鱼腥草素钠在制备防治应激性心肌病药物中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及鱼腥草素钠在制备防治应激性心肌病药物中的应用。


背景技术：

2.应激诱导的“takotsubo”心肌病是最近描述的一种类似急性心肌梗死的心血管综合征，其特征是无冠状动脉疾病患者的可逆性左室功能障碍伴心尖部气球样变,影响心脏向身体其他部位输送血液的能力，并经常导致心力衰竭。通常与情绪或身体应激事件有关。长时间的应激会导致心脏重塑，包括心脏肥大、炎症和纤维化，最终导致左心室功能障碍，甚至死亡。纤维化(疤痕)是对心脏损伤的异常伤口愈合反应，其特征是细胞外基质成分过度累积，主要由胶原蛋白组成。由于临床前和临床研究的证据表明心脏纤维化是可逆的，心脏纤维化是心力衰竭创新治疗的潜在目标，但目前可用的治疗方法难以控制心肌纤维化。
3.鱼腥草是一种在亚洲国家发现的传统草药，也是一种蔬菜，具有抗氧化应激和抗炎的作用。鱼腥草素是鱼腥草的提取物，其在许多疾病的动物和细胞模型中表现出显著的药用价值，例如脂多糖(lps)诱导的急性肺损伤(ali)，吸烟诱导的慢性阻塞性肺疾病(copd)，lps诱导的牛子宫内膜上皮细胞炎症，腹主动脉环扎术诱导的心室肥厚，和心肌梗死等。有研究表明，鱼腥草素钠在静脉注射后迅速分布到不同组织，肺组织中浓度最高，心脏组织中的浓度次之，表明心脏也是它的主要靶器官之一。然而，它是否可以抗纤维化保护应激性心肌病的作用尚不清楚。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供鱼腥草素钠在制备防治应激性心肌病的药物中的应用。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：鱼腥草素钠在制备防治应激性心肌病药物中的应用。
6.本发明同时提供鱼腥草素钠在制备防治心肌纤维化药物中的应用。
7.上述技术方案中，所述药物抑制异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞增殖，抑制转化生长因子β诱导的心脏成纤维细胞col1a、a-sma、mmp2和timp2的表达。
8.上述技术方案中，所述药物包括有效剂量的鱼腥草素钠和药学上可接受的载体。
9.上述技术方案中，所述鱼腥草素钠的用量为100mg/kg
·
天。
10.上述技术方案中，所述药物的剂型为胶囊、脂质体、颗粒剂、注射液、片剂或口服液。
11.本发明采用c57bl/6小鼠进行实验，在异丙肾上腺素诱导的小鼠模型中，用鱼腥草素钠治疗观察对心脏功能及心脏纤维化的改善作用，并测定其对心脏成纤维细胞的增殖能力的影响，确定了鱼腥草素钠抑制成纤维细胞增殖，抗心脏纤维化，改善心脏功能，治疗应激性心肌病。
12.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
13.1.鱼腥草素钠对应激性心肌病有防治作用，有心脏保护效果；可降低应激性心肌病导致的心功能减退。
14.2.鱼腥草素钠可抑制心肌纤维化，抑制心脏成纤维细胞增殖，抑制纤维化标志蛋白的表达。
15.3.鱼腥草素钠来源广泛，在防治应激性心肌病引起的心脏功能减退、心肌纤维化等的产品方面具有良好的临床应用前景。
附图说明
16.图1是鱼腥草素钠改善应激性心肌病心功能。
17.图2是鱼腥草素钠改善应激性心肌病心脏形态学结构。
18.图3是鱼腥草素钠对成纤维细胞的细胞毒性实验结果，iso:异丙肾上腺素；sh:鱼腥草素钠。
19.图4是鱼腥草素钠抑制异丙肾上腺素诱导的成纤维细胞的细胞增殖的实验结果，iso:异丙肾上腺素；sh:鱼腥草素钠。
20.图5是是鱼腥草素钠抑制异丙肾上腺素和转化生长因子β诱导的心脏成纤维细胞纤维化标志蛋白的表达结果，iso:异丙肾上腺素；sh:鱼腥草素钠；tgf-β:转化生长因子β。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
22.1.材料
23.1.1动物
24.9～10周龄c57bl/6小鼠，由徐州医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：scxk(苏)2020-0011，实验动物使用许可证syxk(苏)2020-0048。
25.1.2主要仪器
26.心动超声仪(vevo2100，visualsonics,usa)，荧光显微镜(olympus b5167日本)，thermo酶标仪。
27.1.3药品与试剂
28.鱼腥草酸钠(中国成都purify技术开发有限公司，cas号83766-73-8，纯度98％)，异丙肾上腺素(sigma aldrich)，cck8(亚科因生物科技有限公司，中国武汉)。he染料和masson染料(赛维尔生物科技有限公司，中国武汉)。
