一种纳米尺度的多功能sirna递送载体及其制备方法
技术领域
1.本发明属于sirna递送载体技术领域，具体涉及一种纳米尺度的多功能sirna递送载体及其制备方法。
背景技术：
2.外泌体(exosome)是由大多数生物细胞分泌的一种生物纳米粒子，直径约30至100nm，具有典型的脂质双分子层膜结构。外泌体具有类似于病毒的转染机制，在体内具有较高的转染效率，且它不仅具有细胞间信息传递的作用还能被开发运用于各类物质(包括sirna)的细胞间传输。与传统的药物载体相比，外泌体作为一种新型的，天然药物载体，显示诸如生物相容性好、生物可降解、免疫原性小等优点。然而现有技术中人工合成的sirna递送载体的递送效率差，载体活性度不高，递送动力不足，基于此，研究开发一种载体活性度高、具有优异的递送效率的多功能sirna递送载体成为当前亟待研究的重要课题。
3.纳米是一个尺度，纳米材料是指在三维空间中，至少有一维处于纳米尺寸的范围，也即1～100纳米的范围。纳米材料具有小尺寸效应、表面效应和宏观量子随药效应，因而展现出许多特有的性质，在催化、滤光、光吸收、医药、磁介质及新材料等有广泛的应用前景；纳米二氧化硅由于是超细纳米级，尺寸范围在1～100nm，因此具有许多独特的性质，如具有对抗紫外线的光学性能，能提高其他材料抗老化、强度和耐化学性能等，用途非常广泛。纳米级二氧化硅为无定形白色粉末，无毒、无味、无污染，微结构为球形，呈絮状和网状的准颗粒结构，分子式为sio2。
技术实现要素：
4.针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。本发明的创新点在于：纳米添加剂采用复合多孔碳改性的纳米二氧化硅经过海藻酸钠溶液分散，再经过活化处理，得到的纳米添加剂具有高效的活性性能，能够满足递送载体的效果；复合多孔碳改性的纳米二氧化硅通过将纳米二氧化硅先经过柠檬酸钠溶液、草酸处理，得到改性的纳米二氧化硅，然后将多孔碳在水中分散，得到高比表面积的原料，通过与改性的纳米二氧化硅溶液经过复合改进，改性的产品具有高效的承载表面积，同时与其他原料复配混合后，制备的多功能sirna递送载体的载体活性度高，具有优异的递送效率。
5.本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤一：将sirna溶解于2-3倍(重量)的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
8.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到3-6倍(重量)的海藻酸钠溶液中搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量10-15％的磷酸缓冲溶液，搅拌混合充分，得到纳米添加剂；
9.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5～1:1混合，然后再加入纳
米添加剂总量1-5％的琼脂糖珠，且粒径为5-10目，琼脂糖珠为invitrogen高纯度的琼脂糖珠，继续搅拌混合10-60min；
10.步骤四：再经过超声分散处理，超声结束，最后于35-37℃下静置1-2h，得到多功能sirna递送载体。
11.优选地，步骤二中所述磷酸缓冲溶液的ph为5.5-6.0。
12.优选地，步骤二中所述海藻酸钠溶液的质量分数为10-20％。
13.优选地，步骤二中所述搅拌混合的转速为1000-1500r/min，搅拌时间为20-30min。
14.优选地，步骤三中所述搅拌混合的转速为800-1200r/min。
15.优选地，步骤四中超声分散的超声功率为200-240w，处理5-10min。
16.优选地，步骤二中所述复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法包括以下步骤：
17.s01：将5-10份纳米二氧化硅加入到15-20份柠檬酸钠溶液中，随后再加入1-4份草酸，搅拌处理；
18.s02：将多孔碳进行研磨，研磨后过50-100目的1重量份样品送入到4-7重量份水中，搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
19.s03：将多孔碳分散液加入到3-5倍(重量)的s01产物中，超声分散，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
20.优选地，s01中搅拌处理具体为以300-500r/min的转速搅拌10-20min。
21.优选地，s01中所述柠檬酸钠溶液的质量分数为15-20％。
22.优选地，s03中所述超声分散的超声功率为400-500w，超声时间为15-25min。
23.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
24.本发明的sirna递送载体采用sirna溶解于2-3倍的pbs缓冲液中，得到sirna溶液，通过纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，加入琼脂糖珠经过搅拌、超声和静置处理，得到的sirna递送载体具有优异的递送效率，纳米添加剂采用复合多孔碳改性的纳米二氧化硅经过海藻酸钠溶液分散，再经过活化处理，得到的纳米添加剂具有高效的活性性能，能够满足递送载体的效果；复合多孔碳改性的纳米二氧化硅通过纳米二氧化硅先经过柠檬酸钠溶液、草酸处理，得到改性的纳米二氧化硅，然后将多孔碳在水中分散，得到高比表面积的原料，通过与改性的纳米二氧化硅液经过复合改进，改性的产品具有高效的承载表面积，同时与其他原料复配混合后，制备的多功能sirna递送载体具有优异的递送效率，载体活性度高，递送动力强，解决了现有技术的存在的技术问题。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本实施例提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
