一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统的制备方法与流程

1.本发明属于仿生递药系统制备领域，尤其涉及一种以血小板膜包裹光热转换材料和光敏剂，并同时携载改善肿瘤乏氧药物作为仿生递药系统来协同强化光动力治疗和光热治疗。


背景技术：

2.光动力治疗(pdt)和光热治疗(ptt)是肿瘤治疗领域的新兴疗法。pdt主要是基于光敏剂在特定波长的光照射下利用氧分子产生活性氧，从而对肿瘤组织产生毒性。而ptt是利用具有较高光热转换效率的材料，在特定波长的光照(一般是近红外光)下将光能转化为热能来杀死癌细胞。与传统治疗方法相比，可以利用光源的靶向性，选择性消灭原发、复发肿瘤，避免对正常组织的损伤，具有安全、微创的特点。因此，pdt和ptt在肿瘤治疗方面显示了巨大的应用前景。
3.但是，pdt和ptt仍面临着的一些亟待解决的问题：(1)光热材料和光敏剂生物相容性差，会被机体免疫系统视为异物而快速吞噬清除；(2)光热材料和光敏剂对肿瘤组织和细胞缺乏足够的靶向性，一定程度上也限制了其疗效且增加了其毒副作用；(3)肿瘤组织乏氧是实体肿瘤的一个主要特征，而pdt对氧气具有依赖性，这一现象会降低pdt对肿瘤细胞的杀伤能力，限制pdt对肿瘤的治疗效果；(4)传统的增敏剂在白光下敏化及其自催化活化问题引发严重副作用。


