千金藤素纳米胶束制剂的制备及其应用

本发明属于医药，具体涉及千金藤素纳米胶束制剂的制备及其应用。

背景技术：

1、新型冠状病毒(被世界卫生组织命名为“sars-cov-2”)属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。

2、从covid-19大流行以来，包括病毒s蛋白中和抗体、瑞德西韦、洛匹那韦/利托那韦(克力芝)、i型干扰素等多种药物在体外或体内实验中表现出了抗病毒活性，但是药物的临床疗效和安全性仍存在争议。目前美国fda还批准了瑞德西韦和几款中和抗体如bamlanivimab、etesevimab、casirivimab、imdevimab 用于covid-19住院患者的治疗，但是这些药物需要静脉滴注且价格昂贵，有效性和安全性也尚需进一步临床验证，限制了其进一步应用。2021年底，merck 和ridgeback biotherapeutics联合开发的口服抗新冠药物莫努匹韦(molnupiravir) 以及辉瑞公司研发的奈玛特韦片/利托那韦片(paxlovid)有条件获批上市，这两种药物分别针对病毒的rdrp和3clpro，存在耐药性的威胁，而molnupiravir可能引起dna突变，安全性尚待进一步研究，paxlovid的联合用药和药物相互作用尚需进一步研究，而且这两种药物在疫苗接种人群中的临床效果还未可知。

3、疫苗接种是预防和控制covid-19的长期策略中最有效的方法。不同的 sars-cov-2疫苗已被开发，截至2022年3月28日，已有153种疫苗获批进行临床试验，196种疫苗处于临床前试验阶段，10种疫苗(含3种印度疫苗)获世卫组织批准紧急使用，目前国内已有4款自主研发的新冠疫苗获批上市 (https://vac-lshtm.shinyapps.io/ncov_vaccine_landscape/)。这些疫苗主要包括灭活疫苗(占总数的14％)、减毒活疫苗(1％)、病毒载体疫苗(复制和非复制；占总数的17％)、rna疫苗(18％)、dna疫苗(11％)、蛋白质亚单位疫苗(34％)和vlp疫苗(4％)。然而随着世界多地报道sars-cov-2的突变体，目前研究显示疫苗所产生的抗体对sars-cov-2突变株的中和能力表现出不同程度的下降甚至完全丧失。因此，迫切需要开发针对不同靶点的抗病毒新药物，或者使用联合疗法从多方面抑制病毒感染，一方面针对新冠病毒本身开发阻断病毒感染或抑制病毒复制的药物，同时考虑联合用药；另一方面针对新冠病毒与宿主的相互作用，阻断新冠引起的一系列临床症状和并发症，降低病死率。因此，针对新冠肺炎疫情和未来可能出现的冠状病毒，研发安全有效且具有广谱性的抗病毒药物意义重大。

4、千金藤素是一类双苄基异喹啉类生物碱，是中药头花千金藤的提取成分，显示出多种信号通路抑制活性，广泛用于癌症治疗，如胆管癌、卵巢癌、前列腺癌等。此外，千金藤素还作为一种免疫调节剂，对于机体炎症、自身免疫病等都具有一定疗效。在临床已有40年使用历史，在治疗脱发、毒蛇咬伤、白细胞减少症等均具有显著效果。同时，研究发现千金藤素对多种病毒具有抑制作用，包括sars-cov-2、hiv、sars病毒、hbv和ebola病毒，很可能是一种广谱的抗病毒药物，尤其是对各种冠状病毒表现出了良好的抑制效果。其结构式如下所示：

5、

6、申请号为202110172158.7的专利公开了上述化合物具有抗穿山甲冠状病毒毒株xcov作用。目前，已经存在的千金藤素制剂大多是口服药物制剂，稳定性差，存在溶出度低、吸收差和生物利用度低等问题，从而影响药效的发挥，最终影响治疗的效果。申请人在研发过程中也发现千金藤素在水中和油中都具有溶解性差的缺点，很难制成溶液。目前新型冠状病毒肆虐全球，因此，需要开发一种安全性高的并且生物利用度高的制剂。需通过相应的制剂工艺提高药物的溶出速率或表观溶解度。

