶原溶液，其胶原具体浓度可参考本领域胶原lb制膜相关现有技术文件，也可以在0.1～0.7mg/ml质量浓度范围内任意选择，例如0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml或它们之间的任何范围或点值。
[0060]
在一个实施方案中，步骤s1中所述调节胶原溶液的ph值，其具体ph值的选择基于本发明主题及技术目的中的胶原自组装，本领域技术人员可根据本领域现有文献记载，清楚知晓胶原的常规的自组装适用ph范围，例如ph值调节至5～9，更进一步具体例如5.5、6、7、8、8.5或它们之间的任何范围或点值；也应清楚知晓在不破坏胶原结构的前提下常规的胶原用ph调节试剂，例如醋酸溶液。
[0061]
在一个实施方案中，步骤s1中所述有机溶剂为有助于胶原溶液于亚相上的均匀分散，其具体选择可以参考本领域胶原lb制膜的现有文献记载，可以是小分子醇类溶剂(碳链长度不高于c4)，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙三醇、正丁醇其中任意一种或多种混合。
[0062]
请注意的是，上述对于ph调节试剂、有机试剂的具体选择和浓度，应满足聚集态指标表征范围为准，即胶原聚集体的平均粒径不大于2000nm。
[0063]
在一个实施方案中，步骤s1中所述添加包括有机溶剂，可以是仅添加有机溶剂，也可以是添加有机溶剂与其它助剂，优选仅添加有机试剂；其它助剂包括但不限于甲酸、三氯醋酸、酰胺类助剂(例如n-甲基乙酰胺)，其它助剂的使用方法与技术效果以本领域现有技术文件记载为准。
[0064]
在一个实施方案中，步骤s2中所述亚相包括离子强度为0.2～0.5的金属离子溶液，可以是由该金属离子溶液单独构成亚相，也可以是金属离子溶液与其它亚相助剂共同构成亚相。所述金属离子溶液，基于本发明主题及技术目的中的胶原自组装，金属离子的选择可以是过渡金属离子，也可以是非过渡金属离子，优选非过渡金属离子，例如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子其中任意一种。所述其它亚相助剂，为lb制膜工艺中所常规使用的亚相助剂，例如edc、nhs、琥珀酸酐、月桂酰氯其中任意一种或多种，其它亚相助剂的使用方法与技术效果以本领域现有技术文件记载为准。
[0065]
在本文中，所述lb膜分析仪，应为采用langmuir-blodgett和langmuir-技术的仪器。
[0066]
在一个实施方案中，在本文中所述lb膜分析仪，其基片是按照竖直拉提法的标准操作规定，将基片竖直夹持。在重复竖直拉提法、形成lb叠加胶原膜过程中，可以一直保持基片的夹持方位，形成取向度一致排布的lb叠加胶原膜；也可以选择调整基片的夹持方位，即滚转基片后转移下一层胶原膜，从而达到构建3d仿生各向异性结构胶原纤维支架的效果，基于夹持方位的不同，基片可滚转角度为0～360
°
，例如5
°
、10
°
、15
°
、20
°
、30
°
、40
°
、45
°
、50
°
、60
°
、70
°
、75
°
、80
°
、90
°
、120
°
、150
°
、180
°
、210
°
、240
°
、270
°
、300
°
、330
°
、360
°
或它们之间的任何点值。
[0067]
在一个实施方案中，在本文中所述lb膜分析仪，其基片可以是无机材料基片，包括但不限于硅片、云母片、玻璃片、细胞爬片、铝片、钛片其中任意一种；其基片也可以是有机材料基片，包括但不限于胶原膜片、聚乙烯醇(pva)膜片、明胶海绵片其中任意一种。
[0068]
在一个实施方案中，在本文中所述lb膜分析仪，其基片可以是任意形状的，例如长方形、正方形、梯形、圆形、椭圆形、球形。
[0069]
请注意的是，基于lb制膜的原理常识，基片的单面表面积应小于或等于压膜所设置的表面积。
[0070]
在本文中，所述竖直拉提法，为lb膜分析仪的一种常规操作，具体可以参考lb膜分析仪的操作说明，也可以参考本领域胶原lb制膜的现有文献记载。
[0071]
在一个实施方案中，步骤s3所述采用竖直拉提法，具体提拉速度可以参考本领域胶原lb制膜的现有文献记载，也可以在1～10mm/min的提拉速度范围内任意选择，例如1.5mm/min、2mm/min、3mm/min、4mm/min、5mm/min、6mm/min、7mm/min、8mm/min、9mm/min、9.5mm/min或它们之间的任何范围或点值。
[0072]
在一个实施方案中，步骤s3所述将基片上的lb单层胶原膜经洗净干燥后，其具体的洗净干燥方式，可以选择本领域常规的胶原干燥方式或方法，例如低温干燥、真空干燥；洗净方式同理，例如去离子水洗净。
[0073]
在一个优选的实施方案中，步骤s3所述基片水平向设置，经重复形成层数为3～5
层的lb叠加胶原膜，可以应用于生物医学领域，例如作为皮肤辅料使用。
[0074]
在一个优选的实施方案中，步骤s3所述基片水平向设置，经重复形成层数为10～15层的lb叠加胶原膜，可以应用于生物医学领域，例如作为人造类角膜组织使用。
[0075]