技术实现要素：

4.为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种血小板膜包裹光热转换材料和光敏剂并同时携载缓解肿瘤乏氧药物的制备方法，制成能协同强化光动力及光热治疗的仿生递药系统，具有生物相容性好、主动靶向性强、能强化光热光动力治疗等优点。
5.为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的：
6.一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：
7.将氯化钨溶解于无水乙醇中，在水热反应釜中反应，冷却至室温后离心洗涤，经真空干燥，得到w
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氧化钨纳米球；
8.将洗涤后的血小板用含蛋白酶抑制剂的去离子水重悬，经-80℃和室温三次反复冻融，水浴超声处理后获得血小板膜；
9.将w
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纳米球、缓解肿瘤乏氧药物与血小板膜混合，水浴超声处理继续搅拌，获得协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统。
10.进一步的，一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)将氯化钨溶解于无水乙醇中，在水热反应釜中反应，冷却至室温后离心洗涤，
经真空干燥，得到w
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氧化钨纳米球。
12.(2)环境温度为20
±
5℃，在全血中加入4％柠檬酸钠溶液抗血小板聚集，离心后得到富血小板血浆，再用pbs缓冲液洗涤三次，离心得到洗涤后的血小板；所述4％柠檬酸钠溶液与全血的体积比为1:9；
13.(3)将步骤(2)得到的洗涤后的血小板，用含蛋白酶抑制剂的去离子水重悬，经-80℃和室温三次反复冻融，水浴超声处理5分钟，获得血小板膜；所述蛋白酶抑制剂含有aebsf、抑肽酶、苯丁抑制素、e-64、亮抑酶肽、胃酶抑素a；所述的含蛋白酶抑制剂的去离子水，为蛋白酶抑制剂原液用去离子水稀释100倍；
14.(4)将步骤(1)得到的w
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纳米球及缓解肿瘤乏氧药物与步骤(3)得到的血小板膜混合，水浴超声处理5分钟后继续搅拌12小时，获得血小板膜包裹的可协同强化光热和光动力治疗的仿生递药系统。
15.步骤(1)中，氯化钨溶解于无水乙醇的浓度为10～15mm，水热反应釜的反应条件为180℃反应6～12小时；真空干燥的条件为70℃和700～740mmhg。
16.步骤(2)中，获得富血小板血浆的离心速度为200g离心10分钟，获得洗涤后的血小板的离心速度为1800g离心20分钟。
17.步骤(3)和步骤(4)中水浴超声处理条件为22℃、42khz及100w，处理时间为5分钟。
18.步骤(4)中缓解肿瘤乏氧药物为增加肿瘤氧供或减少肿瘤耗氧药物的一种，如二甲双胍、阿托伐醌等。
19.步骤(4)中缓解肿瘤乏氧药物与w
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纳米球的质量比为1～3:10。
20.步骤(4)中血小板计数为2.5～3.0
×
109制备的血小板膜用于包裹1mg的w
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纳米球。
21.本发明还提供一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统，其特征在于，根据上述方法制备而成。
22.本发明还提供上述协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
23.有益效果
24.(1)血小板是人体细胞成分之一，因而血小板膜具有极佳的生物相容性，可使包裹的材料避免机体免疫排斥反应，获得良好的安全性及较长的循环时间。本发明采用血小板膜包裹兼具光热转换材料和光敏剂功效的w
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纳米球，具有良好的生物相容性，可避免传统的材料引起的免疫排斥反应，其具有更长的血循环时间；另外血小板膜包裹w
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，可减少w
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的氧化。
25.(2)血小板在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，血小板可通过膜蛋白p-selectin等在肿瘤细胞周围聚集。血小板膜共同包裹w
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和缓解肿瘤乏氧药物的仿生递药系统，血小板膜保留了血小板膜蛋白p-selectin等，包裹纳米材料后可实现主动靶向肿瘤组织，提高了药物对肿瘤组织的靶向性，从而实现协同强化光热治疗和光动力治疗。另外可通过药物改善肿瘤乏氧，显著增强w
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作为光敏剂带来的光动力疗效。该协同强化pdt和ptt的仿生递药系统，对提高肿瘤光热治疗和光动力治疗效果有显著的意义，可为肿瘤的治疗提供新策略，具有广阔的应用前景。
附图说明
26.图1为血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统的透射电镜图。a为w
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纳米球透射电镜图；b为pm-w
18o49-met仿生递药系统的透射电镜图。
27.图2为制备的血小板膜和血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统的蛋白免疫印迹条带；其中左第一泳道为单纯的血小板膜，第二泳道为血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统。
28.图3为w
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和血小板膜包裹的w
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存储一周前后光热和光动力转换效能。a为w
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纳米球放置一周前后激光照射后的温度时间曲线；b为pm-w
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放置一周前后激光照射后温度时间曲线；c为w
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纳米球放置一周前后的电子顺磁共振光谱；d为pm-w
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放置一周前后的电子顺磁共振光谱。
29.图4为皮下荷瘤小鼠分别静脉注射生理盐水和血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统等后予激光照射，肿瘤乏氧pet显像的平均suv值。
30.图5为皮下荷瘤小鼠分别静脉注射w
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和血小板膜包裹w
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后激光照射肿瘤部位温度变化曲线。
31.图6为经w
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和血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统等不同处理后皮下荷瘤小鼠肿瘤体积时间变化图。
32.图7为经w
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和血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统等不同处理后肿瘤组织tunel染色结果。
具体实施方式
33.下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
34.实施例1
35.一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统的制备
36.第一步：将氯化钨溶解于无水乙醇中，浓度为10～15mm，在水热反应釜中180℃反应6～12小时，冷却至室温后离心洗涤，经真空干燥，得到w
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氧化钨纳米球。
37.第二步：环境温度为20
±
5℃，在全血中加入4％柠檬酸钠溶液(9:1)抗血小板聚集，200g离心10分钟得到富血小板血浆，再用pbs缓冲液洗涤三次，1800g离心20分钟得到洗涤血小板。
38.第三步：将洗涤血小板用含蛋白酶抑制剂的去离子水重悬，经-80℃和室温三次反复冻融，水浴超声42khz、100w处理5分钟，获得血小板膜。
39.第四步：将w
