1.本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及人胎儿真皮间充质干细胞内容物在皮肤修复上的应用。
背景技术：
2.人胎儿真皮间充质干细胞（human fetal dermal mesenchymal stem cells，hfdmscs）是指存在于自然流产胎儿皮肤真皮组织中的一种多能干细胞，与其他间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）相比，hfdmscs是一种具有优秀的自我更新、多向分化潜能、真皮归巢特性和更加原始的组织间充质干细胞，研究证实它具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤和组织修复作用，此外，还能防治烧伤早期创面进行性加深，减轻血管通透性和组织水肿，减缓移植物排异反应，而对于包含外泌体在内的hfdmsc分泌型细胞内容物（secretory cell content，scc）和包括胞质和胞核（包含核膜、dna/rna和核蛋白质）的hfdmsc非分泌型细胞内容物（nonsecretory cell content，nscc）的研究应用几乎没有。
3.皮肤是人体最大的器官，是机体的重要保护屏障，随着老年社会的到来，人们对急慢性创面愈合及其修复质量、皮肤老化、紫外线损伤、秃发、炎症免疫相关皮肤病和延年益寿的诉求不断增强，同时也越来越重视各种护肤品或外用药品的质量和安全性，亟待寻找一种有效的再生修复方法，而干细胞局部注射治疗存在存活率低、免疫原性强、分化方向不稳定、可能致瘤和伦理等问题。
技术实现要素：
4.本发明实施例的目的在于提供人胎儿真皮间充质干细胞内容物在皮肤修复上的应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
5.本发明实施例是这样实现的，人胎儿真皮间充质干细胞内容物在皮肤修复上的应用，其特征在于，所述人胎儿真皮间充质干细胞内容物包括hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc。
6.优选地，所述hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合后，在无菌条件下制备成可注射的或外用的制剂，所述制剂中hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合物的体积含量为0.1~5%。
7.优选地，所述制剂还包括谷胱甘肽和烟酰胺。
8.优选地，以hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合物的体积计，所述谷胱甘肽的含量为2~8ug/ml。
9.优选地，以hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合物的体积计，所述烟酰胺的含量为2~8 mg /ml。
10.优选地，所述hfdmscs-scc的提取方法包括以下步骤：分离及纯化hfdmscs；从培养的hfdmscs的条件培养基中获得hfdmscs-scc的提取物。
11.优选地，所述hfdmscs-nscc的提取方法包括以下步骤：分离及纯化hfdmscs；
对hfdmscs进行破碎和离心，获得hfdmscs-nscc的提取物。
12.本发明实施例提供的人胎儿真皮间充质干细胞内容物在皮肤修复上的应用，利用胎儿真皮间充质干细胞具有真皮归巢特性、更强的增殖能力、分化潜能以及更低的免疫原性，且fdmscs通过分泌型内容物（胞外囊泡、外泌体）旁分泌作用来调节真皮组织血管通透性、炎症免疫反应和修复细胞等功能活性，减轻组织水肿，促进毛囊再生和真皮基质合成，加速创面愈合，同时抑制瘢痕增生，将hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc按不同比例混合，由此获得可注射的或外用型制剂，可开展组织再生修复和皮肤病治疗的全身和局部应用，有效促进急慢性创面修复，促进组织（血管、神经、真皮基质和皮肤附件）再生，有效抑制瘢痕增生，通过抑制血管通透性，减轻组织水肿，有效控制多种皮肤病的炎症免疫反应，有效延缓或逆转皮肤衰老，采用hfdmscs胞外囊泡联合胞内容物（全身和局部）可制备皮肤损伤修复与再生、毛发再生、抗氧化和抗炎产品。
具体实施方式
13.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