27.步骤一：将sirna溶解于2-3倍(重量)的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
28.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到3-6倍(重量)的海藻酸钠溶液
(质量分数为10-20％)中搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量10-15％磷酸缓冲溶液(ph为5.5-6.0)，搅拌混合充分(搅拌转速为1000-1500r/min，搅拌时间为20-30min)，得到纳米添加剂；
29.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，然后再加入纳米添加剂总量1-5％的琼脂糖珠(粒径为5-10目，琼脂糖珠为invitrogen高纯度的琼脂糖珠)，继续搅拌混合(转速为800-1200r/min)10-20min；
30.步骤四：再经过超声分散处理5-10min，超声功率为200-240w，超声结束，最后于35-37℃下静置1-2h，得到多功能sirna递送载体。
31.本实施例的复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法包括如下步骤：
32.s01：将5-10份纳米二氧化硅加入到15-20份柠檬酸钠溶液(质量分数为15-20％)中，随后再加入1-4份草酸，先以300-500r/min的转速搅拌10-20min；
33.s02：将多孔碳加入到研磨机中进行研磨，研磨后过50-100目的1重量份样品送入到4-7重量份的水中，搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
34.s03：将多孔碳分散液加入到3-5倍(重量)的s01产物中，超声分散充分(超声功率为400-500w，超声时间为15-25min)，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
35.实施例1.
36.本实施例提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
37.步骤一：将sirna溶解于2倍的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
38.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到3倍的海藻酸钠溶液(质量分数为10％)中搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量10％的磷酸缓冲溶液(ph为5.5)，搅拌混合充分(搅拌混合充分的转速为1000r/min，搅拌时间为20min)，得到纳米添加剂；
39.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，然后再加入纳米添加剂总量1％的琼脂糖珠，继续搅拌混合(转速为800r/min)10min；
40.步骤四：再经过超声分散处理5min，超声功率为200w，超声结束，最后于35℃下静置1h，得到多功能sirna递送载体。
41.本实施例的复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
42.s01：将5份纳米二氧化硅加入到15份柠檬酸钠溶液(质量分数为15％)中，随后再加入1份草酸，先以300r/min的转速搅拌10min；
43.s02：将多孔碳加入到研磨机中进行研磨，研磨后过50目的1重量份样品送入到4重量份的水中搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
44.s03：将多孔碳分散液加入到3倍(重量)的s01产物中，超声分散充分(超声分散的超声功率为400w，超声时间为15min)，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
45.实施例2.
46.本实施例提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
47.步骤一：将sirna溶解于3倍的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
48.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到6倍的海藻酸钠溶液(质量分数为20％)搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量15％的磷酸缓冲溶液(ph为6.0)，搅拌混
合充分(转速为1500r/min，搅拌时间为30min)，得到纳米添加剂；
49.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，然后再加入纳米添加剂总量5％的琼脂糖珠，继续搅拌混合(转速为1200r/min)20min；
50.步骤四：再经过超声分散处理10min，超声功率为240w，超声结束，最后于37℃下静置2h，得到多功能sirna递送载体。
51.本实施例的复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
52.s01：将10份纳米二氧化硅加入到20份柠檬酸钠溶液(质量分数为20％)中，随后再加入4份草酸，先以500r/min的转速搅拌20min；
53.s02：将多孔碳加入到研磨机中进行研磨，研磨后过100目的1重量份样品送入到7重量份的水中搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
54.s03：将多孔碳分散液加入到5倍(重量)的s01产物中，超声分散充分(超声功率为500w，超声时间为25min)，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
55.实施例3.
