禽戊型肝炎病毒ORF3亚单位疫苗及其制备方法

禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.禽戊型肝炎病毒(avian hepatitis e virus，ahev)被认为是鸡大肝大脾病(big liver and spleen，bls)和肝破裂出血综合征(hepatic rupture and hemorrhage syndrome，hrhs)的主要病原。禽hev对各国养禽业造成了严重的经济损失，早在2010年，zhao等人发现中国禽hev分离株基因组序列与欧洲禽hev同源性高达98.3％(zhao et al.,2010)，近几年的流行病学调查结果表明，ahev在中国的检出率正在不断增加(su et al.,2018；su et al.,2020；zhao et al.,2017；zhang et al.,2022；liu et al.,2018；li et al.,2020)。迄今为止，全球还没有针对ahev的商品化疫苗可供使用。
3.目前还缺乏高效的体外培养体系可以用于ahev的大规模培养，这给传统灭活疫苗和弱毒活疫苗的研究带来很大困难，为此多数研究聚焦于ahev基因工程亚单位疫苗。禽hev基因组包括三个开放阅读框(open reading frame,orf)，分别为orf1、orf2和orf3(kabrane-lazizi et al.,1999)。orf2与病毒感染入侵宿主细胞有着密切的联系，在衣壳蛋白组装的过程中发挥作用，现有技术中对于ahev基因工程亚单位疫苗的研究也多集中于orf2。
4.orf3编码最小的磷酸化蛋白。近年来研究发现，orf3含有能够刺激动物机体产生强烈免疫反应的抗原表位，且能够影响病毒颗粒的装配释放、免疫抑制以及细胞的信号传导等方面(蒋奉霖，2014)，被认为是研制ahev亚单位疫苗潜在的候选靶蛋白之一。zhao等人通过对中国分离株cahev-orf3抗原表位鉴定发现，cahev-orf3上存在3个抗原结构域，分别为(aa)1-28、55-74和75-88三处，其中aa 75-88为主要抗原结构域，通过特异性单抗鉴定发现，该结构与至少存在2个抗原表位，且该结构域为明显的优势结构域(zhao etal,2002)。
5.因此，通过对orf3的深入研究，能够为抗戊型肝炎病毒疫苗的设计开辟新的途径。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗及其制备方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面，提供一种禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗，由抗原组合物和疫苗佐剂组成；
9.所述抗原组合物由vahev orf3重组蛋白和yt-ahev orf3重组蛋白组成；
10.所述vahev orf3重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述yt-ahev orf3重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.优选的，所述vahev orf3重组蛋白和yt-ahev orf3重组蛋白的重量比为1:1。
12.优选的，所述抗原组合物和疫苗佐剂的重量比为1:1。
13.优选的，所述疫苗佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
14.本发明的第二方面，提供上述禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)将vahev orf3重组蛋白和yt-ahev orf3重组蛋白按重量比1:1混合均匀，得到抗原组合物；
16.(2)将抗原组合物与佐剂混合，乳化，即制备得到禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗。
17.本发明的第三方面，提供上述禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗在制备预防或治疗由禽戊型肝炎病毒引起的疾病的制品中的应用。
18.上述应用中，由禽戊型肝炎病毒引起的疾病包括但不限于：鸡大肝大脾病和肝破裂出血综合征。
19.本发明的有益效果：
20.本发明通过对通过对禽戊型肝炎病毒orf3的深入研究，以vahev orf3重组蛋白和yt-ahev orf3重组蛋白为有效成分，开发设计了禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗。本发明的禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗具有很好的免疫效果，可减轻ahev对鸡生产性能造成的不利影响。
附图说明
21.图1：禽戊型肝炎病毒orf3重组蛋白的制备；图中，a：orf3扩增凝胶电泳图.m:marker；1：阴性对照；2：yt-ahev orf3扩增片段；3：vahev orf3扩增片段；
22.b：orf3重组质粒的酶切片段.m:marker；1，2:酶切后的orf3重组质粒和pmd
tm 18-t载体；
23.c：orf3蛋白胶sds-page结果图.m：marker；1：yt-ahev orf3包涵体；2：vahev orf3包涵体；
24.d：orf3蛋白纯化图.m:marker；1：yt-ahev orf3纯化后蛋白；2：vahev orf3纯化后蛋白。