14.经伦理委员会同意和产妇知情同意，通过长期合作的妇产科医院协助，选择（无遗传性和无传染性疾病的）健康孕妇的早期自然流产胎儿，利用了自然流产的早期人胎儿皮肤分离hfdmscs，依次制备hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc提取物，将两者按不同比例混合，由此获得可注射的或外用型制剂，可开展组织再生修复和皮肤病治疗的全身和局部应用，通过全身（静脉输注）、局部注射及微针/激光后局部外敷或敷料载体等方式将hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合物用于促进组织再生（包括抗衰老）和急慢性创面修复，抑制瘢痕增生和损伤组织水肿，以及不同皮肤病的炎症免疫反应：（1）分离、纯化和鉴定hfdmscs；分离及纯化：在胎儿离体1h内，无菌条件下保留薄层脂肪取下胎儿背部皮肤，用含有0.5-1.5%青霉素-链霉素溶液的pbs反复冲洗皮肤组织至冲洗液清澈无血污，0.2-0.3%氯霉素溶液中浸泡5-15min，后用高浓度青霉素-链霉素溶液（20%-30%）pbs浸泡5-15min；修剪除去皮下脂肪组织及明显的毳毛，后剪成1.0 cm
×
1.0 cm大小皮片，置于0.2-0.3%的中性蛋白酶中，4℃过夜；后将真皮部分剪成泥状，于0.12-0.13% 的ⅰ型胶原酶中，恒温振荡器中37℃消化3-5min；将消化液用100目细胞滤网过滤后1000rmp离心3-7min，吸弃上清后用培养基洗涤沉淀，后用完全培养基重悬管底部细胞团；接种于培养瓶中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养至传代；鉴定：
①
形态学观察；
②
流式细胞术检测细胞表面标记：anti-cd14-pe-cf594，anti-cd34-pe，anti-cd44-apc， anti-cd45-fitc， anti-cd90-bv421，anti-cd105-pecy7；
③
免疫荧光染色检测细胞表面标记：anti-ck19，anti-vimentin，anti-ssea-4，anti-oct-4；
④ꢀ
成骨、成脂、成软骨分化能力检测；
（2）从培养的hfdmscs的条件培养基中获得hfdmscs-scc提取物；取第3-5代fdmscs用含10%胎牛血清的低糖完全培养基培养，待细胞达到70-80%密度时，进行hfdmscs-scc的提取：首先吸弃细胞培养上清，换用不含血清的空白培养基进行细胞饥饿，饥饿48小时后，吸取细胞培养上清，3000rpm离心10-15min去除细胞和细胞碎片，使用0.22μm滤器过滤上清液，将上清液转移至离心超滤管，通过离心滤过的方法浓缩上清液，将浓缩后的上清液转移至15ml离心管中，将浓缩后的上清液加入提取试剂，按一定比例加入沉淀剂后置于4℃冰箱竖直静置过夜，次日取出离心管，即可获取提取物；（3）对hfdmscs进行破碎和离心，获得hfdmscs-nscc提取物；对hfdmscs进行粉碎，获取细胞成分，将细胞收集后用研磨棒研磨细胞或借助超声波细胞破碎仪破碎细胞后，5000rmp离心15min，即可获取提取物；（4）将上述hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc根据治疗方式范围的不同进行不同比例混合，在无菌条件下制备适合不同应用范围的可注射或外用制剂，其中hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc含量0.1~5%，另外，外用制剂还包含谷胱甘肽（2~8ug/ml）和烟酰胺（2~8mg/ml）等组分；（5）通过全身（静脉输注）、局部注射及微针/激光后局部外敷或敷料载体等方式将hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合物用于促进组织再生（包括抗衰老）和急慢性创面修复，抑制瘢痕增生和损伤组织水肿，以及不同皮肤病的炎症免疫反应。
15.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
16.实施例1（1）分离、纯化和鉴定hfdmscs；分离及纯化：在胎儿离体1h内，无菌条件下保留薄层脂肪取下胎儿背部皮肤，用含有0.5%青霉素-链霉素溶液的pbs反复冲洗皮肤组织至冲洗液清澈无血污，0.2%氯霉素溶液中浸泡5min，后用高浓度青霉素-链霉素溶液（20%）pbs浸泡5min；修剪除去皮下脂肪组织及明显的毳毛，后剪成1.0 cm
×
1.0 cm大小皮片，置于0.2%的中性蛋白酶中，4℃过夜；后将真皮部分剪成泥状，于0.125% 的ⅰ型胶原酶中，恒温振荡器中37℃消化3min；将消化液用100目细胞滤网过滤后1000rmp离心3-7min，吸弃上清后用培养基洗涤沉淀，后用完全培养基重悬管底部细胞团；接种于培养瓶中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养至传代；（2）从培养的hfdmscs的条件培养基中获得hfdmscs-scc提取物；取第3代fdmscs培养，待细胞达到70%密度时，进行hfdmscs-scc的提取：首先吸弃细胞培养上清，换用空白培养基进行细胞饥饿，饥饿48小时后，吸取细胞培养上清，3000rpm离心10min去除细胞和细胞碎片，使用0.22μm滤器过滤上清液，将上清液转移至离心超滤管，通过离心滤过的方法浓缩上清液，将浓缩后的上清液转移至15ml离心管中，将浓缩后的上清液加入提取试剂，按一定比例加入沉淀剂后置于4℃冰箱竖直静置过夜，次日取出离心管，即可获取提取物；（3）对hfdmscs进行破碎和离心，获得hfdmscs-nscc提取物；对hfdmscs进行粉碎，获取细胞成分，将细胞收集后用研磨棒研磨细胞或借助超声波细胞破碎仪破碎细胞后，5000rmp离心15min，即可获取提取物；（4）将上述hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合，在无菌条件下制备适合不同应用范
