一种光动力学疗法的光敏剂及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种光动力学疗法的光敏剂及其制备方法和其在作为光动力抗乳腺癌药物中的应用。


背景技术：

2.光动力疗法（photodynamic therapy，pdt）是一种通过光敏剂（photosensitizer，ps）在特定波长的光激发下产生能量并传递给氧气，产生活性氧（reactive oxygen species，ros），从而治疗疾病的新技术。pdt因其准确性高、非侵入性、可控性、低毒性和可重复治疗等优点，已成为特定临床应用中的既定治疗选择。ps、氧气和光在pdt中起着重要作用，其中一项达不到要求便会影响pdt的效果。
3.藻蓝蛋白（phycocyanin，pc）是微藻中含量丰富的一种蛋白质，其对癌细胞具有光动力杀伤作用，但其光动力杀伤效果有限，这限制了其作为光动力学疗法光敏剂的发展。目前，探寻新型的、光动力杀伤效果更强的光动力学疗法的光敏剂依然是生物医药领域研究者努力的方向。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种光动力学疗法的光敏剂及其制备方法和应用。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种光动力学疗法的光敏剂，其是由藻蓝蛋白裂解物与zn离子偶联构成；所述藻蓝蛋白裂解物是由藻蓝蛋白断开硫醚键、切除蛋白质而得到的，其制备方法包括以下步骤：（1）提取以来源于螺旋藻的藻蓝蛋白为原料，采用加热回流法进行提取后过滤，将所得深蓝色溶液经旋转蒸发浓缩、真空干燥，得到藻蓝蛋白裂解物的粗品；（2）纯化将得到的藻蓝蛋白裂解物的粗品经硅胶柱层析和制备液相色谱进行分离纯化后，再将所得纯化溶液经蒸发浓缩、冷冻干燥，得到所述藻蓝蛋白裂解物。
6.进一步地，步骤（1）所述加热回流法采用乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙三醇、丙酮和水中的一种或者几种为提取溶剂，其料液比为1 g : 10-1000 ml，加热温度为10-100 ℃，回流时间为1-72h。
7.进一步地，步骤（2）所述硅胶柱层析中采用体积比为1:4的乙酸乙酯/乙醇为流动相进行洗脱；所述制备液相色谱的条件参数为：amethyst c
18-h色谱柱，以含0.1vol%乙酸的60vol%甲醇溶液为流动相，检测波长为370 nm。
8.经检测，所得藻蓝蛋白裂解物的紫外-可见吸收光谱的最大吸收峰出现在紫外光区，其吸收波长为365 nm，在可见光区620 nm处也有一个较弱的吸收峰，620 nm处的吸收峰低于365 nm处的吸收峰；其液相色谱在370 nm下只有两个色谱峰，其中一个色谱峰为强色谱峰，通过峰面
积的归一化法计算该强色谱峰的纯度为99%以上；其质谱在未经裂解能量进行裂解时只有一个分子峰出现，其分子量为587.3，当采用裂解能量cid@20对所述藻蓝蛋白裂解物进行裂解时，得到两个主要的片段峰，其分子量分别为299.1和464.2；当裂解能量cid@20增加至cid@40时，新增三个片段峰，分子量分别为271.1、346.2和406.2；其核磁共振氢谱为： 1
h nmr（500 mhz，pyridine-d5）：7.31（s, 1h），6.33（d，j = 2.2 hz，1h），6.10（s，1h），5.89（s，1h），3.38（q，j = 7.2 hz，1h），3.21（t，j = 7.1 hz，2h），3.14（t，j = 7.5 hz，2h），2.89（d，j = 7.3 hz，2h），2.86（d，j = 7.7 hz，2h），2.51（p，j = 6.4 hz，2h），2.16（s，3h），2.11（d，j = 4.0 hz，3h），2.04（s，3h），1.72（d，j = 7.2 hz，3h），1.50（d，j = 7.6 hz，3h），1.26（t，j = 7.6 hz，3h）；其荧光光谱中，所述藻蓝蛋白裂解物在激发波长ex=553 nm或em=664 nm下不产生荧光。
9.进一步的，所述光敏剂的制备方法包括以下步骤：（1）将藻蓝蛋白裂解物于二甲基亚砜中溶解，得到浓度为1-100 μmol/l的藻蓝蛋白裂解物溶液；（2）将硫酸锌于水中溶解，得到浓度为1-100 μmol/l的硫酸锌溶液；（3）将配制好的藻蓝蛋白裂解物溶液和硫酸锌溶液等体积混合之后放置在摇床中，10-60 ℃反应1-72 h，制得zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物。
10.上述所得光敏剂可用于制备光动力抗癌药物，尤其是光动力抗乳腺癌药物。