7、胶束药物是一种可以提高难溶药物溶解度的方式。然而，常规胶束药物的制备通常需要加入醇类作为增溶剂，辅助药物分散到体系中，再通过技术手段除去，以便形成具有亲水外壳与疏水核心的胶束。然而在除去醇的过程中，旋蒸等较为激烈的手段使得助溶剂快速脱离体系，疏水性的药物容易被醇带离疏水核心游离到水相体系中，破坏胶束结构。而挥发等缓和的手段导致制备周期漫长且使用的溶剂醇难以除净，从安全性上考量是不利的。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种千金藤素纳米胶束制剂的制备方法，该方法所得的制剂能有效提高千金藤素的溶解度，具有生物利用度高，生物活性高的优点。

2、一种千金藤素纳米胶束制剂的制备方法，包括以下步骤：

3、a)将千金藤素溶解于无机酸的水溶液中，形成千金藤素水溶液；

4、b)将表面活性剂溶解于步骤a)所得水溶液中，形成表面活性剂-千金藤素水溶液；

5、c)将无机碱的水溶液加入到表面活性剂-千金藤素水溶液中，搅拌形成悬浊液；

6、d)将悬浊液离心，去除沉淀，收集上清液即为千金藤素纳米胶束；

7、任选地，e)将上清液浓缩制成胶束浓缩液；

8、所述表面活性剂选自聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物或共聚维酮va64、聚乙二醇4000、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮k25、聚乙烯吡咯烷酮k30、聚乙烯吡咯烷酮k90、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯和聚乙二醇-15羟硬脂酸酯中的两种或以上。

9、根据本发明的实施方案，所述无机酸的水溶液选自盐酸、硫酸、硝酸、亚硫酸或磷酸的水溶液。

10、根据本发明的实施方案，所述无机酸的水溶液的浓度为0.01-0.5mol/l，优选为0.025-0.4mol/l，例如为0.1-0.3mol/l。

11、根据本发明的实施方案，千金藤素的量(mmol)与酸性水溶液的体积(l) 比为1:(0.01-10)，例如1:(0.5-3)。

12、根据本发明的实施方案，所述表面活性剂为两种表面活性剂的组合，例如选自质量比为1:1的聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和泊洛沙姆407；或者质量比为2:1的生育酚聚乙二醇琥珀酸酯和泊洛沙姆188；或者质量比为1:1的共聚维酮va64和泊洛沙姆407。

13、根据本发明的实施方案，所述千金藤素与表面活性剂的总质量比为1: (20-60)，例如1:(30-53)。

14、根据本发明的实施方案，所述无机碱的水溶液选自碱金属或者碱土金属的氢氧化物，碳酸盐，或者碳酸氢盐的水溶液，例如选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或碳酸钠水溶液。

15、根据本发明的实施方案，所述无机碱的水溶液的浓度为0.01-0.5mol/l，优选为0.1-0.4mol/l。

16、根据本发明的实施方案，千金藤素的量(mmol)与无机碱的水溶液的体积 (l)比为1:(0.1-5)，例如1:(0.4-1)。

17、根据本发明的实施方案，将无机碱的水溶液加入到表面活性剂-千金藤素水溶液中时在200-5000转/分钟高速搅拌下，例如500-1000转/分钟通过蠕动泵加入。