围的可注射或外用制剂，其中hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc含量0.1%，另外，外用制剂还包含谷胱甘肽（2ug/ml）和烟酰胺（2mg/ml）等组分。
17.实施例2（1）分离、纯化和鉴定hfdmscs；分离及纯化：在胎儿离体1h内，无菌条件下保留薄层脂肪取下胎儿背部皮肤，用含有1%青霉素-链霉素溶液的pbs反复冲洗皮肤组织至冲洗液清澈无血污，0.25%氯霉素溶液中浸泡10min，后用高浓度青霉素-链霉素溶液（20%）pbs浸泡10min；修剪除去皮下脂肪组织及明显的毳毛，后剪成1.0 cm
×
1.0 cm大小皮片，置于0.25%的中性蛋白酶中，4℃过夜；后将真皮部分剪成泥状，于0.125% 的ⅰ型胶原酶中，恒温振荡器中37℃消化3min；将消化液用100目细胞滤网过滤后1000rmp离心5min，吸弃上清后用培养基洗涤沉淀，后用完全培养基重悬管底部细胞团；接种于培养瓶中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养至传代；（2）从培养的hfdmscs的条件培养基中获得hfdmscs-scc提取物；取第4代fdmscs培养，待细胞达到70%密度时，进行hfdmscs-scc的提取：首先吸弃细胞培养上清，换用空白培养基进行细胞饥饿，饥饿48小时后，吸取细胞培养上清，3000rpm离心10min去除细胞和细胞碎片，使用0.22μm滤器过滤上清液，将上清液转移至离心超滤管，通过离心滤过的方法浓缩上清液，将浓缩后的上清液转移至15ml离心管中，将浓缩后的上清液加入提取试剂，按一定比例加入沉淀剂后置于4℃冰箱竖直静置过夜，次日取出离心管，即可获取提取物；（3）对hfdmscs进行破碎和离心，获得hfdmscs-nscc提取物；对hfdmscs进行粉碎，获取细胞成分，将细胞收集后用研磨棒研磨细胞或借助超声波细胞破碎仪破碎细胞后，5000rmp离心15min，即可获取提取物；（4）将上述hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合，在无菌条件下制备适合不同应用范围的可注射或外用制剂，其中hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc含量3%，另外，外用制剂还包含谷胱甘肽（5ug/ml）和烟酰胺（5mg/ml）等组分。
18.实施例3（1）分离、纯化和鉴定hfdmscs；分离及纯化：在胎儿离体1h内，无菌条件下保留薄层脂肪取下胎儿背部皮肤，用含有1.5%青霉素-链霉素溶液的pbs反复冲洗皮肤组织至冲洗液清澈无血污，0.3%氯霉素溶液中浸泡15min，后用高浓度青霉素-链霉素溶液（20%）pbs浸泡15min；修剪除去皮下脂肪组织及明显的毳毛，后剪成1.0 cm
×
1.0 cm大小皮片，置于0.3%的中性蛋白酶中，4℃过夜；后将真皮部分剪成泥状，于0.125% 的ⅰ型胶原酶中，恒温振荡器中37℃消化5min；将消化液用100目细胞滤网过滤后1000rmp离心7min，吸弃上清后用培养基洗涤沉淀，后用完全培养基重悬管底部细胞团；接种于培养瓶中，置于37℃、5%co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养至传代；（2）从培养的hfdmscs的条件培养基中获得hfdmscs-scc提取物；取第5代fdmscs培养，待细胞达到80%密度时，进行hfdmscs-scc的提取：首先吸弃细胞培养上清，换用空白培养基进行细胞饥饿，饥饿48小时后，吸取细胞培养上清，3000rpm离心10min去除细胞和细胞碎片，使用0.22μm滤器过滤上清液，将上清液转移至离心超滤
管，通过离心滤过的方法浓缩上清液，将浓缩后的上清液转移至15ml离心管中，将浓缩后的上清液加入提取试剂，按一定比例加入沉淀剂后置于4℃冰箱竖直静置过夜，次日取出离心管，即可获取提取物；（3）对hfdmscs进行破碎和离心，获得hfdmscs-nscc提取物；对hfdmscs进行粉碎，获取细胞成分，将细胞收集后用研磨棒研磨细胞或借助超声波细胞破碎仪破碎细胞后，5000rmp离心15min，即可获取提取物；（4）将上述hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc混合，在无菌条件下制备适合不同应用范围的可注射或外用制剂，其中hfdmscs-scc和hfdmscs-nscc含量5%，另外，外用制剂还包含谷胱甘肽（8ug/ml）和烟酰胺（8mg/ml）等组分。
19.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。