一种具有铜死亡、光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料及其制备方法和应用

1.本发明属于纳米材料技术领域，尤其涉及一种具有铜死亡、光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.依靠消耗肿瘤内葡萄糖的饥饿治疗代表了一种重要的抗肿瘤治疗策略。其中作为一种生物催化剂，葡萄糖氧化酶(glucose oxidase；gox)可以有效消耗肿瘤微环境中的葡萄糖和氧气，并提高酸性、低氧和过氧化氢的水平，从而阻断肿瘤细胞的能量供应，实现非侵袭的饥饿治疗。但由于其他类型细胞(如免疫细胞、干细胞)也进行有氧糖酵解，基于消耗葡萄糖的饥饿治疗策略经常对正常细胞产生严重的并发毒性。因此，在治疗模式中引入智能纳米材料的设计概念，在高特异性消耗肿瘤内葡萄糖的同时，降低系统毒性，对提高饥饿治疗的安全性和疗效十分重要。
3.配位聚合物是一类由金属离子与有机配体通过配位键连接而成的功能材料。由于配位聚合物的结构/功能可设计性、高负载率和高生物相容性，其作为纳米载体被广泛应用于生物成像、肿瘤治疗和基因转染等。但在饥饿治疗方面，可选择配位聚合物种类匮乏，并且多数不具有肿瘤微环境响应性以及治疗性，需要结合其他药物修饰才能达到联合治疗的目的，增大了药物剂量以及所带来的安全问题。
4.因此有必要开发一种新的具有低毒性、肿瘤微环境响应性以及治疗性的配位聚合物纳米材料。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种具有铜死亡、光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料。
6.本发明还提供了一种具有铜死亡、光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料的制备方法。
7.本发明还提供了一种抗肿瘤药物。
8.本发明还提供了一种具有铜死亡、光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料的应用。
9.本发明的第一方面提供了一种具有铜死亡、光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料，所述配位聚合物材料包括载体和酶，所述酶负载在所述载体的内部，所述酶为葡萄糖氧化酶或者具有类葡萄糖氧化酶活性的模拟酶；所述载体为1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物。
10.本发明提供的配位聚合物材料包括载体和酶，由于载体1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物将酶包裹，血液中的葡萄糖无法进入材料内部与负载的葡萄糖氧化酶(gox)反应，抑制了gox与血糖的反应从而降低了gox的系统毒性。由于实体瘤的高通透性和滞留(epr)效
应，配位聚合物纳米材料会在肿瘤组织聚集，被癌细胞吞噬后，在癌细胞高表达的谷胱甘肽(gsh)降解下产生亚铜离子，并释放出负载的gox。释放的gox催化癌细胞内的葡萄糖发生氧化反应形成过氧化氢，进行饥饿治疗。伴随着gsh和葡萄糖的消耗，释放后的亚铜离子cu(i)能更有效地与脂酰化的线粒体酶结合，产生脂酰化的dlat聚集，导致配位聚合物纳米材料介导的铜死亡。此外，同时配位聚合物在808nm激发下可催化过氧化氢分解产生
·
oh，最终实现将饥饿治疗与铜死亡和光动力治疗相结合，可获得更大的协同效应，有望高效、安全地抑制肿瘤生长。
11.本发明关于配位聚合物纳米材料的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
12.本发明的配位聚合物纳米材料中的gox能够在肿瘤细胞中特异性释放出来，能催化肿瘤细胞中的葡萄糖氧化，消耗其中的葡萄糖及氧气，并提高酸性、低氧和过氧化氢的水平，从而阻断肿瘤细胞的能量供应，实现饥饿治疗。同时饥饿治疗产生的过氧化氢又可以成为1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物发生光动力反应的原料，增强了i型光动力治疗效果，最终实现高效的光动力联合饥饿治疗。另一方面，伴随着gsh和葡萄糖的消耗，释放后的亚铜离子cu(i)能更有效地与脂酰化的线粒体酶结合，产生脂酰化的dlat聚集，导致配位聚合物纳米材料介导的铜死亡。该方法具有以下优点：
