一种红茶发酵滤液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品生产技术领域，具体涉及一种红茶发酵滤液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着生活水平的提高，面部皮肤的护理越来越受到人们的关注。皮肤护理首先是要给皮肤补充水分，富有弹性光滑滋润的皮肤很大程度上归功于皮肤内的水分，皮肤缺水会降低皮肤细胞的新陈代谢，导致皮肤出现细纹、暗沉等问题。因此，使用保湿化妆品是保持皮肤光滑、柔软、富有弹性的重要途径。目前市场上保湿护肤品种类繁多，但大都存在持续性差的问题，很难达到12小时持续高效保湿的效果。
3.美容护肤品已经从化学美容、植物美容发展到生物美容、基因美容的阶段，在护肤品中添加生物活性物质已经成为美容界的潮流。生物活性物质虽然含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代射活动发挥生物调节作用。在日常护理方面，生物活性物质是皮肤护理的最佳活性成分，能够控制或调节皮肤老化进程，保护受损皮肤，延缓皮肤老化，对保持正常皮肤的结构和功能、维持机体的正常生理活动和代谢具有重要意义。
4.到目前为止，研究发现的生物活性物质有很多，其中有不少已被添加到美容护肤品中，例如植物或微生物中的生物酵素和动物胶原蛋白，在延缓皮肤衰老提供皮肤养分、促进皮肤细胞新生、消除皮肤皱纹等方面有着重要的作用。另外，很多活性物质，如水解蛋白，多肽，天然植物激素。护肤品中的红茶发酵提取物，富含益生菌菌株，比如乳酸杆菌，它可以帮助镇静皮肤刺激，有助于皮肤抗衰老、美白、抗菌，是一种应用潜力较大的成分。
5.cn113925814a公开了一种含酵母菌绿茶发酵产物的保湿精华水及其制备方法，提出了一种含酵母菌绿茶发酵产物的保湿精华水及其制备方法，本发明通过添加酵母菌绿茶发酵产物来代替传统保湿水工艺中的水，保留了绿茶原有的营养功效，使得该保湿精华水具有更好的保湿、抗氧化、防衰老效果，促进皮肤稳定，使皮肤处于长期处于健康状态。大量科学发现表明，红茶中含有比绿茶更高含量的茶黄素和茶红素，这些物质能够有效地抑制活性氧的增加和黑色素的沉淀。
6.cn114145368a公开了一种红茶叶提取物及其制备方法，通过以高含量含有茶褐素，从而具有抗氧化效果、抗老化效果、抗炎效果以及因应激现象受损的皮肤修复效果优秀的优点。红茶含有的茶褐素具有良好的抗氧化能力，如果进一步将红茶进行益生菌发酵，可以将红茶的有益成分溶出和转化，显著提升红茶提取液的抗氧化，抗衰功效。
7.cn104906028b公开了一种新的改善皮肤问题的发酵物组合物，及以该发酵物组合物为主体的化妆品及其应用，本发明组合物的原料含有cfte培养基，和ets发酵物种子液。本发明是在皮肤科学、中医药学、生物学等相关研究的基础上，科学配伍，形成一种具有多重功效且功能显著的发酵物组合物，主要表现在优良的抗皱、美白、保湿等功效，使用舒服安全，对皮肤无刺激。因此，起到抗氧化、抗炎、抗刺激、祛痘、舒缓作用的主要成分是多酚和发酵物种子液，红茶中含有丰富的多酚，可以产生良好的抗氧化、抗炎、抗皱等功效。
8.虽然现有技术中已经公开了一些红茶有效成分的提取工艺，但是，目前对红茶有效成分的提取大多数采用物理方法，大量实践表明，采取生物发酵可以更好实现红茶中有益成分的高效溶出和转化，同时红茶发酵液中富含益生菌，两者协同作用进一步增加产品的功效。
9.因此，开发一种生物发酵制备方法在可以有效溶出红茶中的有效成分的同时对红茶提取液进行多重发酵，实现益生菌与红茶的双向发酵，促使红茶发酵滤液具有较好的保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果，克服红茶有效成分溶出率低和红茶产品作用效果得不到有效提升的问题，是本领域的研究重点。


技术实现要素：

10.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种红茶发酵滤液及其制备方法和应用，所述红茶发酵滤液实现多种益生菌与红茶提取液的多重发酵，使红茶发酵滤液具有较好的保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果，克服红茶有效成分溶出率低和红茶产品作用效果得不到有效提升的问题。
11.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种红茶发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：(1)将红茶提取液与发酵培养基混合、灭菌；(2)将酵母菌种子液接种到步骤(1)得到的灭菌混合液，进行一次发酵；(3)将乳酸菌种子液、醋酸菌种子液接种到步骤(2)得到的发酵液中，进行二次发酵；(4)发酵结束后，过滤、灭菌，得到所述红茶发酵滤液。
