具有抗炎、抗菌及ROS响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料及其制备方法

具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料及其制备方法
技术领域
1.本发明属于高分子材料技术领域的一种聚磷腈基水凝胶伤口敷料，具体涉及一种具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料及其制备方法。
技术背景
2.糖尿病伤口是糖尿病的一种严重和普遍的并发症，目前的治疗方案仍是非特异性的。到2035年，患有糖尿病创面的患者预计将达到9000万至1.5亿人，其中约20％的中重度糖尿病创面患者面临截肢。有大量的证据表明，在糖尿病创面中，长期的低水平炎症在创面中积累过多的活性氧(ros)，破坏创面修复的关健过程，如血管生成、ecm重构和再上皮化，从而阻止创面从炎症期向愈合的增阶段发展。此外，糖尿病创面的高血糖微环境相比其他创面更容易受到微生物感染，细菌感染往往导致ros的额外积累，造成氧合不足，不但进一步减缓糖尿病创面愈合，还会引起异常病变(神经病变、血管病变及其他复杂的全身效应)，导致愈合困难。因此，降低创面的ros水平和有效清除微生物对糖尿病创面愈合至关重要。
3.理想的糖尿病伤口敷料应具备如下特点：1)具有良好的清除ros的性能，减轻糖尿病伤口炎症，缩短炎症阶段；2)具有良好的抗感染性能；3)对人体组织相容性好，无组织伤害或感染风险；4)使用简便，方便伤者使用；5)可长期有效储存，较宽温度范围内保持性质稳定。


技术实现要素：

4.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抗炎、抗菌及ros 响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料及其制备方法，水凝胶伤口敷料为亲水水凝胶，具有良好的抗炎、抗菌活性、ros响应降解、低毒性和优良的稳定性等优点。
5.本发明通过以下技术方案实现：
6.一、一种具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料
7.采用含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba与单宁酸ta的ppba-ta纳米偶联物作为抗炎抗菌成分；ppba-ta纳米偶联物与聚乙烯醇通过形成ros响应性硼酸酯键反应得到具有ros响应降解性能的聚磷腈基水凝胶伤口敷料(ppba-ta-pva)。
8.二、一种具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料的制备方法
9.含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba具体为聚[n,n-二甲基
‑ꢀ
氨乙基-对甲基苯硼酸溴化铵)(n,n-二甲基乙二胺)]磷腈；聚磷腈的硼酸基团接枝率为15～30％。
[0010]
首先将含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba、单宁酸ta与聚乙烯醇pva分别充分溶解于去离子水中，分别获得聚磷腈ppba溶液、单宁酸 ta溶液和聚乙烯醇pva溶液；然后将聚磷腈ppba溶液加至单宁酸ta溶液中，混合搅拌获得ppba-ta纳米偶联物，最
后将ppba-ta纳米偶联物加至聚乙烯醇pva溶液中，混合搅拌得到具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料。
[0011]
以质量份数计，所述含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba为 10～30份、单宁酸ta为1～3份、聚乙烯醇pva为10～30份，三个溶液的去离子水之和为1000-2000份，三个溶液中的去离子水比例等于三者的质量份数比。
[0012]
所述混合搅拌的时间为10～30分钟。
[0013]
所述混合搅拌的转速为500～1000rpm。
[0014]
所述ppba-ta纳米偶联物的粒径为50～200nm。
[0015]
水凝胶伤口敷料含有具有良好的接触抑菌性能，将革兰氏阴性菌大肠杆菌悬液涂布在步骤3)获得的水凝胶表面37℃培养，该水凝胶对大肠杆菌的4h生长抑制率达到93.1
±
1.1％，8h生长抑制率达到99.4
±
0.6％。
[0016]
水凝胶伤口敷料能够有效清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基与
·
oh自由基。以质量份数计算，每份水凝胶在20h内能够清除100份dpph 自由基(0.1mm)与100份