18、根据本发明的实施方案，加入完成后还继续搅拌10-60分钟。

19、根据本发明的实施方案，悬浊液离心的速度为1000-20000转/分钟。

20、根据本发明的实施方案，浓缩为采用聚苯醚砜过滤膜(100kda)进行超滤。

21、本发明还提供如上所述方法获得的千金藤素纳米胶束制剂。

22、根据本发明的实施方案，所述千金藤素纳米胶束制剂的浓度为0.1-3mg千金藤素/ml。

23、优选地，所述的制剂为液体制剂。

24、优选地，所述的制剂为液体制剂时，其中含有以质量份计：1份千金藤素、 20-200份表面活性剂辅料和500-15000份水。

25、优选地，所述的制剂为液体制剂时，其中含有以质量份计：1份千金藤素、 40份表面活性剂辅料和2500份水。

26、根据本发明的实施方案，所述千金藤素纳米胶束制剂可以配置成各种适合的药物制剂形式。可以单独使用，或者将其与药物辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配置成口服给药的糖浆剂等或注射给药的溶液剂，以及研制为功能食品，功能饮品、药酒，滴鼻液及漱口水等。

27、本发明提供了千金藤素的纳米胶束制剂以及该纳米胶束制剂的制备方法。所述方法通过“酸碱中和”方式，克服了千金藤素不能溶于常规胶束药物制备过程中使用水的缺陷，同时避免了在常规胶束药物制备过程中醇类溶剂的引入，制备工艺简单。所制备的千金藤素纳米胶束制剂质量好，胶束粒径在纳米级，提高了千金藤素的溶解度，稳定性，进一步提高了其生物利用度和生物活性，可以保证药物吸收和药效稳定，且技术可行、稳定可靠。

28、本发明还提供如上所述千金藤素纳米胶束制剂在制备预防或治疗冠状病毒感染性疾病，或抑制猪流行腹泻病毒(pedv)的药物中的应用。

29、根据本发明的实施方案，其中冠状病毒为2019新型冠状病毒 (sars-cov-2)。

30、根据本发明的实施方案，其中冠状病毒感染性疾病为新型冠状病毒肺炎。

31、本发明人利用穿山甲冠状病毒毒株xcov模型，sars-cov-2病毒样颗粒 (trvlp)模型，sars-cov-2野生型及突变株的假病毒模型，对千金藤素纳米胶束制剂进行抗sars-cov-2病毒活性评价。结果表明千金藤素纳米胶束制剂能有效抑制穿山甲冠状病毒毒株xcov的感染和复制，能够有效抑制 sars-cov-2病毒样颗粒(trvlp)的感染和复制，同时也能有效中和sars-cov-2 野生型及突变株的假病毒。

32、本发明制备的千金藤素纳米胶束制剂对gx_p2v均有良好的抑制活性，其对于gx_p2v在细胞水平的ec50＝0.8979μm，cc50＝13.94μm，si＝15.53。对于sars-cov-2病毒样颗粒(trvlp)的ec50＝0.07247μm，cc50>25μm， si>345，在6.25μm浓度下对于sars-cov-2野生型及突变株的假病毒的抑制效果均大于95％(其中突变株包括delta，alpha，beta)。因此，本发明制备的千金藤素纳米胶束制剂可应用于针对covid-19及各种突变株带来的新的covid-19浪潮的预防和治疗。

33、此外，本发明制备的千金藤素纳米胶束制剂对pedv具有良好的抑制活性，其在veroe6细胞上对pedv的ec50＝0.4223μm，cc50＝14.87μm，si＝35.21。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

35、1.纳米化制剂是将药物颗粒减小至纳米级水平，并采用少量稳定剂保持纳米级药物颗粒处于稳定状态的这种新型药物制剂形式，可以达到提高其生物利用度的目的。本发明的方法制备的千金藤素纳米胶束制剂是使用至少两种表面活性剂通过“酸碱中和”方式来制备，克服了千金藤素不能溶于常规胶束药物制备过程中使用水的缺陷，同时避免了在常规胶束药物制备过程中醇类溶剂的引入，制备工艺简单，所得混合胶束相较于常规单表面活性剂制备的胶束具有更低的cmc值，意味着其能够承受更大比例的稀释而不会发生解聚，具有更加广泛的给药浓度范围，能够显著改善千金藤素的水溶性，并且同时提高其抗病毒效果。