13.(1)该纳米材料可以诱导铜死亡，并且铜死亡可以与其他疗法联合使用来协同降低肿瘤生长。
14.(2)该纳米材料无孔的结构形成了饥饿治疗的保护屏障，无需额外的药物修饰就能降低gox的系统毒性，使之在体循环过程中不会与血糖反应而产生有毒的过氧化氢，大大提高了饥饿治疗的安全性。
15.(3)该纳米材料表现出卓越的癌细胞靶向性，能特异性地在肿瘤细胞中释放gox，进行肿瘤细胞特异性的铜死亡、光动力联合饥饿治疗，而不会对正常细胞产生毒害，有望作为饥饿治疗的安全纳米载体。
16.(4)1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物即作为酶的细胞递送载体用于饥饿治疗和铜死亡。本身又作为光敏剂用于缺氧耐受性i型光动力治疗，无需结合其他药物修饰便能达到联合治疗的目的，减少药物剂量的同时实现高效的联合治疗。
17.(5)联合饥饿治疗及i型光动力治疗，在细胞水平及动物水平上均展现出了高的抗肿瘤功效，表明该多功能纳米药物有希望作为饥饿治疗、铜死亡和光动力协同的治疗平台而用于癌症治疗中，具有良好的应用前景。
18.根据本发明的一些实施方式，所述配位聚合物纳米材料中酶的负载量为10～30％。
19.根据本发明的一些实施方式，所述1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物属于单斜晶系、p-1空间群，晶胞参数为：α＝79.648(4)
°
，β＝79.043(3)
°
，γ＝78.855(4)
°
。
20.本发明的第二方面提供所述配位聚合物纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
21.将酶、cu2o与1,2,4-三氮唑混合进行反应，经过固液分离得到配位聚合物纳米材料。
22.本发明的配位聚合物纳米材料能在温和的条件下快速生成，保证酶活性不会损
失、制备简单、原料容易获得，易于实现大规模的工业化生产。
23.根据本发明的一些实施方式，所述酶、cu2o与1,2,4-三氮唑的质量比为1：(4～8)：(3～6)。
24.根据本发明的一些实施方式，所述反应的时间为30～60min。
25.根据本发明的一些实施方式，所述还原剂包括抗坏血酸或水合肼。
26.根据本发明的一些实施方式，所述保护气氛包括氮气或氩气。
27.根据本发明的一些实施方式，所述cu2o通过如下方法制备：将铜盐在还原剂和无机碱的条件下反应生成cu2o。
28.根据本发明的一些实施方式，所述无机碱包括氢氧化钠或氢氧化钾。
29.本发明的第三方面提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括上述具有光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料。
30.本发明的第四方面提供一种具有光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
附图说明
31.图1是本发明的原理示意图；
32.图2是1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物xrd图；
33.图3是蛋白质电泳结果图；
34.图4是1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物、gox和实施例1配位聚合物的红外光谱图；
35.图5是1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物和实施例1配位聚合物的sem图；
36.图6是gox、实施例1和对比例1配位聚合物的酶催化活性效果图；
37.图7是实施例1配位聚合物在超声前后的酶活性对比图；
38.图8是zif-8、对比例2的配位聚合物、1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物和实施例1的配位聚合物的bet测试图；
39.图9是1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物和实施例1配位聚合物对mcf-7的毒性数据图；
40.图10是gox、实施例1和对比例2的配位聚合物对癌细胞和正常细胞的毒性数据图；