11.进一步的，所用光照为波长400-900 nm的光或含有400-900 nm波长光的混合光源，其照射时间为5-30 min，优选为20-30 min。
12.本发明的显著优点在于：（1）本发明光敏剂为一种新型的光动力学疗法光敏剂，采用dpbf法检测所述光敏剂在体外的活性氧量子产率为0.278，与藻蓝蛋白裂解物（0.130）相比提高了113.8 %，说明偶联物的活性氧量子产率得到极大幅度的提高，这使其能够作为光动力学疗法光敏剂。
13.（2）本发明光敏剂在光照照射条件下作用于人乳腺癌mcf-7细胞，可使细胞被显著杀伤，还能诱导人乳腺癌mcf-7细胞的调亡，证明其能够用于制备光动力抗癌药物。
14.（3）本发明光敏剂比藻蓝蛋白裂解物具有更高的安全性。
附图说明
15.图1为实施例所制备藻蓝蛋白裂解物的液相色谱图；图2为实施例所制备藻蓝蛋白裂解物在未经裂解能量进行裂解时的质谱图；图3为实施例所制备藻蓝蛋白裂解物在经裂解能量cid@20进行裂解时的质谱图；图4为实施例所制备藻蓝蛋白裂解物在经裂解能量cid@40进行裂解时的质谱图；图5是实施例所制得藻蓝蛋白裂解物和zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物的紫外-可见吸收光谱图；图6是实施例所制得zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物的荧光光谱图。
具体实施方式
16.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例
17.一、藻蓝蛋白裂解物的制备（1）提取以来源于螺旋藻的藻蓝蛋白为原料，采用乙醇加热回流法进行提取后过滤，除去绿色沉淀，所得深蓝色溶液经旋转蒸发浓缩、真空干燥，得到藻蓝蛋白裂解物粗品。其具体操作为：在装有500 ml无水乙醇的1000 ml烧瓶中加入5.0g藻蓝蛋白，然后在温度为88℃的水浴锅中回流反应5 h。结束反应后，将烧瓶置于冷水中冷却15min。过滤，收集深蓝色的溶液。将所得深蓝色溶液旋转蒸发至干，加入少量蒸馏水重悬后转移至离心管，在8000 rpm条件下离心10 min，收集沉淀。把沉淀用蒸馏水洗涤，离心收集，重复两次后进行真空冷冻干燥，得到藻蓝蛋白裂解物粗品。
18.（2）纯化将得到的藻蓝蛋白裂解物的粗品经硅胶柱层析和制备液相色谱进行分离纯化后，再将所得纯化溶液经蒸发浓缩、冷冻干燥，得到所述藻蓝蛋白裂解物。其具体操作为：称取60g 200目的硅胶，采用同体积量的石油醚溶胀后，边搅拌边倒入柱子中（过程中要避免气泡的产生）。待硅胶自由沉降后，用石油醚压实和平衡柱子。待柱子平衡后，称取10mg的藻蓝蛋白裂解物粗品，用1ml乙醇完全溶解，再加1g 200目硅胶拌匀，使藻蓝蛋白裂解物粗品吸附在硅胶表面，然后放置烘箱中进行干燥。待溶剂挥发后，用石油醚进行上样，然后在其上面加上一层石英砂。上样结束后，先用乙酸乙酯作洗脱剂，洗脱去除杂质，再用v
乙酸乙酯
:v
乙醇
=20:80作为洗脱剂进一步洗脱，将呈蓝色的洗脱液收集起来，得到纯化的藻蓝蛋白裂解物。将所得纯化的藻蓝蛋白裂解物进行浓缩后，用60%甲醇溶液（加入0.1 %乙酸）作为流动相，采用制备液相色谱法进一步纯化，并将呈蓝色的洗脱液收集起来，再进行蒸发浓缩，最后经冷冻干燥，得到藻蓝蛋白裂解物纯品，避光干燥保存。其中，所用色谱柱为amethyst c
18-h（4.6
×
250 mm，5 μm）；流动相流速为1 ml/min；检测波长为370 nm；进样体积为100 μl。
19.（3）纯度测试所制得藻蓝蛋白裂解物的纯度为99.97 %。
20.（4）藻蓝蛋白裂解物的结构鉴定上述制得的藻蓝蛋白裂解物经液相色谱、质谱、核磁共振氢谱、紫外-可见吸收光谱和荧光光谱进行分析，分析结果如下：液相色谱：在370 nm下只有两个色谱峰，其中一个色谱峰为强色谱峰，所述强色谱峰的保留时间在14.262min，通过峰面积的归一化法计算该强色谱峰的纯度为99%以上；质谱：在未经裂解能量进行裂解时所述藻蓝蛋白裂解物只有一个分子峰出现，其分子量为587.3，当采用裂解能量cid@20对所述藻蓝蛋白裂解物进行裂解，得到两个主要的片段峰，其分子量分别为299.1和464.2；当裂解能量增加至cid@40时，新增三个片段峰，分