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纳米球及二甲双胍(met)与血小板膜(pm)混合，w
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纳米球与二甲双胍重量比为1～3:10，血小板计数为2.5～3.0
×
109制备的血小板膜包裹1mg的w
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纳米球。水浴超声42khz、100w处理5分钟后继续搅拌12小时，获得血小板膜包裹w
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及二甲双胍的可协同强化光热和光动力治疗的仿生递药系统(pm-w
18o49-met)。
40.实施例2
41.一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统的表征
42.利用透射电子显微镜观察w
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和pm-w
18o49-met的形态及分散情况，利用动态光散射粒度仪分析其粒径大小；并采用蛋白免疫印迹实验检测血小板膜和pm-w
18o49-met的蛋白表达差异，光动力和光热效应由电子自旋共振波谱仪实现。
43.如图1所示，血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统呈均匀分散，并具有合适的尺寸，其直径约为115nm，而游离的w
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纳米球粒径仅约为10nm，因此pm-w
18o49-met可以更好地利用增强渗透滞留效应实现在肿瘤组织富集。图2中的蛋白免疫印迹实验显示，血小板膜包裹w
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和二甲双胍的仿生递药系统保留了血小板膜蛋白，这既能使得递药系统拥有良好的生物相容性，又能使得该系统利用血小板与肿瘤细胞的相互作用，实现主动靶向肿瘤组织，从而显著提高肿瘤组织药物浓度，提高疗效，并降低药物对正常组织细胞的毒副作用。从图3可以看到，游离的w
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易被氧化，w
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在储存一周后失去了将激光转换为热能和产生单线态氧的能力(a和c)。而pm-w
18o49-met在储存一周后，仍可以将激光转换成热量和单线态氧，表明血小板膜对w
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具有良好的保护作用(b和d)。这表明血小板膜包裹w
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，可保护w
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免于氧化，保持较为持久的光热及光动力效应，从而提高ptt和pdt疗效。
44.实施例3
45.一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统对肿瘤乏氧微环境的影响及在肿瘤组织的光热效应
46.荷瘤小鼠建模：balb/c裸鼠购自南京医科大学医药实验动物中心。将淋巴瘤细胞raji细胞制备成2
×
107/ml的细胞悬液，给裸鼠皮下注射100μl，隔天测量肿瘤大小，当肿瘤体积增加到80～150mm3时，视为建模成功。
47.肿瘤乏氧检测：将上述荷瘤小鼠20只随机分成四组，每只小鼠在治疗前静脉给予含
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f-miso(75μci)的100μl生理盐水，然后分别经尾静脉注射生理盐水、pm-w
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、pm-met和pm-w
18o49-met，其中各组w
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的给药剂量为50mg/kg，met的给药剂量为16mg/kg，再用808nm激光(1w/cm2)照射肿瘤部位10分钟。给药后1小时，通过micro-pet/ct扫描小鼠以评估不同治疗后肿瘤组织部位缺氧状况。
48.光热效应测定：将w
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和pm-w
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制备成含钨量为1mg/ml的溶液，分别给荷瘤小鼠静脉注射100μl。给药后8小时，用808nm激光(1w/cm2)照射肿瘤部位10分钟。利用红外热成像仪在0、2、5、8和10分钟时拍摄照片。
49.光动力治疗对氧气具有依赖性，如图4所示，实体肿瘤组织表现为乏氧微环境，w
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的光动力效果会加剧肿瘤组织的乏氧，这一定程度上限制了w
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的光动力疗效。而二甲双胍的引入，可明显缓解肿瘤乏氧，在pm-met和pm-w
18o49-met组的肿瘤中缺氧信号较w
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组明显降低，这能使得w
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充分发挥光动力作用，提高治疗效果。如图5所示，与游离的w
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相比，用pm-w
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治疗的小鼠的肿瘤温度在暴露于激光后显着升高，表明用血小板膜包裹的w
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具有更强的光热效应。一方面，血小板膜可保护w
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免于氧化；另一方面，血小板膜包裹的仿生纳米材料可通过epr和主动靶向效应到达肿瘤组织，从而增强w
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介导的ptt。
50.实施例4
51.一种协同强化光动力及光热治疗的仿生纳米递药系统的体内抗肿瘤疗效
52.分组及处理：将30只荷瘤小鼠随机分为6组：生理盐水、w
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、met、pm-w
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、pm-met和pm-w
18o49-met，各组w
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的给药剂量为50mg/kg，met的给药剂量为16mg/kg。各组小鼠在静脉给药后8小时，用808nm激光(1w/cm2)照射肿瘤部位10分钟。生理盐水用作对照。每2天测量肿瘤大小以评估治疗效果。
53.tunel染色：在治疗后第12天，将小鼠安乐死，分离出肿瘤组织，制备成冷冻切片。
恢复至室温后，经固定、修复和破膜，切片加入50μl的tdt和dutp混合物，在37℃湿盒中避光孵育1小时，dapi复染细胞核后封片，使用荧光显微镜观察拍照。
54.如图6所示，生理盐水组的肿瘤组织快速生长，与第0天相比，第12天的肿瘤体积几乎增加至约3倍。w
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和pm-w
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肿瘤体积较治疗前缩小，且pm-w
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组比w
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更小；而相比于其他各组，pm-w
18o49-met组中的肿瘤体积最小。治疗后第12天获取肿瘤组织，进行tunel染色。如图7所示，与对照组相比，w
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、pm-w
18o49
、pm-w
18o49-met各组肿瘤组织凋亡增加，且在pm-w
18o49-met组，肿瘤组织凋亡最显著。
55.从以上可以看出，血小板膜不仅可以保护w
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纳米球免受氧化和免疫逃逸，还可以通过被动epr效应和血小板膜与肿瘤细胞之间的主动粘附，帮助w
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实现在肿瘤组织部位累积；共同携载的二甲双胍还可缓解肿瘤乏氧以提高pdt疗效，从而实现协同强化pdt和ptt治疗，为实体肿瘤治疗提供一种新策略。
56.本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。