36、2.千金藤素纳米胶束制剂大大提升了千金藤素的溶解度，并且在细胞水平能够阻断sars-cov-2病毒进入细胞，也能有效抑制病毒的复制从而达到预防和治疗covid-19的效果。

37、上述结果均表明千金藤素纳米胶束制剂具有巨大的潜在预防和治疗 sars-cov-2病毒感染性疾病的临床应用价值。

38、术语和定义

39、除非另外说明，本技术中的术语“纳米胶束”指的是当形成的千金藤素制剂为液体状态下，通过扫描电镜观测到千金藤素及其聚合物辅料共同形成了外部亲水极性部分和内部疏水部分的缔合体，这种缔合体称为胶束，每种缔合体的直径或宽度在几十纳米。

40、除非另外说明，本技术中的术语“聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物”购自巴斯夫(basf)，商品名称色鲁普(soluplus)。

41、除非另外说明，本技术中的术语“共聚维酮va64”指的是n-乙烯-2-吡咯烷酮及乙酸乙烯酯按照60：40的比例合成的水溶性共聚物。本技术中的共聚维酮 va64购自巴斯夫，商品名称为考利弗va 64(kollidonva 64)和考利弗va 64 粉末(kollidon va 64fine)。

42、除非另外说明，本技术中的术语“聚乙二醇4000”指的是环氧乙烷和水缩聚而成的高分子聚合物，分子式以ho(ch2ch2o)nh表示，其中n代表氧乙烯基的平均数，在聚乙二醇4000中的n为4000左右。

43、除非另外说明，本技术中的术语“羧甲基纤维素钠”购自亚什兰(ashland)，分子量为250000-720000。

44、除非另外说明，本技术中的术语“聚乙烯吡咯烷酮k25”表示乙烯吡咯烷酮的聚合物，其中k值代表乙烯吡咯烷酮聚合物的平均分子量范围。k值实际上是与pvp水溶液相对黏度有关的特征值，而黏度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用k值表征pvp的平均分子量。通常k值越大，其黏度越大，粘结性越强。本技术中的聚乙烯吡咯烷酮k25购自亚什兰(ashland)，商品名称为普兰斯通k25(plasdone pvp k25)。

45、除非另外说明，本技术中的术语“聚乙烯吡咯烷酮k30”的定义参照聚乙烯吡咯烷酮k25。本技术中的聚乙烯吡咯烷酮k30购自购自亚什兰(ashland)，商品名称为普兰斯通k30(plasdone pvp k30)。

46、除非另外说明，本技术中的术语“聚乙烯吡咯烷酮k90”的定义参照聚乙烯吡咯烷酮k25。本技术中的聚乙烯吡咯烷酮k90购自亚什兰(ashland)，商品名称为普兰斯通k90(plasdone pvp k90)。

47、除非另外说明，本技术中的术语“泊洛沙姆188”也称为普朗尼克f68，指的是聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯组成的peo-ppo-peo三嵌段共聚物，其中氧乙烯单元为75-85％，氧丙烯单元为25-30％。平均分子量为7680-9510。商品名称为考利弗p188(kolliphorp188)。

48、除非另外说明，本技术中的术语“泊洛沙姆407”由约70％的乙烯氧化物和 30％的丙烯氧化物组成，平均分子量为9840-14600。商品名称为考利弗 p407(kolliphor p407)。

49、除非另外说明，本技术中的术语“生育酚聚乙二醇琥珀酸酯和2-羟乙基12- 羟基-18酸酯”简称tpgs，cas号为：9002-96-4。商品名称为考利弗tpgs (kolliphor tpgs)。

50、除非另外说明，本技术中的术语“聚乙二醇-15羟硬脂酸酯”英文名称为“solutolhs15”，cas号为：70142-34-6。