29.2.方法
30.2.1应激性心肌病小鼠模型和处理
31.异丙肾上腺素在使用前溶解在0.9％的盐水中。小鼠每天皮下注射异丙肾上腺素(15mg/kg/天)或0.9％生理盐水，持续2周，以诱导心衰。在早期治疗组和晚期治疗组中，在特定时间段每天给小鼠注射鱼腥草素钠(100mg/kg/天)。将动物随机分为四组(每组5-10只)：(1)对照ns(生理盐水)组，小鼠注射生理盐水5周；(2)鱼腥草素钠对照组：对照组小鼠注射鱼腥草素钠5周；(3)应激性心肌病：给予异丙肾上腺素2周，然后注射生理盐水3周；(4)治疗组：小鼠于同一天注射异丙肾上腺素和鱼腥草素钠，异丙肾上腺素注射持续2周，鱼腥草素钠注射持续5周。异丙肾上腺素给药5周后进行超声心动图检查和称量心脏重量，肺组
织重量，体重，心脏组织做he染色和masson染色。
32.2.2超声心动图
33.小鼠处理5周后，通过经胸超声心动图对小鼠进行心功能评估。在此过程中，用1％-2％的异氟醚轻度镇静小鼠，并将其置于仰卧位，放置在带有vevo2100心血管研究超声设备的加热平台上(美国视觉电子公司)。使用m型长轴视图在乳头肌水平评估左室舒张末期容积(lvedv)和左室收缩末期容积(lvesv)，并使用simpson方法计算左室射血分数(lvef)和左室缩短分数(lvfs)。此过程采用双盲实验。
34.2.3苏木精-伊红(he)染色和masson染色
35.超声心动图测定小鼠体重。然后处死小鼠。分别解剖小鼠心脏和肺并称重。收集心脏进行心脏重构的分子研究。将每个心脏横向分为2个部分：一个部分(上部)在4％福尔马林中固定24小时，包埋在石蜡中，切成5块微米厚切片用于组织学评估。进行he和masson染色。另一部分(下部)立即冷冻在-80℃冷冻柜中进行蛋白质分析。为了实现一致性和便于组间比较，将每只动物的相同部分用于类似实验的分析。每个切片在荧光显微镜下成像。
36.2.4免疫组织化学染色
37.心脏组织石蜡切片，脱蜡后，用pbs冲洗三次，用柠檬酸钠液进行抗原修复，然后用0.3％triton-x 100处理15分钟。用5％牛血清白蛋白封闭1小时，然后在4℃下与抗α-sma(1:200)，col1a(1:200)孵育过夜。在用pbs洗5分钟
×
3次后，与二级抗体(1:100)在室温下孵育1小时。用pbs洗三次，然后用dapi进行细胞核染色，再用pbs冲洗一次后，封片。在荧光显微镜下观察。
38.2.5细胞增殖分析
39.将每孔2.0
×
103个细胞接种到96孔培养板中培养24小时，然后用异丙肾上腺素和鱼腥草素钠处理24小时或48小时。根据制造商的说明，使用cck-8(abbkine，中国)评估细胞增殖能力。
40.2.6western blot蛋白印迹分析
41.用含有pfsm和磷酸酶抑制剂的ripa裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白。将提取物在4℃和12000rpm下旋转15分钟，收集上清液并保持在80℃。使用bsa定量蛋白质浓度。使用10％十二烷基硫酸钠(sds)聚丙烯酰胺凝胶(加载缓冲液、ripa裂解液、sds-page凝胶制备试剂盒，购自江苏碧云天生物技术研究所)对30微克/孔蛋白质进行电泳。电泳后，将凝胶直接转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜(0.45um，微孔)上。用bsa(3％)封闭膜2小时。然后在4
°
c下与一级抗体孵育过夜：抗col1a抗体(1:1000)、抗a-sma抗体(1:1000)、抗mmp2抗体(1:1000)、抗timp2抗体(1:1000)和抗gapdh(1:5000)。在使用tbst洗涤三次(5min/次)后，使用第二抗体孵2小时。使用tanon-4800多功能成像系统(tanon，中国)，通过ecl底物对印迹进行可视化。
42.3.结果
43.3.1鱼腥草素钠减轻异丙肾上腺素诱导的小鼠心脏功能障碍
44.间断皮下注射异丙肾上腺素可诱导小鼠心脏功能障碍。将动物随机分为四组：对照ns组、对照鱼腥草素钠组、异丙肾上腺素诱导心肌病组、治疗组。与ns组相比，接受鱼腥草素钠注射五周的小鼠(对照鱼腥草素钠组)的心功能没有变化。与两个对照组相比，异丙肾上腺素处理小鼠的心功能受损，其特征是lvef％(左室射血分数)和lvfs％(左室射血缩短)
显著降低，lvedv(左室舒张末期容积)和lvesv(左室收缩容积)增加(图1a-图1e)，异丙肾上腺素给药后，心脏重量/体重比(hw/bw)和肺重量/体重比(lw/bw)显著增加(图1f，图1g)。
45.在治疗性模型中，与异丙肾上腺素-心肌病组相比，鱼腥草素钠显著改善了小鼠的hw/bw比、lw/bw比和心功能。