子量分别为271.1、346.2和406.2；核磁共振氢谱：1h nmr（500 mhz，pyridine-d5）：7.31（s, 1h），6.33（d，j = 2.2 hz，1h），6.10（s，1h），5.89（s，1h），3.38（q，j = 7.2 hz，1h），3.21（t，j = 7.1 hz，2h），3.14（t，j = 7.5 hz，2h），2.89（d，j = 7.3 hz，2h），2.86（d，j = 7.7 hz，2h），2.51（p，j = 6.4 hz，2h），2.16（s，3h），2.11（d，j = 4.0 hz，3h），2.04（s，3h），1.72（d，j = 7.2 hz，3h），1.50（d，j = 7.6 hz，3h），1.26（t，j = 7.6 hz，3h）；紫外-可见吸收光谱：所得藻蓝蛋白裂解物的最大吸收峰出现在紫外光区，其吸收波长为365 nm，在可见光区620 nm处也有一个较弱的吸收峰，620 nm处的吸收峰低于365 nm处的吸收峰；荧光光谱：所得藻蓝蛋白裂解物在激发波长ex=553 nm或em=664 nm下不产生荧光。
21.二、zn-藻蓝蛋白裂解物的制备（1）zn-藻蓝蛋白裂解物的提取将所得藻蓝蛋白裂解物用二甲基亚砜配成浓度为50 μm的藻蓝蛋白裂解物溶液，将硫酸锌用蒸馏水配成浓度为50 μm的硫酸锌溶液，然后将两者按体积比1:1混合，放置摇床中，30 ℃反应24 h，再经500 da的透析膜透析，制得zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物。
22.（2）zn-藻蓝蛋白裂解物的结构鉴定对zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物进行紫外-可见吸收光谱和荧光光谱的表征。实验结果如下：在紫外光区，藻蓝蛋白裂解物有一个强的吸收峰（吸收波长为365nm），而zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物的吸收峰（吸收波长为365nm）显著下降；在可见光区，藻蓝蛋白裂解物只有一个单一的吸收峰（吸收波长为620nm），而zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物出现两个吸收峰。
23.zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物在激发波长ex = 582 nm或ex = 620 nm下能够产生荧光，发射波长em = 632 nm。而藻蓝蛋白裂解物则在激发波长ex = 582 nm或ex = 620 nm下不产生荧光。这说明将藻蓝蛋白裂解物与锌离子结合得到的zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物能够使荧光特性重现，并且其荧光性质稳定，可应用于荧光试剂、流式细胞仪以及免疫化学等研究领域。
24.三、zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物的活性氧量子产率测定1,3-二苯基异苯并呋喃（1,3-diphenylisobenzofuran，dpbf）在ros的存在下会发生开环反应，使其本身在417 nm处的紫外吸收随着光照时间的延长逐渐减弱。采用dpbf法检测zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物产生ros的能力。其具体操作为：称取一定量的dpbf粉末，溶于二甲基亚砜中，配制成溶度为50
ꢀµ
mol/l的dpbf溶液，再加入一定量的zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物，使得偶联物的终浓度为2
ꢀµ
mol/l，用660 nm的红光照射，输出光功率为80 mw/cm2，每次光照5 min，光照5次，获得每次dpbf在417 nm处的吸光度值（记为a
t
），作a
t-a0与照射时间t之间的关系曲线，求直线区域的斜率k，记为dpbf的单位时间漂白速率。以亚甲基蓝（mb）为产生活性氧的标注参比物质，同样在相同的条件下，每次光照1 s，光照3次，同样计算dpbf的单位时间漂白速率。然后用下式计算活性氧量子产率。
25.φ
△
(sam)
=（a
mb
/a
sam
）
·
（k
sam
/k
mb
）
·
φ
△
(mb)
，其中，a
sam
和a
mb
分别代表待测样品和mb在最大吸收波长处的吸光度值；k
sam
和k
mb
分
别代表待测样品和mb存在时的dpbf单位时间漂白速率；φ
△
(mb)
即参比的活性氧量子产率（φ
△
(mb)
=1.0）。