41.图11是铜死亡抑制剂uk5099(上)和antimycin a(下)对gox、1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物及实施例1配位聚合物的细胞毒性影响图；
42.图12是不同处理后的5637细胞内dlat的寡聚现象图；
43.图13是实施例1配位聚合物在过氧化氢和808nm激发后apf的荧光值；
44.图14是流式细胞术分析实施例1配位聚合物的癌细胞凋亡率；
45.图15是不同治疗组肿瘤体积随时间变化数据图。
具体实施方式
46.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
47.本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
48.以下实施例及对比例中采用的原料如下：
49.癌细胞：人乳腺癌细胞mcf-7和人膀胱癌细胞5637购自中科院上海生物科学研究所细胞资源中心。
50.正常细胞：人正常乳腺上皮细胞mcf-10a购自中科院上海生物科学研究所细胞资源中心。
51.老鼠：雌性balb/c裸鼠(6-8周)购于广东省医学实验动物中心，经中山大学动物使用与护理委员会批准使用。所有动物实验均按照国家《实验动物护理和使用条例》进行。
52.gox@zif-8纳米颗粒：首先将1.314g hmim溶于20ml的50mm hepes缓冲液中，充分搅拌溶解，然后向混合溶液中加入0.073g zn(ch3coo)2，室温搅拌反应半小后，形成乳白色悬浊液，以12000rpm离心3分钟收集产物，并用超纯水洗涤三次后冻干成粉末得到zif-8纳米颗粒。往反应液中加入10mg gox，则可以得到gox@zif-8纳米颗粒。
53.实施例1
54.实施例1提供一种具有光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料，配位聚合物纳米材料包括1,2,4-三氮唑铜(i)([cu(tz)])和酶，酶负载在1,2,4-三氮唑铜(i)的内部。制备方法如下：
[0055]
室温下向含有0.2mmol cu(no3)2和0.6mmol抗坏血酸的10ml溶液中加入0.4gnaoh，迅速生成cu2o纳米颗粒，离心后洗涤。将生成的cu2o纳米颗粒溶解在1ml超纯水中。在氮气保护下，将该1ml cu2o溶液加入含有10mg gox、4mmol 1,2,4-三氮唑和0.7mmol抗坏血酸的19ml水溶液中。室温下搅拌反应半小时后，以12000rpm离心3分钟收集产物，并用超纯水洗涤三次后冻干成粉末得到配位聚合物纳米材料(gox@[cu(tz)])，酶的负载量为20％。
[0056]
实施例2
[0057]
实施例2提供一种具有光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料，制备方法和原料同实施例1，其区别仅在于，酶的负载量为10％。
[0058]
实施例3
[0059]
实施例3提供一种具有光动力联合饥饿治疗功能的配位聚合物纳米材料，制备方法和原料同实施例1，其区别仅在于，酶的负载量为30％。
[0060]
对比例1
[0061]
对比例1提供了一种配位聚合物纳米材料，制备方法与实施例1相同，其区别在于，采用3,5-二乙基-1,2,4-三氮唑替代1,2,4-三氮唑。
[0062]
对比例2
[0063]
对比例1提供了一种配位聚合物纳米材料，制备方法与实施例1相同，其区别在于，采用常用的配位聚合物zif-8替代1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物。
[0064]
对比例3
[0065]
对比例3提供一种配位聚合物纳米材料，原料与实施例1相同，其区别在于，酶吸附在1,2,4-三氮唑铜(i)表面。制备方法如下：
[0066]
室温下向含有0.2mmol cu(no3)2和0.6mmol抗坏血酸的10ml溶液中加入0.4g naoh，迅速生成cu2o纳米颗粒，离心后洗涤。将生成的cu2o纳米颗粒溶解在1ml超纯水中。在氮气保护下，该1ml cu2o溶液加入含有4mmol 1,2,4-三氮唑、0.7mmol抗坏血酸的19ml水溶液中。室温下搅拌反应1小时，待溶液变白后，在氮气保护下加入10mg gox，混合半小时后，
以12000rpm离心3分钟收集产物，并用超纯水洗涤三次后冻干成粉末备用。
[0067]
性能测试
[0068]
图1是本发明的原理示意图，包括了配位聚合物纳米材料的制备示意图以及配位聚合物纳米材料实现光动力联合饥饿治疗肿瘤细胞的原理示意图。