·
oh自由基(1mm)。
[0017]
水凝胶伤口敷料具有ros响应功能，水凝胶伤口敷料能够在
·
oh自由基溶液(1mm)中发生降解，且降解速率与ta的偶联浓度呈正相关关系，将水凝胶伤口敷料浸没在
·
oh自由基溶液中，其96h水凝胶降解率为40％～98％。
[0018]
水凝胶伤口敷料能够降低促炎细胞因子(il-6、il-1β)。
[0019]
本发明有益效果如下：
[0020]
1.本发明提供的抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料具有良好的抗菌性能，水凝胶骨架中由聚[n,n-二甲基-氨乙基-对甲基苯硼酸溴化铵)(n,n-二甲基乙二胺)]磷腈(ppba)提供的丰富的季铵盐基团与可质子化的叔胺基团能够与菌体接触后吸附至菌体表面，穿透细胞壁，通过渗透压的变化与有机物的分解作用扰乱细胞膜的组成，促使细胞内物质(dna、 rna)泄漏，进而使菌体死亡，避免了抗生素的使用，减缓多药耐药菌的出现，并且抑菌性能长期有效。
[0021]
2.本发明提供的抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料具有良好的抗炎性能。该水凝胶偶联了具有抗炎功效的天然多酚单宁酸，单宁酸中的酚羟基能够与自由基结合形成邻苯醌结构，从而发挥自由基清除的功效。
[0022]
3.本发明提供的抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料具有良好的ros响应性能，ros能够进攻硼与苯环之间的单键，形成不稳定的过氧化物中间体，然后水解，硼酸基团脱落，从而导致硼酸基团与苯环的分离。该水凝胶能够在ros水平高时，按需释放连接的ta，从而维持伤口的ros在合理浓度。
[0023]
4.本发明提供的抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料能够通过降低促炎细胞因子(il-6、il-1β)，在大鼠糖尿病伤口模型中能够很大程度缩短炎症阶段。
附图说明
[0024]
图1为实施例1制备的水凝胶对大肠杆菌的接触抑菌率。
[0025]
图2为实施例1制备的水凝胶对dpph自由基的清除率。
[0026]
图3为实施例1制备的水凝胶对oh自由基的清除率。
[0027]
图4为实施例1制备的水凝胶在oh自由基溶液中的降解率。
[0028]
图5为实施例1制备的水凝胶对大鼠糖尿病伤口的愈合率。
[0029]
图6为实施例2制备的水凝胶对大肠杆菌的接触抑菌率。
[0030]
图7为实施例2制备的水凝胶对dpph自由基的清除率。
[0031]
图8为实施例2制备的水凝胶对oh自由基的清除率。
[0032]
图9为实施例2制备的水凝胶在oh自由基溶液中的降解率。
[0033]
图10为实施例2制备的水凝胶对大鼠糖尿病伤口的愈合率。
[0034]
图11为实施例3制备的水凝胶对大肠杆菌的接触抑菌率。
[0035]
图12为实施例3制备的水凝胶对dpph自由基的清除率。
[0036]
图13为实施例3制备的水凝胶对oh自由基的清除率。
[0037]
图14为实施例3制备的水凝胶在oh自由基溶液中的降解率。
[0038]
图15为实施例3制备的水凝胶对大鼠糖尿病伤口的愈合率。
具体实施方式
[0039]
下面结合具体实施例对本发明做更详尽的说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0040]
本发明的实施例如下：
[0041]
含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba具体为聚[n,n-二甲基
‑ꢀ
氨乙基-对甲基苯硼酸溴化铵)(n,n-二甲基乙二胺)]磷腈。
[0042]
实施例1
[0043]
将聚磷腈(ppba)30mg、单宁酸(ta)1mg与聚乙烯醇(pva)30mg，分别溶于900μl、100μl、1000μl去离子水中，待完全溶解。
[0044]
首先将含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba、单宁酸ta与聚乙烯醇pva分别充分溶解于去离子水中，分别获得聚磷腈ppba溶液、单宁酸 ta溶液和聚乙烯醇pva溶液；然后将聚磷腈ppba溶液加至单宁酸ta溶液中，混合搅拌获得ppba-ta纳米偶联物，ppba-ta纳米偶联物的粒径为50～200nm。最后将ppba-ta纳米偶联物加至聚乙烯醇pva溶液中，混合搅拌得到具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料。其中，混合搅拌的时间为10分钟，转速为1000rpm。
[0045]