在一个优选的实施方案中，步骤s3所述竖直拉提法，定义基片在转移第单数次胶原膜时，基片的夹持方位为角度0
°
，基片在转移第双数次胶原膜时，通过调整基片的夹持方位，滚转基片角度90
°
，经重复形成层数为15～20层的lb叠加胶原膜，可以应用于生物医学领域，例如作为人造类肌腱组织使用。
[0076]
在一个实施方案中，因考虑到步骤s3中多次重复操作，在形成lb叠加胶原膜后，还包括对形成lb叠加胶原膜的灭菌处理，该灭菌处理可以是生物材料领域中常规的灭菌处理方式，例如辐照灭菌。
[0077]
以下将参考实施例对本技术进行进一步的详细解释。然而，本领域技术人员应理解，这些实施例仅为了说明的目的提供，而不是意图限制本技术。
[0078]
实施例
[0079]
下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本技术，而不应视为限定本技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本技术不应解释为受限于所述的具体实施例。
[0080]
1.制备方法
[0081]
s1、lb制膜用胶原溶液的配置：
[0082]
按重量份数计，将来源于牛皮的胶原1份(理论重量，也可视为干重)，与1800份0.1mol/l摩尔浓度的醋酸溶液和200份异丙醇混合，于4℃温度条件下搅拌8h，配置得到胶原聚集体的平均粒径为不大于2000nm(胶原为1份时，平均粒径为1586.2nm)的lb制膜用胶原溶液；
[0083]
s2、基底lb膜的制备：
[0084]
将步骤s1配置所得lb制膜用胶原溶液温度调节至24～30℃，利用注射器将500～1500μl的lb制膜用胶原溶液均匀分散于lb膜分析仪的亚相表面，经静置待膜压趋近于平衡后，以1～10cm/min的帐片移动速度进行压膜，最后在表面积达10～20cm2的时候帐片停止移动，使表面压稳定在10～30mn/m；
[0085]
其中，所述亚相是离子强度为0.2～0.5的钠离子溶液，且温度控制在24～30℃，ph值5～9；
[0086]
s3、模块化组装胶原膜：
[0087]
采用竖直拉提法，在保持表面压稳定在10～30mn/m的条件下，将胶原转移至基片上，形成lb单层胶原膜，将基片上的lb单层胶原膜经洗净干燥后，再次采用竖直拉提法，重复上述步骤，将胶原转移至基片上，形成lb叠加胶原膜，即得到胶原膜。
[0088]
2.测试方法
[0089]
下述实施例及对比例所制得的胶原膜，其表面压、取向度、转移比、层数及厚度是通过以下设备并采用现有技术测定得到。
[0090]
使用lb膜分析仪(jml04)测定胶原膜的表面压和转移比。
[0091]
使用imagej中的插件orientationj分析计算胶原膜中纤维的取向度。
[0092]
使用椭偏仪器测定胶原膜的厚度。
[0093]
使用紫外吸收光谱仪测定胶原膜的层数。
[0094]
使用重金属检测仪测定胶原膜中重金属含量。
[0095]
实施例1～4、对比例1～2
[0096]
实施例1～4、对比例1～2研究了当以亚相温度条件作为变量时，其对制备所得胶原膜是否自组装形成67nm特征d周期结构以及纤维同一方向取向度的影响，如下表所示：
[0097]
表1：以亚相温度条件为变量
[0098][0099]
通过上表结果可发现，温度过低时胶原不会发生自组装形成d周期；温度在适宜范围内时会发生自组装且胶原纤维定向排布(高取向度)；但继续提高温度条件时，由于自组装发生的过快，导致lb压膜时间与自组装时间无法匹配，出现分子叠层现象和空洞区域，且取向度下降。
[0100]
实施例5～8、对比例3～4
[0101]
实施例5～8、对比例3～4研究了当以亚相离子强度条件作为变量时，其对制备所得胶原膜是否自组装形成67nm特征d周期结构以及纤维同一方向取向度的影响，如下表所示：
[0102]
表2：以亚相离子强度条件为变量(亚相温度统一为25℃)
[0103][0104]
通过上表结果可发现，离子强度过低时自组装难以发生；离子强度在适宜范围内
时，促进胶原自组装形成d周期，且纤维排布方向性良好；继续增加亚相的离子强度时，虽自组装能够发生，但出现分子叠层现象和空洞区域，纤维排布有序性下降；离子强度过高抑制自组装的发生，不能形成d周期。
[0105]
对比例5
[0106]
本对比例采用超纯水作为亚相，其余条件与实施例2一致。
[0107]
制备所得胶原膜肉眼观察与实施例2一致，但经afm形貌图可知，其未形成自组装67nm特征d周期结构，以及可观察到其纤维取向完全混乱。
[0108]
对比例6
[0109]
本对比例采用2份胶原配置lb制膜用胶原溶液(相当于胶原质量浓度为1mg/ml)，其胶原聚集体的平均粒径为大于2000nm，其余条件与实施例2一致。
[0110]
制备所得胶原膜肉眼观察与实施例2一致，但经afm形貌图可知，虽然其自组装形成了67nm特征d周期结构，但可观察到其纤维取向完全混乱，同对比例5一致。
[0111]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代,组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。