25.图2：鸡orf3抗体血清的间接免疫荧光；(a)yt-ahev；(b)vahev；(c)yt+vahev；(d)空白对照。
26.图3：试验例3中不同处理组的鸡的体重结果。
具体实施方式
27.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
28.由于禽戊型肝炎病毒变异性强，没有稳定的体外培养系统，因此，临床上还未有针对该病毒的商品化疫苗。而且，禽hev的高变性使得不同菌株同源性较低，很难实现只免疫单一疫苗即可达到较好保护效果。
29.为解决目前临床存在的困境，本发明分别扩增了中国蛋鸡中鉴定的vahev株和肉
鸡中鉴定的yt株orf3基因，并以其原核表达蛋白作为免疫原免疫了spf鸡，观察了其免疫原性及对hev感染的保护作用。本发明通过对两株不同来源且差异较大的病毒，混合制备了亚单位疫苗。该实验不仅解决了禽戊型肝炎疫苗的空白，也进一步扩大了疫苗的抗体保护范围。
30.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
31.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
32.实施例1：重组蛋白的制备
33.针对vahev(蛋鸡来源)的毒株序列(ncbi genbank，登录号为：mg976720.1)和yt-ahev(肉鸡来源)的毒株序列(ncbi genbank，登录号为：mz736614.1)，分别设计了orf3的扩增引物。其中：
34.vahev株对应的上游引物序列和下游引物序列分别为：
35.va-orf3-f：5
’‑
ggatccatgcgcctcggctgccagcac-3’；(seq id no.3)
36.va-orf3-r：5
’‑
ctcgagctacatctggtaccgtgcg-3’。(seq id no.4)
37.yt-ahev对应的上游引物序列和下游引物序列分别为：
38.yt-orf3-f：5
’‑
ggatccatgtgtcttagttgccagtt-3’；(seq id no.5)
39.yt-orf3-r：5
’‑
ctcgagctacgtctggtaccgtgcga-3’。(seq id no.6)
40.va-orf3-f、va-orf3-r引物扩增产物的长度为261bp，其序列如seq id no.7所示；具体如下：
41.va-orf3(261bp)atgcgcctcggctgccagcactgtctgcagtgccaggagactccggtgggatgtcgtcgcgtggattgctgctcatgcttgcaatgtgctgcggggtgtcaaggggctcccaagcgctcccagcccgagattggcgcggccaaccccgccgcgacaactcagcacagtggagcgctcaagaacgccctgaaggagccgtcggcccagctgcttccactgatgttgtcaccgcggcaggtactcgcacggtaccagatgtag。
42.yt-orf3-f、yt-orf3-r引物扩增产物的长度为264bp，其序列如seq id no.8所示；具体如下：
43.yt-orf3(264bp)atgtgtcttagttgccagttctggtgtttggagtgccaggatagtggggtgggatgtcgctgcgtggattgctgctcatgcttgctatgtgctgcggggtgtcaaggggctcccaaacgctcccagcaggaagcaggcgcggtcaacgccgccgtgacaacccagcccagtggagcgctcaacaacgccccgaaggagccgtcggccccgcccctcttaccgacgttgtcaccgcggcaggtactcgcacggtaccagacgtag。
44.对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中a所示，条带单一且与理论长度相符，对电泳产物进行纯化。接下来进行重组质粒的构建，酶切正确的片段(图1，b)连接在peasy-blunt表达载体上构建得到重组质粒并转化入宿主菌bl21，获得重组菌。重组菌进行扩增培养，培养条件为37℃，220r，培养2小时；大量扩增重组菌液进行诱导表达，诱导表达加入iptg，终浓度为1mmol/l，诱导条件为30℃，诱导时间为6h。蛋白小量表达结果显示目的蛋白主要存在于蛋白包涵体当中，上清中蛋白量很少，蛋白分子量大小约为34kda(图1，c)。随后按照试剂盒标准流程(ni-nta亲和层析介质、protein a亲和层析介质和层析柱购自金斯瑞生物科技公司)完成了蛋白纯化(图1，d)。
45.通过上述方法分别制备得到vahev orf3重组蛋白和yt-ahev orf3重组蛋白，其
中，vahev orf3重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；yt-ahev orf3重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。具体如下：
46.vahev orf3：mrlgcqhclqcqetpvgcrrvdccsclqcaagcqgapkrsqpeigaanpaattqhsgalknalkepsaqllplmlsprqvlaryqm.
47.yt-ahev orf3：mclscqfwclecqdsgvgcrcvdccscllcaagcqgapkrsqqeagavnaavttqpsgalnnapkepsappllptlsprqvlaryqt.