将处于对数生长期，10μl浓度为106cfu的大肠杆菌atcc 25922细菌悬液分散在水凝胶表面，并在37℃恒温培养箱中培养1h、2h、4h和8h。共培养后，将1ml pbs溶液添加到水凝胶表面，并进行30分钟的超声波处理。取100μl 溶液涂布lb固体培养基，并在37℃恒温培养箱中过夜培养，并对培养基上的但菌落数进行计数。
[0046]
将0.4ml本发明所提供的水凝胶与30ml dpph自由基溶液(0.1mm)在37℃下避光共孵育，通过517nm紫外吸收强度测定ppba-ta-pva水凝胶在不同时间对dpph自由基的清除能力。将0.4ml本发明所提供的水凝胶与25ml
·
oh 自由基溶液(1mm)在37℃下避光共孵育，不同时间取一定量的溶液与等体积的tmb(10mm,dmso)混合10min。以904nm紫外吸收强度测定 ppba-ta-pva水凝胶在不同时间对羟基自由基的清除能力。
[0047]
将1ml本发明所提供的水凝胶与50ml
·
oh自由基溶液(1mm)在37℃下避光共孵育,不同时间观察水凝胶的消耗情况测定水凝胶伤口敷料的ros响应降解能力。
[0048]
以链霉素诱导的大鼠糖尿病伤口模型为对象，将本发明提供的水凝胶填充于伤口处，定期更换敷料，观察伤口的愈合情况来测定水凝胶伤口敷料促进糖尿病伤口愈合的性能。
[0049]
在糖尿病伤口的愈合过程中，分别在第10天取伤口周围组织，并对其与炎症因子il-6和il-1β相关的基因进行荧光定量pcr，测定水凝胶伤口敷料在降低伤口炎症水平方面的性能。
[0050]
本实施例结果如图1～图5所示，图1为所得水凝胶对大肠杆菌的接触抑菌性能，由图可见，凝胶材料具有优异的接触抑菌性能。其1h的细菌抑菌率能够达到46.7
±
5.2％，8h抑菌率能够达到98.3
±
1.1％，能够基本灭杀细菌。图2与图3为所得水凝胶对dpph自由基与
·
oh自由基的清除性能，由图可见，凝胶材料具有良好的ros清除的性能。其在70h内能够清除94.7
±
1.9％的dpph自由基，在8h内能够清除93.6
±
0.3％的
·
oh自由基。图4为所的水凝胶的ros 响应降解性能，由图可见，凝胶材料在
·
oh自由基溶液中96h，约有27.8
±
2.0％的水凝胶降解。图5为凝胶材料处理的糖尿病伤口的愈合情况，由图可见，在伤口愈合第6天水凝胶组伤口愈合率为65.0
±
3.2％，相比于空白对照组的愈合率(44.0
±
4.4％)，本发明更能够促进糖尿病伤口的愈合。在糖尿病伤口的愈合过程中，第10天本发明组的炎症因子il-6和il-1β的表达量分别是空白对照组的0.53倍与0.59倍。
[0051]
实施例2
[0052]
将聚磷腈(ppba)30mg、单宁酸(ta)2mg与聚乙烯醇(pva)30mg，分别溶于800μl、200μl、1000μl去离子水中，待完全溶解。
[0053]
首先将含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba、单宁酸ta与聚乙烯醇pva分别充分溶解于去离子水中，分别获得聚磷腈ppba溶液、单宁酸 ta溶液和聚乙烯醇pva溶液；然后将聚磷腈ppba溶液加至单宁酸ta溶液中，混合搅拌获得ppba-ta纳米偶联物，ppba-ta纳米偶联物的粒径为50～200nm。最后将ppba-ta纳米偶联物加至聚乙烯醇pva溶液中，混合搅拌得到具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料。其中，混合搅拌的时间为30分钟，转速为500rpm。
[0054]
将处于对数生长期，10μl浓度为106cfu的大肠杆菌atcc 25922细菌悬液分散在水凝胶表面，并在37℃恒温培养箱中培养1h、2h、4h和8h。共培养后，将1ml pbs溶液添加到水凝胶表面，并进行30分钟的超声波处理。取100 μl溶液涂布lb固体培养基，并在37℃恒温培养箱中过夜培养，并对培养基上的但菌落数进行计数。
[0055]
将0.4ml本发明所提供的水凝胶与30ml dpph自由基溶液(0.1mm)在37℃下避光共孵育，通过517nm紫外吸收强度测定ppba-ta-pva水凝胶在不同时间对dpph自由基的清除能力。将0.4ml本发明所提供的水凝胶与25ml
·
oh 自由基溶液(1mm)在37℃下避光共孵育,不同时间取一定量的溶液与等体积的 tmb(10mm,dmso)混合10min。以904nm紫外吸收强度测定ppba-ta-pva 水凝胶在不同时间对羟基自由基的清除能力。
[0056]
将1ml本发明所提供的水凝胶与50ml
·
oh自由基溶液(1mm)在37℃下避光共孵育,不同时间观察水凝胶的消耗情况测定水凝胶伤口敷料的ros响应降解能力。
[0057]
以链霉素诱导的大鼠糖尿病伤口模型为对象，将本发明提供的水凝胶填充于伤口处，定期更换敷料，观察伤口的愈合情况来测定水凝胶伤口敷料促进糖尿病伤口愈合的性能。
