CX3CL1的增强剂或者抑制剂在制备治疗色素沉着异常性皮肤病药物中的应用

cx3cl1的增强剂或者抑制剂在制备治疗色素沉着异常性皮肤病药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及cx3cl1的增强剂或者抑制剂在制备治疗色素沉着异常性皮肤病药物中的应用。


背景技术：

2.色素沉着异常性皮肤病是继发于炎症性皮肤病、激光治疗术后和外部刺激等而出现的皮肤色素沉着增多或色素减退，其持续时间长且难以自行消退。色素沉着异常是色素细胞黑素生成增多或减少，以及黑素分布异常的反应性过程，此过程受到多种炎症因子、炎症介质以及活性氧等的刺激。但目前炎症因子引起色素沉着异常的机制尚不完全清楚，因此深入研究炎症因子在黑素生成中的作用及具体机制，对寻找色素沉着异常性皮肤病的治疗新靶点具有重要意义。
3.趋化因子作为炎症因子的一大种类，参与多种炎症性疾病的发生发展，其中cx3cl1作为趋化因子家族的特例，仅结合其唯一的受体 cx3cr1，并通过cx3cl1-cx3cr1轴影响下游炎症级联反应，进而参与动脉粥样硬化、骨关节炎和（炎性）乳腺癌等多种疾病的病理生理过程。也有研究表明在银屑病等炎症性皮肤病中cx3cl1在角质形成细胞里高表达。但cx3cl1是否参与调控黑素生成尚无文献报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的是探究cx3cl1在黑素生成中的调控作用，提供一种新的治疗色素沉着异常性皮肤病的药物。
5.本发明的技术方案是：cx3cl1的增强剂或者抑制剂在制备治疗色素沉着异常性皮肤病药物中的应用。
6.优选方案，所述色素沉着异常性皮肤病包括色素沉着增多性皮肤病以及色素减少性皮肤病。优选方案，所述色素减少性皮肤病包括白癜风、炎症后色素减退等。
7.优选方案，所述色素增加性皮肤病包括黄褐斑、雀斑、咖啡斑、炎症后色素沉着等。
8.本发明还提供了cx3cl1的增强剂或者抑制剂作为酪氨酸酶活性增强剂或者抑制剂中的应用。
9.本发明的实验结果发现cx3cl1处理人色素细胞和皮肤后，其黑素含量明显增多，黑素生成关键基因mitf、tyr、tyrp1、dct的表达水平也显著上调。本研究结果提示cx3cl1可能通过增强酪氨酸酶活性的途径促进了黑素生成，可以作为色素沉着异常性皮肤病的候选治疗药物或治疗靶点。
10.以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
附图说明
11.图1是在黄褐斑数据集gse72140中分析cx3cl1与黑素生成的相关性图。
12.图2是100ng/ml cx3cl1处理色素细胞后，氨银染色法检测细胞黑素含量图。
13.图3是100ng/ml cx3cl1处理皮肤组织后，氨银染色法检测人包皮组织黑素含量图。
14.图4是100ng/ml cx3cl1处理色素细胞后，qrt-pcr检测黑素生成关键基因mrna表达情况图。
15.图5是100ng/ml cx3cl1处理色素细胞后，l-dopa法测定酪氨酸酶活性图。
16.图6是在湿疹数据集gse6012中分析cx3cl1在皮损组（eczema）与非皮损组（non_lesion）中mrna表达情况的箱式图.图7是在痤疮数据集gse53795中分析cx3cl1在皮损组（acne）与非皮损组（non_lesion）中mrna表达情况的箱式图。
17.图8是在斑秃数据集gse68801中分析cx3cl1在皮损组（aa）与非皮损组（non_lesion）中mrna表达情况的箱式图。
具体实施方式
18.实验方法：1、细胞培养和处理黑素生成研究工具细胞mnt1在含有20％胎牛血清（美森, 中国浙江）, 1%非必需氨基酸（gibco, 美国）, 1％青霉素-链霉素抗生素（biosharp, 中国合肥）和100ng/ml cx3cl1 (cloud-clone corp, 中国武汉)的dmem培养基（gibco, 美国）中培养24或48小时。细胞培养于37℃且含5％co2的培养箱中。
19.2、人体皮肤培养经捐献者和湘雅三医院伦理委员会批准，从包皮环切术后的健康男性包皮中获取人皮肤样本。从包皮样本中去除皮下组织和脂肪，然后将包皮切成2 cm2的切片。皮肤切片放置在含10%fbs、1%青霉素/链霉素/两性霉素b和100ng/ml cx3cl1的dmem培养基上，表皮朝上，真皮向下。培养皿在37℃和5%co2下培养5天。
20.3、氨银染色用4%中性多聚甲醛（biosharp，中国合肥）固定细胞30分钟后，使用氨银试剂盒（sloarbio，中国北京）以染色黑色素。通过倒置显微镜（奥林巴斯 x71）观察并记录黑色素。
21.4、qrt-pcr通过快速提取rna试剂盒（fastagen, 中国上海）提取总rna，并使用逆转录试剂盒（transgen，中国北京）逆转为cdna。qpcr supermix (transgen，中国北京) 用于qrt-pcr分析。所有反应均在实时pcr仪器（roche lightcycler480ii，德国）上进行。mrna表达量的计算以gapdh为内参。
22.5、酪氨酸酶活性测定将收集后的细胞与500μl 0.5%脱氧胆酸钠溶液在4
°
c下共培养15分钟以裂解细胞，然后在37
°
c下培养10分钟。添加1 ml 1%左旋多巴溶液后，立即用移液管将200μl移到96孔板中。使用多模平板读取器在0分钟（a0）和30分钟（a30）时测量475 nm处的吸光度。tyr活
性计算为（a30-a0）/细胞数。
23.、统计分析使用graphpad prism 8.0.2软件进行统计学分析，两样本间比较均采用t检验。p 《0.05被认为具有统计学意义，*表示p 《0.05，**表示p 《0.01。
24.实验结果：1、cx3cl1可促进黑素生成我们在黄褐斑数据集gse72140中行相关性分析，发现cx3cl1与黑素生成高度正相关（图1）；随后使用100ng/ml cx3cl1处理黑素细胞或皮肤组织：通过氨银染色法检测色素细胞（图2）和人包皮切片（图3）的黑素含量，发现与未处理组相比，cx3cl1处理组黑色素含量均增加；同时qrt-pcr 检测发现 mitf、tyr、tyrp1 及dct等黑素生成相关基因的表达也上调（图4）；此外，cx3cl1还能增强mnt1细胞中的酪氨酸酶活性（图5）。
25.2、cx3cl1在各种皮肤疾病中的表达情况我们在湿疹数据集gse6012，痤疮数据集gse53795以及斑秃数据集gse68801中分析了cx3cl1在皮损组与非皮损组中mrna的表达情况，发现无显著差异性，提示cx3cl1可能与湿疹，痤疮以及斑秃的发生发展无相关性。
26.实验结论：本发明的实验结果发现cx3cl1处理人色素细胞和皮肤后，其黑素含量明显增多，黑素生成关键基因mitf、tyr、tyrp1、dct的表达水平也显著上调，同时酪氨酸酶活性也显著增强。本研究结果提示cx3cl1可能通过增强酪氨酸酶活性的途径促进了黑素生成，可以作为色素沉着异常性皮肤病的候选治疗药物或治疗靶点。