26.实验结果如下：在dpbf溶液中加入zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物后，随着照射时间的延长，417 nm处的吸收峰值逐渐降低。从外观颜色也可以观察到，dpbf溶液的颜色从原来的亮绿色逐渐变浅，直至无色。而不加zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物的dpbf溶液在接受相同时间、相同光源照射后，在417 nm处吸光度值基本保持不变。表明zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物在660 nm红光的激发下产生了ros。经计算，zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物的活性氧量子产率为0.278，与藻蓝蛋白裂解物的活性氧量子产率（0.130）相比提高了113.8 %。因此，将藻蓝蛋白裂解物与锌离子结合形成zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物能够显著提高活性氧量子产率。
27.四、非光照和光照条件下zn-藻蓝蛋白裂解物对mcf-7细胞的增殖抑制作用将人乳腺癌mcf-7细胞（购自中科院上海研究所）接种在96孔板中，接种密度为每孔104个细胞。培养24 h后吸弃培养液，分别加入5、10、50、100、150和200
ꢀµ
mol/l的zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物溶液。设置不同的照射波长（660、760、808 nm和白光），照射20 min，输出光功率为80mw/cm2，光照处理24小时，作为药物组。并设空白对照组（不进行光照处理）。各药物组和空白对照组均在490 nm下采用mtt试剂检测每个孔的吸光值，并计算细胞的存活率。
28.实验结果如下：（1）非光照条件下，随着zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物浓度的增加，细胞存活率略微下降，当zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物浓度达到200 μmol/l，mcf-7的细胞存活率为80.87
±
1.04 %，其ic
50
》1000 μmol/l，说明zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物对mcf-7细胞不具有显著的暗毒性；（2）光照条件下，随着zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物浓度的增加，细胞存活率显著下降，至zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物浓度为150 μmol/l，细胞存活率只有17.28
±
1.94 %。其光抗癌活性与浓度正相关，ic
50
值为42.91
±
0.57 μmol/l。相比之下，藻蓝蛋白裂解物对mcf-7细胞的增殖抑制作用在光功率90 mw/cm2下的ic
50
值仅为58.26
±
1.19 μmol/l，实验结果表明，zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物对mcf-7细胞具有显著的光毒性。
29.由上述实验结果可知，zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物在光照条件下产生活性氧并诱导了癌细胞的凋亡，其作用效果较藻蓝蛋白裂解物更强，因此，其可作为光动力抗乳腺癌药物进行应用。
30.为促进其应用，本发明还根据现有文献（chen s, zhang p, liu x, et al. towards cheminformatics-based estimation of drug therapeutic index: predicting the protective index of anticonvulsants using a new quantitative structure-index relationship approach[j]. journal of molecular graphics and modelling, 2016, 67: 102-110）计算了zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物的治疗指数。
[0031]
结果显示，zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物对huvec细胞的治疗指数为5.856，相同条件下，藻蓝蛋白裂解物对huvec细胞的治疗指数为2.223。治疗指数是评估新药安全性的一种指标，治疗指数越大，说明药物的安全性越高。因此，zn-藻蓝蛋白裂解物偶联物比藻蓝蛋白裂解物具有更高的安全性。
[0032]
本发明对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。