12.本发明涉及的红茶发酵滤液的制备方法中使用的红茶提取液原料中含有丰富的有益成分，其中，茶多酚作为一种抗氧化剂具有抗氧化、防辐射、抗衰老等多种生理活性；茶黄素通过调节体内的生物酶系的活性、直接消除自由基、与金属离子络合以及防止低密度脂蛋白的氧化等途径来实现它的抗氧化作用。采用酵母菌进行一次发酵再乳酸菌复合醋酸菌进行二次发酵的方式能够使最终得到的红茶发酵滤液中固形物(≥7.5%)，多酚(≥13.5g/l)，有机酸(≥0.12%)等有效成分含量较高，使红茶发酵滤液具有保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果。上述益生菌成分可以促进机体内活性成分在皮肤层的输送，还可以促进皮肤表面细菌的平衡并产生皮肤新陈代谢所必需的矿物质以及微量元素等，可以刺激皮肤增殖和生长，从而综合达到抗衰老、抗氧化、抗炎、保湿的效果。具体地，酵母菌含有丰富的天然氨基酸，促进新陈代谢并加快自我修复的基础上还可以有效抑制络氨酸酶的活性具有美白的作用；乳酸菌作为抗氧化剂可以有效清除自由基，延缓衰老，同时还要抗粉刺和抗面疱的作用；醋酸菌有着与所述酵母菌类似的功效，可以抗衰老并同上述两类菌协同作用增强所述红茶发酵滤液的护肤功效。将酵母菌、乳酸菌和醋酸菌三种菌与红茶提取液进行复合发酵得到的红茶发酵滤液不仅具有良好的发酵清香和澄清透明特点，更具有良好的保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果，并且三种菌在发挥上述功效上相互促进，具有协同增效效果。
13.优选地，所述发酵培养基以重量份计包括如下原料：碳源
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5~10份
氮源
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5~20份维生素
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0.2~0.5份低聚果糖
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0.5~2.0份。
14.所述碳源为5~10份，例如可以为6份、7份、8份或9份等。
15.所述氮源为5~20份，例如可以为6份、8份、10份、12份、14份、16份或18份等。
16.所述维生素为0.2~0.5份，例如可以为0.25份、0.3份、0.35份、0.4份或0.45份等。
17.所述低聚果糖为0.5~2.0份，例如可以为0.6份、0.8份、1.0份、1.2份、1.4份、1.6份或1.8份等。
18.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
19.优选地，所述碳源包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖或蜂蜜中的任意一种或至少两种的组合。
20.优选地，所述氮源包括蛋白胨。
21.优选地，所述维生素选自维生素b、维生素h或维生素e中的任意一种或至少两种的组合。
22.维生素清除自由基和抗炎症的功效，在培养基中加入维生素可以促进本发明的红茶发酵滤液的保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果。
23.优选地，所述酵母菌包括酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母或酒香酵母中的任意一种或至少两种的组合，优选为酿酒酵母。
24.优选地，所述乳酸菌包括乳杆菌、双歧杆菌或乳球菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为乳杆菌和/或乳球菌。
25.优选地，所述乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或鼠李糖乳杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为副干酪乳杆菌和/或植物乳杆菌。
26.优选地，所述醋酸菌包括巴氏醋杆菌、拟木醋杆菌、木醋杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选木醋杆菌。
27.优选地，所述红茶提取液的制备方法包括：将新鲜红茶置于室内摊晾，红茶含水量降至40~65%后放入滚筒微波杀青，再揉捻成条，捂堆发酵，烘干研磨成红茶细粉，红茶细粉与水混合、浸泡得到红茶提取液，含水量例如可以为42%、44%、46%、48%、50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%或64%等。
28.优选地，室内温度15~23℃，例如可以为16℃、18℃、20℃或22℃等，相对湿度50~60%，例如可以为52%、54%、56%或58%等。
29.优选地，烘干温度110~128℃，例如可以为112℃、114℃、116℃、118℃、120℃、122℃、124℃或126℃等，烘干时间15~20 min，例如可以为16 min、17 min、18 min或19 min等。
30.优选地，所述红茶细粉与所述水的比例为(3~10):(60~100)，例如可以为4:70、4:80、4:90、5:70、5:80、5:90、6:70、6:80、6:90、7:70、7:80、7:90、8:70、8:80、8:90、9:70、9:80或9:90等，优选为(4~6):(70~80)。
31.优选地，所述红茶细粉的粒径为40~100目，例如可以为50目、60目、70目、80目或90目等，优选为50~60目。