[0069]
1.对1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物进行x射线衍射(xrd)，如图2所示，1,2,4-三氮唑铜(i)配位聚合物属于单斜晶系、p-1空间群，晶胞参数为：1空间群，晶胞参数为：α＝79.648(4)
°
，β＝79.043(3)
°
，γ＝78.855(4)
°
。
[0070]
2.对1,2,4-三氮唑铜(i)、实施例1的配位聚合物和对比例3的配位聚合物进行蛋白质电泳试验：
[0071]
将5mg 1,2,4-三氮唑铜(i)，对比例3的配位聚合物或实施例1的配位聚合物与10mm gsh反应一小时，降解材料，使gox释放到溶液中。通过蛋白质电泳检测上清液的gox分子。如图3所示，无包酶的1,2,4-三氮唑铜(i)(泳道2)没有任何蛋白质条带。而对比例3的配位聚合物(泳道3)及实施例1的配位聚合物样品(泳道4)均可以观察到与gox(泳道1)具有相似位置的条带，但对比例3的配位聚合物较实施例1的配位聚合物的条带浅，这是因为表面吸附的gox容易被清洗除去，不利于实际应用。而原位包裹的负载量大，并且稳定，不容易渗漏，只有在gsh的降解下才能释放出gox。
[0072]
3.对1,2,4-三氮唑铜(i)、实施例1的配位聚合物和葡萄糖氧化酶进行红外光谱试验：
[0073]
从图4看，gox和实施例1的配位聚合物在1640～1660cm-1
处均有特征峰，对应的是蛋白质酰胺i伸缩振动(主要来自c＝o伸缩)，而在1,2,4-三氮唑铜(i)样品中则无此伸缩振动，进一步验证了实施例1的配位聚合物中gox的存在。
[0074]
4.对1,2,4-三氮唑铜(i)、实施例1的配位聚合物进行扫描电子显微镜试验：
[0075]
图5的扫描电子显微镜(sem)图显示1,2,4-三氮唑铜(i)呈多棒状聚集的形态，趋向于各向异性生长。而实施例1的配位聚合物则偏向于各向同性生长，呈表面凹凸不平的球状颗粒。动态光散射(dls)结果显示，1,2,4-三氮唑铜(i)及实施例1的配位聚合物的平均粒径约分别为200nm和234nm，说明包裹了酶之后的复合材料粒径变大。
[0076]
5.将gox、实施例1的配位聚合物纳米材料和对比例1的配位聚合物纳米对酶活性测试：
[0077]
对葡萄糖的酶活性：将0.15μg gox或50μg实施例1的配位聚合物加入含有0.05mg ml-1
hrp,274μg ml-1
abts及不同浓度葡萄糖(0～300mm)的100μl pbs缓冲液(0.01m，ph 7.4)中。用多功能酶标仪检测415nm吸光度的实时变化，通过米氏方程计算酶动力学参数(图6)。得到的实施例1的配位聚合物纳米材料的催化活性仅为gox的1/10000～1/1000，实施例1的配位聚合物的酶催化活性(k
cat
/km＝0.051s-1
mm-1
)。这是因为1,2,4-三氮唑铜(i)无孔结构的特性，阻碍了gox与葡萄糖底物的接触与反应，能够有效抑制gox的活性。而当1,2,4-三氮唑铜(i)结构被破坏(这里用超声降解)，gox的酶活性才会恢复(图7)。
[0078]
而对比例1的配位聚合物的酶催化活性(k
cat
/km＝240s-1
mm-1
)很高，接近于游离的gox酶催化活性(420s-1
mm-1
)。这是因为对比例1的配位聚合物为多孔材料，不具备抑制葡萄糖氧化酶活性的能力。
[0079]
6.对zif-8、对比例2的配位聚合物、1,2,4-三氮唑铜(i)和实施例1的配位聚合物
进行bet测试：
[0080]
如图8所示，氮气吸附数据显示，zif-8、对比例2的配位聚合物、1,2,4-三氮唑铜(i)和实施例1的配位聚合物分别为1360、888、67.5和27.6m2g-1
，因此，对比例2的配位聚合物的是多孔材料，不能有效保护酶，而本发明的配位聚合物为无孔结构。
[0081]
7.通过mtt法测定1,2,4-三氮唑铜(i)及实施例1的配位聚合物纳米材料对人乳腺癌细胞mcf-7的细胞毒性。
[0082]
如图9所示，1,2,4-三氮唑铜(i)在10～100μg ml-1
浓度范围内孵育24h后，细胞存活率在80％以上，而40μg ml-1
实施例1的配位聚合物纳米材料的细胞毒性大于75％。结果表明负载有gox的复合材料显示出高的细胞毒性，具有饥饿治疗的效果。
[0083]
8.测试实施例1的配位聚合物纳米材料和对比例2的配位聚合物纳米材料肿瘤细胞特异性：
[0084]