56.本实施例提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
57.步骤一：将sirna溶解于2.5倍的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
58.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到4.5倍的海藻酸钠溶液(质量分数为15％)中搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量12.5％的磷酸缓冲溶液(ph为5.7)，搅拌混合充分(转速为1250r/min，搅拌时间为25min)，得到纳米添加剂；
59.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，然后再加入纳米添加剂总量3％的琼脂糖珠，继续搅拌混合(转速为1000r/min)15min；
60.步骤四：再经过超声分散处理7.5min，超声功率为220w，超声结束，最后于36℃下静置1.5h，得到多功能sirna递送载体。
61.本实施例的复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
62.s01：将7.5份纳米二氧化硅加入到17.5份柠檬酸钠溶液(质量分数为17.5％)中，随后再加入2.5份草酸，先以400r/min的转速搅拌15min；
63.s02：将多孔碳加入到研磨机中进行研磨，研磨后过50目的1重量份样品送入到5重量份的水中搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
64.s03：将多孔碳分散液加入到4倍(重量)的s01产物中，超声分散充分(超声分散的超声功率为450w，超声时间为20min)，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
65.实施例4.
66.本实施例提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
67.步骤一：将sirna溶解于2.2倍的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
68.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到4倍的海藻酸钠溶液中(质量分数为12％)搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量12％的磷酸缓冲溶液(ph为5.6)，搅拌混合充分(搅拌混合充分的转速为1200r/min，搅拌时间为22min)，得到纳米添加剂；
69.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，然后再加入纳米添加剂总量2％的琼脂糖珠，继续搅拌混合(转速为1000r/min)12min；
70.步骤四：再经过超声分散处理6min，超声功率为210w，超声结束，最后于36℃下静
置1.2h，得到多功能sirna递送载体。
71.本实施例的复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
72.s01：将6份纳米二氧化硅加入到16份柠檬酸钠溶液(质量分数为16％)中，随后再加入2份草酸，先以320r/min的转速搅拌12min；
73.s02：将多孔碳加入到研磨机中进行研磨，研磨后过60目的1重量份样品送入到5重量份的水中搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
74.s03：将多孔碳分散液加入到3.5倍(重量)的s01产物中，超声分散充分(超声功率为420w，超声时间为16min)，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
75.实施例5.
76.本实施例提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
77.步骤一：将sirna溶解于2.8倍的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
78.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到5倍的海藻酸钠溶液(质量分数为18％)中搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量12％的磷酸缓冲溶液(ph为5.8)，搅拌混合充分(转速为1200r/min，搅拌时间为28min)，得到纳米添加剂；
79.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，然后再加入纳米添加剂总量4％的琼脂糖珠，继续搅拌混合(转速为1100r/min)18min；
80.步骤四：再经过超声分散处理8min，超声功率为235w，超声结束，最后于36℃下静置1.8h，得到多功能sirna递送载体。
81.本实施例的复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
82.s01：将8份纳米二氧化硅加入到14份柠檬酸钠溶液(质量分数为18％)中，随后再加入3份草酸，先以400r/min的转速搅拌18min；
83.s02：将多孔碳加入到研磨机中进行研磨，研磨后过50目的1重量份样品送入到6重量份的水中搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
84.s03：将多孔碳分散液加入到4.5倍(重量)的s01产物中，超声分散充分(超声分散的超声功率为480w，超声时间为22min)，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
85.实施例6.
86.本实施例提供一种纳米尺度的多功能sirna递送载体的制备方法，包括以下步骤：
87.步骤一：将sirna溶解于2.6倍的pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
88.步骤二：将复合多孔碳改性的纳米二氧化硅送入到4.2倍的海藻酸钠溶液(质量分数为18％)中搅拌处理，随后再加入海藻酸钠溶液总量12％的的磷酸缓冲溶液(ph为5.8)，搅拌混合充分(搅拌混合充分的转速为1450r/min，搅拌时间为28min)，得到纳米添加剂；
89.步骤三：随后将纳米添加剂、sirna溶液按照重量比1:5混合，然后再加入纳米添加剂总量3％的琼脂糖珠，继续搅拌混合(转速为1100r/min)12min；
90.步骤四：再经过超声分散处理6min，超声功率为235w，超声结束，最后于36℃下静置1.8h，得到多功能sirna递送载体。
91.本实施例的复合多孔碳改性的纳米二氧化硅的制备方法为：
92.s01：将8份纳米二氧化硅加入到18份柠檬酸钠溶液(质量分数为18％)中，随后再加入3份草酸，先以400r/min的转速搅拌18min；
93.s02：将多孔碳加入到研磨机中进行研磨，研磨后过50目的1重量份样品送入到6重量份的水中搅拌分散均匀，得到多孔碳分散液；
94.s03：将多孔碳分散液加入到4.5倍(重量)的s01产物中，超声分散充分(超声分散的超声功率为490w，超声时间为22min)，超声结束，水洗、干燥，得到复合多孔碳改性的纳米二氧化硅。
95.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
96.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。