32.优选地，所述浸泡的时间为1~2 h，例如可以为1.2 h、1.4 h、1.6 h或1.8 h等。
33.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
34.本技术所涉及的红茶发酵滤液的红茶提取液原料可以通过本领域的常规技术方法获得，更优选上述的提取方案，使得制得的终产物红茶发酵滤液具有更优异的保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果。
35.优选地，步骤(1)所述灭菌的温度为120~125℃，例如可以为121℃、122℃、123℃或124℃等，灭菌的时间为5~10 min，例如可以为6 min、7 min、8 min或9 min等。
36.优选地，步骤(2)所述一次发酵的温度为28~35℃，例如可以为29℃、30℃、31℃、32℃、33℃或34℃等，优选为30~32℃，时间为24~72 h，例如可以为25 h、30 h、35 h、40 h、45 h、50 h、55 h、60 h、65 h或70 h等，优选为50~65 h。
37.优选地，所述一次发酵的通气量0~0.5 vvm但不包括0，例如可以为0.1 vvm、0.2 vvm、0.3 vvm或0.4 vvm等。
38.优选地，所述一次发酵在摇床中进行，摇床速度为120~200 r/min，例如可以为130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min或180 r/min等，优选为150~180 r/min。
39.优选地，所述酵母菌种子液的接种量为2~5%，例如可以为2.5%、3%、3.5%、4%或4.5%等。
40.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
41.优选地，所述酵母菌种子液的制备方法包括：将酵母菌接种至培养基中，培养转接2~3代作为种子培养基，每代培养11~12 h，得到所述酵母菌种子液。
42.优选地，步骤(3)所述二次发酵的温度为30~32℃，例如可以为30.5℃、31℃或31.5℃等，时间为24~48 h，例如可以为26 h、28 h、30 h、32 h、34 h、36 h、38 h、40 h、42 h、44 h、46 h或48 h等，优选为30~40 h。
43.优选地，所述二次发酵在摇床中进行，摇床速度为60~80 r/min，例如可以为62 r/min、64 r/min、66 r/min、68 r/min、70 r/min、72 r/min、74 r/min、76 r/min或78 r/min等，优选为70~75 r/min。
44.优选地，所述乳酸菌种子液的接种量为2~4%，例如可以为2.4%、2.8%、3.2%、3.6%或3.8%等，所述醋酸菌种子液接种量为1~3%，例如可以为1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.2%、2.4%、2.6%或2.8%等。优选地，所述乳酸菌种子液的制备方法包括：将乳酸菌接种至培养基中，培养转接3代作为种子培养基，每代培养10~11 h，得到所述乳酸菌种子液。
45.优选地，所述醋酸菌种子液的制备方法包括：将醋酸菌接种至培养基中，培养转接2~3代作为种子培养基，每代培养9~10 h，得到所述醋酸菌种子液。
46.优选地，所述过滤采用8~12 μm滤板，例如可以为9 μm、10 μm或11 μm等，优选为10 μm。
47.所述过滤采用8~12 μm滤板可以有效将培养基中混合液过滤得到纯度更高、杂质更少的红茶发酵滤液，过滤效果更好。
48.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
49.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的红茶发酵滤液的制备方法制备得到的红茶发酵滤液。
50.第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的红茶发酵滤液在化妆品中的应用。
51.添加所述红茶发酵滤液的化妆品具有保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等功效。
52.第四方面，本发明提供一种红茶精华液，其特征在于，所述红茶精华液以质量百分含量计包括：第二方面所述的红茶发酵滤液
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6~10%防腐剂
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0.3~0.5%保湿剂
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0.5~0.65%卡波姆941
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0.08~0.15%乳化剂
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0.08~0.12%螯合剂
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0.01 ~0.05%水。