46.3.2鱼腥草素钠减轻异丙肾上腺素诱导的小鼠心脏纤维化
47.心脏组织的h&e染色显示异丙肾上腺素注射导致心肌细胞肥大。小鼠心脏切片的masson染色显示异丙肾上腺素处理导致心脏纤维化显著增加。在治疗模型中，鱼腥草素钠治疗显著减少了心肌细胞肥大和心肌纤维化(图2a，图2b)。免疫荧光分析显示，异丙肾上腺素给药增加了纤维化标记物的表达水平，包括col1a，而鱼腥草素钠给药显著降低了治疗模型中心脏纤维化标记物的表达。在治疗模型中，给予鱼腥草素钠略微减轻了心脏纤维化。这些结果表明，鱼腥草素钠抑制异丙肾上腺素诱导纤维化，可以有效防止心脏重构并改善心功能(图2c)。
48.3.3鱼腥草素钠抑制异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞增殖
49.心脏成纤维细胞在心力衰竭的心脏纤维化中起着至关重要的作用。为了更好地理解鱼腥草素钠治疗的机制，异丙肾上腺素触发心脏成纤维细胞的增殖，模拟应激性心肌病动物模型中的心肌纤维化。如图3a所示，基于cck-8分析，当细胞用0-50微摩尔异丙肾上腺素处理24或48小时，其以剂量依赖性方式增加心脏成纤维细胞的细胞存活率(*p《0.05,图3a)。用100微摩尔异丙肾上腺素处理时，增加的细胞活力开始下降。用200微摩尔异丙肾上腺素处理48小时后，细胞存活率降至正常(p》0.05，图3a)。这一结果表明，长时间过量浓度的异丙肾上腺素对成纤维细胞的影响将导致细胞活力下降，细胞的死亡。同时为了评估鱼腥草素钠的细胞毒性，用不同的鱼腥草素钠浓度(0-200微摩尔)处理心脏成纤维细胞)在24和48小时内，细胞活力没有显著变化(p》0.05，图3b)。
50.接下来，10微摩尔异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞用鱼腥草素钠(0、10、20、50和100微摩尔)处理48小时。浓度为50微摩尔和100微摩尔鱼腥草素钠处理以剂量依赖性方式抑制心脏成纤维细胞增殖(p《0.05，图4a)。
51.最后，为了评价100微摩尔的鱼腥草素钠对不同浓度异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞的增殖是否都有显著的抑制作用。用100微摩尔鱼腥草素钠处理不同浓度异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞(10-100微摩尔)48小时后，所有处理组与正常组之间的细胞存活率无显著差异(p》0.05，图4b)，说明100微摩尔鱼腥草素钠对不同程度的心脏成纤维细胞的增殖都有明显抑制作用。
52.3.4鱼腥草素钠抑制异丙肾上腺素和转化生长因子β诱导的心脏成纤维细胞纤维化标志蛋白的表达
53.为了进一步确定鱼腥草素钠抑制异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞的纤维化。还通过蛋白质分析检测了相关的纤维化标志蛋白：i型胶原蛋白(col1a)、α平滑肌肌动蛋白(a-sma)、金属基质蛋白酶2(mmp2)和金属蛋白酶组织抑制剂2(timp2)，这些蛋白代表了成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，也代表了细胞外基质的水平，可以反映出纤维化的程度。100微摩尔鱼腥草素钠降低了异丙肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞col1a、a-sma、mmp2和timp2的表达(*p《0.05、**p《1.01、***p《2.001、***p《0.0001，图5a-e)。众所周知，转化生长因子β(tgf-β)在多种心脏疾病导致的心肌纤维化中均起到重要作用。因此，发明人同时检
测了鱼腥草素钠是否可以抑制转化生长因子β诱导的心脏成纤维细胞的纤维化。研究发现100微摩尔鱼腥草素钠显著抑制了转化生长因子β诱导的心脏成纤维细胞col1a、a-sma、mmp2和timp2的表达(*p《0.05、**p《1.01、***p《2.001、***p《0.0001，图5a-e)。这说明鱼腥草素钠可以明显抑制病理条件下成纤维细胞的激活和分泌，抑制细胞外基质重构，从而抑制纤维化。
54.综上所述，本发明经实验证实：(1)鱼腥草素钠对应激性心肌病有防治作用，有心脏保护效果；(2)可降低应激性心肌病导致的心功能减退。(3)可抑制心肌纤维化，抑制成纤维细胞增殖，抑制纤维化标志蛋白的表达。在用于防治应激性心肌病引起的心脏功能减退、心肌纤维化等产品方面具有良好的临床应用前景。
55.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。