48.实施例2：禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗的制备
49.通过bca蛋白定量法，对实施例1纯化好的vahev orf3重组蛋白和yt-ahev orf3重组蛋白进行定量。将定量后的vahev orf3重组蛋白(2454.41μg/ml)和yt-ahev orf3重组蛋白(2147.21μg/ml)按照重量比1:1混合，得到抗原组合物。然后将抗原组合物与弗氏完全佐剂按重量比1:1混合，使用蛋白乳化器常温搅拌乳化，将乳化好的蛋白滴到水中不散，形成稳定油包水结构即为乳化完全，制备得到禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗。
50.对比例1：
51.将实施例1制备的vahev orf3重组蛋白与弗氏完全佐剂佐剂按照重量比1：1混合乳化，vahev orf3重组蛋白的重量与实施例2中抗原组合物的重量相同，制备得到亚单位疫苗a。
52.对比例2：
53.将实施例1制备的yt-ahev orf3重组蛋白与弗氏完全佐剂佐剂按照重量比1：1混合乳化，yt-ahev orf3重组蛋白的重量与实施例2中抗原组合物的重量相同，制备得到亚单位疫苗b。
54.试验例：
55.1、试验方法：
56.所用鸡为spf鸡(品系：来航；购自济南赛斯)，随机分成四组，分别在1、7、14日龄进行三次免疫操作，通过对鸡颈部皮下注射的方式进行免疫试验，每只鸡每次免疫蛋白100μg。
57.yt-ahev组免疫对比例2制备的亚单位疫苗b；
58.vahev组免疫对比例1制备的亚单位疫苗a；
59.yt+vahev组免疫实施例2制备的禽戊型肝炎病毒orf3亚单位疫苗；
60.以注射等量生理盐水作为空白对照。
61.三次免疫完成后进行抗体检测，以免疫后鸡血清作为一抗(1:50倍稀释)，以fitc标记的兔抗鸡lgg抗体作为二抗，在感染ahev(毒株为国内流行毒株yt-ahev(genbank id:mz736614.1))的lmh细胞上进行ifa检测。
62.检测免疫蛋白鸡的hev抗体转为阳性后，在35日龄和42日龄，进行两次ahev攻毒实验。每只鸡采取静脉注射和腿部肌肉注射相结合的方式，接种yt-ahev毒株(genbank id:mz736614.1)600tcid50。攻毒后第4天、第7天每组抽检6只鸡采集肛门拭子，提取rna后进行实时荧光定量pcr检测ahev病毒载量，ct值小于30判为ahev阳性。
63.第二次攻毒两周后，各组随机抽取8只鸡称重。
64.2、试验结果：
65.结果表明免疫后能够成功诱导鸡体产生抗体(图2)。分别将免疫蛋白的鸡血清按
照1：50、1：100、1：150稀释，当均按照1：150稀释时，yt+vahev组免疫血清仍具有较好识别效果。
66.经yt株两次攻毒后，各组泄殖腔拭子进行针对hev的实时荧光定量pcr检测。结果显示(表1)，攻毒后第2天、第4天和第7天检测时，未免疫对照组泄殖腔拭子ahev核酸阳性率均为100％，yt-ahev蛋白免疫组攻毒后第2天、第4天和第7天阳性率分别为：4/8、0/8、0/8；vahev蛋白免疫组攻毒后第2天、第4天和第7天阳性率分别为：5/8、1/8、0/8；而混合蛋白免疫组攻毒后第2天、第4天和第7天阳性率分别为：3/8、0/8、0/8。上述试验表明免疫蛋白后产生的抗体成功阻断了ahev在体内的增殖和排毒，且混合蛋白免疫组保护效果最好。
67.表1：不同处理组免疫后天数的病毒阳性检出率
68.攻毒后天数vahev组yt-ahev组yt+vahev组对照组25/84/83/88/841/80/80/88/870/80/80/88/8
69.攻毒两周后，各组随机抽取8只鸡称重，体重均值由高到低依次为yt+va-orf3混合蛋白免疫组(1001.875g)、va-orf3蛋白免疫组(949g)、yt-orf3蛋白免疫组(879.25g)、未免疫对照组(793.625g)，说明ahev感染后会对鸡生长造成抑制，orf3亚单位疫苗免疫可减轻ahev对生产性能的不利影响(图3)。
70.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。