文献报道癌细胞中的gsh浓度是正常细胞的3～10倍，而实施例1的配位聚合物纳米材料具有gsh响应性释放的性能，因此可以实现癌细胞特异性的饥饿治疗。通过mtt法测定实施例1的配位聚合物纳米材料对人乳腺癌细胞mcf-7及人正常乳腺上皮细胞mcf-10a的细胞毒性。如图10所示，实施例1的配位聚合物纳米材料对癌细胞mcf-7具有更强的细胞毒性，显示出癌细胞特异性的饥饿治疗效果。而游离的gox和对比例2的配位聚合物材料对癌细胞和正常细胞均有很强的细胞毒性，不具备选择性。且不能应用，结果表明实施例1的配位聚合物纳米材料可以提高饥饿治疗的选择性和安全性。
[0085]
9.检测实施例1的配位聚合物纳米材料的铜死亡特性：
[0086]
通过mtt法测定铜死亡抑制剂uk5099和antimycin a对gox、[cu(tz)]及实施例1的配位聚合物纳米材料的细胞毒性影响。如图11所示，与gox和[cu(tz)]处理的5637细胞相比，两种铜死亡抑制剂对gox@[cu(tz)]处理的5637细胞的挽救作用明显更大，这表明实施例1的配位聚合物纳米材料诱导的细胞死亡可能与铜死亡有关。另外，蛋白印记实验(图12)表明，伊利司莫和实施例1的配位聚合物纳米材料均引起脂酰化dlat的寡聚化。相比之下，gox、[cu(tz)]以及“gox加[cu(tz)]”则无法诱导dlat的寡聚。所有这些结果表明，gox的复合可使膀胱癌细胞对实施例1的配位聚合物纳米材料介导的铜死亡更敏感，并促进脂酰化蛋白聚集，这可能是由于可控释放的gox能够有效消耗肿瘤细胞内葡萄糖所致。而游离gox的毒性大、难以穿透活细胞膜，其细胞内浓度过低，无法有效消耗葡萄糖，从而无法促进肿瘤细胞的铜死亡。
[0087]
10.检测实施例1的配位聚合物纳米材料是否具有光敏性：
[0088]
apf荧光素可以选择性与
·
oh反应而产生荧光。不同浓度实施例1的配位聚合物纳米材料的pbs溶液与1mm过氧化氢及0.8mm apf溶液混合，溶液用808nm激光(1w cm-1
)照射10min，图13结果显示，apf荧光强度随实施例1的配位聚合物纳米材料的浓度上升而增强，表明实施例1的配位聚合物纳米材料可作为光敏剂而产生活性氧
·
oh。
[0089]
实验例1
[0090]
(1)对癌细胞的光动力联合饥饿治疗：将人膀胱癌细胞5637分为六组，分别为(a)对照组(pbs)，(b)光照组(808nm激发)，(c)1,2,4-三氮唑铜(i)，(d)单一光动力治疗组(1,2,4-三氮唑铜(i)+808nm)，(e)单一饥饿治疗组(实施例1)，(f)联合治疗组(实施例1+808nm)。对于联合治疗组，将5637细胞与50μg ml-1
实施例1的配位聚合物孵育4小时后，用
808nm激光(0.6w cm-1
)照射20min(照射两次，一次10min，中间间隔5min)，随后放于培养箱继续培养20小时，培养结束后，用流式细胞术检测凋亡和坏死的5637细胞。处于早期凋亡的细胞仅被fitc染色(q3)，处于晚期的细胞凋亡或坏死细胞会被fitc和pi同时染色(q2)。细胞凋亡率(q2+q3)结果如图14所示，六组的细胞凋亡率分别为11.21％，11.11％，14.28％，17.32％，27.98％和71.69％，结果表明联合治疗组相比于单一治疗组(d和e)存在增强效应，证明了肿瘤光动力与饥饿联合治疗的效果。
[0091]
(2)对荷瘤小鼠的光动力联合饥饿治疗：在雌性无胸腺裸鼠(六周)后腿皮下注射1
×
10
7 5637细胞悬液，构建荷5637瘤的裸鼠模型，分为五组，分别为(a)pbs，(b)1,2,4-三氮唑铜(i)，(c)单一光动力治疗组(1,2,4-三氮唑铜(i)+808nm)，(d)单一饥饿治疗组(实施例1)，(e)联合治疗组(实施例1+808nm)。当肿瘤体积达100mm3时，进行治疗实验。纳米材料的浓度为10mg kg-1
。光照条件为尾静脉注射药物24小时后用808nm激光(0.6w cm-1
)照射20min(照射两次，一次10min，中间间隔5min)。图15表示不同治疗组肿瘤体积随时间的变化情况。结果显示，单一治疗组(c和d)能够抑制肿瘤的生长，联合治疗组(e)的效果显著优于单一治疗组(c和d)以及对照组(a和b)。证明了活体水平的肿瘤光动力与饥饿联合治疗的效果。
[0092]
本发明的实施例2和实施例3具有实施例1相似的效果。
[0093]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。