53.所述红茶发酵滤液为6~10%，例如可以为6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%或9.5%等。
54.所述防腐剂为0.3~0.5%，例如可以为0.35%、0.4%或0.45%等。
55.所述保湿剂为0.5~0.65%，例如可以为0.52%、0.54%、0.56%、0.58%、0.6 %、0.62%或0.64%等。
56.所述卡波姆941为0.08~0.15%，例如可以为0.09%、0.1%、0.12%、0.13%或0.14%等。
57.所述乳化剂为0.08~0.12%，例如可以为0.09%、0.1%或0.11%等。
58.所述螯合剂为0.01~0.05%，例如可以为0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%或0.045%等。
59.优选地，所述防腐剂为包括羟基苯乙酮、苯氧乙醇、苯甲酸钠、尼泊金酯中的任意一种或至少两种的组合。
60.优选地，所述保湿剂包括1,2-己二醇、丁二醇、丙二醇、甘油中的任意一种或至少两种的组合。
61.优选地，所述乳化剂包括三乙醇胺、吐温80、司盘80中的任意一种或至少两种的组合。
62.优选地，所述螯合剂包括edta二钠、edta四钠、三磷酸钠、柠檬酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
63.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明所述红茶提取液中含有丰富的有益成分，其中，茶多酚作为一种抗氧化剂具有抗氧化、防辐射、抗衰老等多种生理活性；茶黄素通过调节体内的生物酶系的活性、直接消除自由基、与金属离子络合以及防止低密度脂蛋白的氧化等途径来实现它的抗氧化作用。本发明提供的红茶发酵滤液中固形物(≥7.5%)，多酚(≥13.5g/l)，有机酸(≥0.12%)等有效成分含量较高，使红茶发酵滤液具有保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果。同时本发明提供的红茶发酵滤液中含有的益生菌成分可以促进机体内活性成分在皮肤层的输送，使其保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤功效大幅提升。益生菌可以促进皮肤表面细菌的平衡并产生皮肤新陈代谢所必需的矿物质以及微量元素等，可以刺激皮肤增殖和生长，从而达到抗衰老的效果。酵母菌含有丰富的天然氨基酸，促进新陈代谢并加快自我修复的基础上还可以有效抑制络氨酸酶的活性具有美白的作用。乳酸菌作为抗氧化剂可以有效清除自由基，延缓衰老，同时还要抗粉刺和抗面疱的作用。醋酸菌有着与所述酵母菌类似的功效，可以抗衰老并同上述两类菌协同作用增强所述红茶发酵滤液的护肤功效。将酵母菌、乳酸菌
min，得到所述红茶发酵滤液。
75.实施例2本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：(1)将新鲜茶叶摊晾于23℃下至含水量为40~65%后，滚筒微波200℃杀青2 min，置于揉捻机中揉捻2 h至条状，捂堆发酵20 h，取出红茶，在120℃条件下烘干20 min后将茶叶研磨成50目的红茶细粉，将红茶细粉与水以重量比4:75进行混合，充分搅拌后浸泡1.5 h，得到红茶提取液。
76.(2)称取葡萄糖8份、蛋白胨18份，维生素e 0.4份、低聚果糖1.5份、红茶提取液80份，混合均匀得到发酵培养基，125℃灭菌8 min备用。
77.(3)将酿酒酵母接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到所述酵母菌种子液。将酵母菌种子液接种至发酵培养基中进行一次发酵，酵母菌种子液接种量为4%，30℃条件下摇床培养65 h，摇床速度为180 r/min，微氧通气量0.3 vvm。
78.(4)将副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳球菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到三种乳酸菌种子液。将木醋杆菌接种至mrs培养基中，培养转接2代，每代培养10 h，得到所述醋酸菌种子液。将副干酪乳杆菌种子液1%、植物乳杆菌种子液1%、乳球菌种子液1%和醋酸菌种子液1%接种至发酵培养基中进行二次发酵，32℃条件下摇床培养30 h，摇床速度为72 r/min。
79.（5）发酵培养结束后使用8 μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液85℃灭菌30 min，得到所述红茶发酵滤液。
80.实施例3本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：(1)将新鲜茶叶摊晾于16℃下至含水量为40~65%后，滚筒微波200℃杀青2 min，置于揉捻机中揉捻2 h至条状，捂堆发酵20 h，取出红茶，在125℃条件下烘干20 min后将茶叶研磨成50目的红茶细粉，将红茶细粉与水以重量比5:70进行混合，充分搅拌后浸泡1.2 h，得到红茶提取液。
81.(2)称取葡萄糖6份、蛋白胨8份，维生素b 0.3份、低聚果糖0.8份、红茶提取液80份，混合均匀得到发酵培养基，121℃灭菌10 min备用。