[0058]
在糖尿病伤口的愈合过程中，分别在第10天取伤口周围组织，并对其与炎症因子il-6和il-1β相关的基因进行荧光定量pcr，测定水凝胶伤口敷料在降低伤口炎症水平方面的性能。
[0059]
本实施例结果如图6～图10所示，图6为所得水凝胶对大肠杆菌的接触抑菌性能，由图可见，凝胶材料具有优异的接触抑菌性能。其1h的细菌抑菌率能够达到32.2
±
4.0％，8h抑菌率能够达到89.5
±
1.2％，能够基本灭杀细菌。图7 与图8为所得水凝胶对dpph自由基与
·
oh自由基的清除性能，由图可见，凝胶材料具有良好的ros清除的性能。其在70h内能够清除99.6
±
1.4％的dpph 自由基，在8h内能够清除97.4
±
0.1％的
·
oh自由基。图9为所的水凝胶的ros 响应降解性能，由图可见，凝胶材料在
·
oh自由基溶液中96h，约有60.5
±
2.6％的水凝胶降解。图10为凝胶材料处理的糖尿病伤口的愈合情况，由图可见，在伤口愈合第6天水凝胶组伤口愈合率为83.1
±
2.6％，相比于空白对照组的愈合率(44.0
±
4.4％)，本发明更能够促进糖尿病伤口的愈合。在糖尿病伤口的愈合过程中，第10天本发明组的炎症因子il-6和il-1β的表达量分别是空白对照组的0.53倍与0.50倍。
[0060]
实施例3
[0061]
将聚磷腈(ppba)30mg、单宁酸(ta)3mg与聚乙烯醇(pva)30mg，分别溶于700μl、300μl、1000μl去离子水中，待完全溶解。
[0062]
首先将含有苯硼酸基团与季铵盐基团功能化聚磷腈ppba、单宁酸ta与聚乙烯醇pva分别充分溶解于去离子水中，分别获得聚磷腈ppba溶液、单宁酸 ta溶液和聚乙烯醇pva溶液；然后将聚磷腈ppba溶液加至单宁酸ta溶液中，混合搅拌获得ppba-ta纳米偶联物，ppba-ta纳米偶联物的粒径为50～200nm。最后将ppba-ta纳米偶联物加至聚乙烯醇pva溶液中，混合搅拌得到具有抗炎、抗菌及ros响应性能的单宁酸偶联的聚磷腈基水凝胶伤口敷料。其中，混合搅拌的时间为30分钟，转速为1000rpm。
[0063]
将处于对数生长期，10μl浓度为106cfu的大肠杆菌atcc 25922细菌悬液分散在水凝胶表面，并在37℃恒温培养箱中培养1h、2h、4h和8h。共培养后，将1ml pbs溶液添加到水凝胶表面，并进行30分钟的超声波处理。取 100μl溶液涂布lb固体培养基，并在37℃恒温培养箱中过夜培养，并对培养基上的但菌落数进行计数。
[0064]
将0.4ml本发明所提供的水凝胶与30ml dpph自由基溶液(0.1mm)在37℃下避光共孵育，通过517nm紫外吸收强度测定ppba-ta-pva水凝胶在不同时间对dpph自由基的清除能力。将0.4ml本发明所提供的水凝胶与25ml
·
oh 自由基溶液(1mm)在37℃下避光共孵育,不同时间取一定量的溶液与等体积的tmb(10mm,dmso)混合10min。以904nm紫外吸收强度测定ppba-ta-pva 水凝胶在不同时间对羟基自由基的清除能力。
[0065]
将1ml本发明所提供的水凝胶与50ml
·
oh自由基溶液(1mm)在37℃下避光共孵育,不同时间观察水凝胶的消耗情况测定水凝胶伤口敷料的ros响应降解能力。
[0066]
以链霉素诱导的大鼠糖尿病伤口模型为对象，将本发明提供的水凝胶填充于伤口处，定期更换敷料，观察伤口的愈合情况来测定水凝胶伤口敷料促进糖尿病伤口愈合的性能。
[0067]
在糖尿病伤口的愈合过程中，分别在第3、6、10天取伤口周围组织，并对其与炎症因子il-6和il-1β相关的基因进行荧光定量pcr，测定水凝胶伤口敷料在降低伤口炎症水平方面的性能。
[0068]
本实施例结果如图11～图15所示，图11为所得水凝胶对大肠杆菌的接触抑菌性能，由图可见，凝胶材料具有优异的接触抑菌性能。其1h的细菌抑菌率能够达到73.1
±
4.6％，8h抑菌率能够达到99.4
±
0.6％，能够基本灭杀细菌。图 12与图13为所得水凝胶对dpph自由基与
·
oh自由基的清除性能，由图可见，凝胶材料具有良好的ros清除的性能。其在70h内能够清除98.4
±
2.1％的dpph 自由基，在8h内能够清除81.1
±
4.9％的
·
oh自由基。图14为所述水凝胶的ros 响应降解性能，由图可见，凝胶材料在
·
oh自由基溶液中96h，约有60.5
±
2.6％的水凝胶降解。图15为凝胶材料处理的糖尿病伤口的愈合情况，由图可见，在伤口愈合第6天水凝胶组伤口愈合率为93.1
±
2.6％，相比于空白对照组的愈合率(44.0
±
4.4％)，本发明更能够促进糖尿病伤口的愈合。在糖尿病伤口的愈合过程中，在第10天取伤口周围组织炎症因子il-6和il-1β的表达量，由图可见本发明组的炎症因子明显少于空白对照组的0.40倍与0.76倍。