82.(3)将酿酒酵母接种至ypd培养基中，培养转接3代，每代培养12 h，得到所述酵母菌种子液。将酵母菌种子液接种至发酵培养基中进行一次发酵，酵母菌种子液接种量为3%，30℃条件下摇床培养45 h，摇床速度为160 r/min，微氧通气量0.2 vvm。
83.(4)将副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳球菌分别接种至mrs培养基中，培养转接3代，每代培养10 h，得到三种乳酸菌种子液。将木醋杆菌接种至mrs培养基中，培养转接2代，每代培养10 h，得到所述醋酸菌种子液。将副干酪乳杆菌种子液1%、植物乳杆菌种子液1%、乳球菌种子液2%和醋酸菌种子液2%接种至发酵培养基中进行二次发酵，32℃条件下摇床培养45 h，摇床速度为75 r/min。
84.(5)发酵培养结束后使用12 μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液85℃灭菌30 min，得到所述红茶发酵滤液。
85.实施例4本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于，将步骤(3)中的酿酒酵母替换为接种量相同的酒香酵母，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
86.实施例5本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，将步骤(4)中的木醋杆菌替换为接种量相同的巴氏醋杆菌，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
87.实施例6本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，将步骤(4)中的副干酪乳杆菌替换为接种量相同的德氏乳杆菌，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
88.实施例7本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，将步骤(4)中副干酪乳杆菌种子液接种量改变为0.4%，植物乳杆菌种子液接种量改变为0.3%，乳球菌种子液接种量改变为0.3%，醋酸菌种子液接种量改变为4%，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
89.实施例8本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，将步骤(3)中培养时间改变为75 h，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
90.实施例9本实施例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，将步骤(4)中培养时间改变为45 h，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
91.对比例1本对比例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，未进行步骤(4)操作，步骤（3）结束后直接进行步骤（5），其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
92.对比例2本对比例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，未进行步骤(3)操作，步骤（2）结束后直接进行步骤（4），其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
93.对比例3本对比例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中未进行醋酸菌种子液接种，将副干酪乳杆菌种子液的接种量改变为2.5%、植物乳杆菌种子液的接种量改变为1.25%、乳球菌种子液的接种量改变为1.25%，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
94.对比例4本对比例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中未进行副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳球菌
种子液接种，将醋酸菌种子液接种量改变为5%，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
95.对比例5本对比例提供一种红茶发酵滤液，其制备方法如下：其与实施例1的区别仅在于，将步骤(3)和步骤(4)的实验顺序对换，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
96.应用例1~9，对比应用例1~5提供14种红茶精华液，按照重量比例计所述红茶精华液的制备方法如下：实施例1~9和对比例1~5制得的红茶发酵滤液8%，对羟基苯乙酮0.4%，1,2-己二醇0.6%，卡波姆941 0.1%，三乙醇胺0.1%，edta二钠0.02%，余量为去离子水，混合均匀后得到所述红茶精华液。
97.测试例1炎症因子抑制实验实验方法：采用raw264.7巨噬细胞作为研究对象，通过脂多糖lps（细菌内毒素）刺激细胞建立细胞炎症模型。接种巨噬细胞至12孔板，在培养箱以37℃、5% co2通气量条件下孵育24 h，分别加入应用例1~9，对比应用例1~5的1%稀释液，2 h后加入lps(1 μg/ml)，并设置不添加稀释液只添加lps的组以及不添加lps只添加稀释液的组，刺激24 h，收集上清液，离心，检测。采用elisa试剂盒分析raw264.7的促炎性炎症因子tnf-α释放量水平。
98.tnf-α抑制率由如下公式计算得到：tnf-α抑制率(%)=(lps刺激组炎症因子浓度-待测物作用组炎症因子浓度)/(lps刺激组炎症因子浓度-未刺激组炎症因子浓度)
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100%。tnf-α抑制率越高，说明所述红茶精华液的抗炎效果越好。
99.tnf-α抑制测试结果如表1所示。
100.测试例2弹性蛋白酶抑制实验实验方法：采用弹性蛋白酶(猪胰)作为研究对象。设有样品组为应用例1~9，对比应用例1~5的5%稀释液和阴性对照组，每组设立3个平行，分别取10 μl的待测样品加入到96孔板，阴性对照组加10 μl稀释溶剂，再向96孔板中加入20 μl浓度为0.1 u/ml的弹性蛋白酶溶液。将96孔板置于25℃恒温培养箱中孵育15 min，然后加入50 μl浓度为1 mg/ml的底物(98%的n-琥珀酰-l-丙氨酰-l-丙氨酸)，使用酶标仪测量样品在410 nm下的吸光度，并计算待测样品对弹性蛋白酶活性抑制率。
101.弹性蛋白酶活性抑制率由如下公式计算得到：弹性蛋白酶活性抑制率(%)＝[(
△a‑△
b)/
△
a]
×
100%，
△
a表示不含待测样品的阴性对照组吸光度值，
△
b代表不同浓度待测液吸光度值。弹性蛋白酶抑制率越高，说明所述红茶精华液的抗衰老效果越好。
[0102]
弹性蛋白酶抑制测试结果如表1所示。
[0103]
测试例3dpph-自由基清除实验根据《化妆品-自由基(dpph)清除实验方法(t/shrh006-2018)》，分别检测上述应用例1~9，对比应用例1~5所制得的红茶精华液和空白对照组的dpph自由基的清除率(%)。
[0104]
实验方法：采用96孔板，每组设置三个复孔，体系为200 μl。样品组：取适量所述红茶发酵滤液样品，溶于100 μl蒸馏水中，使待测样品在体系中的终浓度为1%，并向反应体系中加入100 μl 0.1 mm的dpph溶液；对照组：取100μl蒸馏水，再加入100 μl 0.1 mm的dpph溶液。反应体系构建完成后，避光摇晃10 min，使用酶标仪测试在520 nm处的吸光度。
[0105]
清除率的计算方法：清除率(%)=[(a0-ax)/a0]
ꢀ×
100%，a0为对照组吸光度，ax为样品组吸光度。清除率越高，说明所述红茶精华液的抗皱效果越好。
[0106]
dpph自由基清除测试结果如表1所示。
[0107]
测试例4皮肤角质层水分含量测试根据《化妆品保湿功效评价指南(qb/t4256-2011)》，首先分别检测人使用本发明应用例和对比应用例所制得红茶精华液之前人的皮肤含水量(%)，记为空白值，然后将应用例1~9，对比应用例1~5所制得的红茶精华液分别涂抹到受试者的皮肤上，每个受试者涂抹上述精华液的用量均为2.0 mg/cm2，然后检测140名受试者分别使用上述精华液第4周时的皮肤含水量变化。含水量提升越高，说明所述红茶精华液的保湿效果越好。
[0108]
测试人群：测试环境温度为20℃~22℃，湿度为40%~60%，并且进行实时动态监测。受试者的年龄均为18~55岁，男女均有，受试者共140名，10名一组，每组分别使用应用例1~9，对比应用例1~5所制得的红茶精华液，使用相同的方法将所述红茶精华液涂抹于脸部，每天早晚洁面后使用，连续使用4周，受试部位测试前2天不能使用任何产品(化妆品或外用药品)。试验前，受试者需要统一清洁脸部，用干的面巾纸擦拭干净。清洁后，在受试者脸部做好测量区域标记。正式测试前，应该在符合标准的房间内静坐30 min，不能喝水，呈测试状态放置，保持放松。计算含水量增长率，结果如表1所示。
[0109]
表1
根据表1测试结果数据可知，将酵母菌、乳酸菌和醋酸菌三种菌与红茶提取液进行复合发酵得到的红茶发酵滤液对于tnf-α、弹性蛋白酶和dpph自由基具有良好的抑制效果。二次发酵过程中仅接种乳酸菌或者醋酸菌单一菌种的种子液会影响红茶发酵精华对于tnf-α、弹性蛋白酶和dpph自由基的抑制效果；对调两次发酵的顺序对于上述三种酶的抑制效果会减弱；当对红茶发酵滤液仅进行单次发酵时，对于上述三种酶的抑制率效果大幅减弱。连续使用本发明提供的红茶精华液4周时，受试者面部皮肤角质层水分含量与基础值相比有显著上升，因此，将酵母菌用于一次发酵，乳酸菌和醋酸菌用于二次发酵，三种菌协同作用复合发酵得到的红茶发酵滤液对于tnf-α、弹性蛋白酶和dpph自由基的抑制效果，从而具有更好的保湿、抗衰老、抗炎、抗氧化等护肤效果。
[0110]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。