甘露醇在制备抗肺鳞癌细胞nci-h226药物中的应用
技术领域：
：1.本发明属于癌症治疗研究
技术领域：
：，尤其涉及甘露醇在制备抗肺鳞癌细胞nci-h226药物中的应用。
背景技术：
：：2.中国专利“甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用”(专利号201110096567x，公开日2011年10月26日)公开了使用特定浓度(10％～19％)的甘露醇注射液治疗肺癌(肺腺癌)、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌等。该专利通过科学实验发现甘露醇具有抗肿瘤活性，通过采用多项细胞凋亡检测技术及检测凋亡相关基因bcl-2，证实特定浓度甘露醇可诱导人多种癌细胞株明显癌细胞凋亡，并掌握了与浓度、时间的效应关系，初步阐明其可能机理，而且，发明人已将研究结果用于肿瘤病人治疗并取得明显的疗效，这些为甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用及其临床推广提供了理论依据和实际病例。3.上述专利中主要报道了甘露醇对腺癌(如肺腺癌)的治疗作用，和对腺癌细胞(如spc-a-1人肺腺癌细胞、h1299细胞株)凋亡的促进作用。虽然肺腺癌和肺鳞癌分别属于非小细胞肺癌最常见两个病理类型，但肺腺癌和肺鳞癌间在病因、诱因、发病人群方面都截然不同。新诊断的肺癌患者中约85％为非小细胞肺癌(nsclc)，其中鳞癌占30％，未来nsclc的研究热点将集中在鉴定不同肺鳞癌亚型的分子改变及研发相应靶点的靶向治疗药物。4.目前肿瘤疾病的治疗研究越来越趋于“精准”，因为同为肿瘤而不同类型肿瘤致病机理不完全相同，即使同一类型肿瘤不同肿瘤细胞(基因不同)其致病机理也不完全相同。已有肺鳞癌按分子生物学分类的趋势，“肺鳞癌的分子病理学研究进展”中，学者已经提出研究已发现多个具有潜在临床指导意义的抗肿瘤靶点并即将制成鳞癌基因图谱，有望为鳞癌的基因分型提供依据；“肺鳞癌免疫基因组学分型及预测模型构建”一文提及通过基因组学分析建立肺鳞癌免疫分型。国外已有报道：肺鳞癌中的突变基因与肺腺癌也是显著不同的，较常见的突变基因包括p53、grm8、bai3、erbb4、runx1t1、keap1、fbxw7和k.ras等基因。由美国国立卫生研究院和国家人类基因组资助的癌症基因组图谱计划将完成包括肺鳞癌在内的20多种不同类型恶性肿瘤的体细胞基因组分析，结果将在不久后公布。5.可见，针对不同类型肺癌特别是肺鳞癌(或肺鳞癌细胞)，需要深入开展针对性研究，探讨不同肺鳞癌细胞在细胞凋亡机理上的差异，为各型肺鳞癌临床治疗提供可靠的科学依据。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是提供甘露醇在制备抗肺鳞癌细胞nci-h226药物中的应用。7.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：8.甘露醇在制备抗肺鳞癌药物中的应用。9.甘露醇在制备抗肺鳞癌细胞nci-h226药物中的应用。10.药物为促进癌细胞凋亡的药物。11.药物同时调节癌细胞中bcl-2、bax的表达。12.药物降低癌细胞中bcl-2的表达、升高bax的表达。13.药物为甘露醇注射液。14.甘露醇注射液的质量浓度为5％～30％。15.甘露醇注射液的质量浓度为20％。16.发明人在前期研究的基础上，对甘露醇抗肿瘤进一步研究，发现肺鳞癌组治疗后的胸水里癌细胞再检出率低于肺腺癌组。据此，发明人开启了更深的研究，试验表明，在特定浓度的甘露醇溶液下，三种肺鳞癌细胞都有明显的凋亡发生，其最佳有效浓度在5％～30％，发生凋亡的曲线非常陡峭，没有平台现象；而且，该现象明显与甘露醇对癌细胞bcl-2、bax表达的影响有关，经甘露醇处理后，肺鳞癌细胞的中bcl-2明显降低而bax却显著升高。结合此次和前期研究结果，可知甘露醇虽然对多型癌细胞均具有促凋亡作用，但是肺鳞癌细胞对此似乎更敏感。然而，同为肺鳞癌细胞的不同细胞株对与甘露醇的反应(bcl-2、bax的表达)也不完全相同，这也从基因水平侧面说明，即使是同一癌症，但甘露醇对不同分型或肺鳞癌细胞凋亡作用及其机制也不相同。因此，本发明为各型肺鳞癌临床治疗提供可靠的科学依据，为下一步研制抗肺鳞癌细胞药物进行了技术储备。附图说明17.图1是不同浓度甘露醇对nci-h292细胞活力的影响结果图。18.图2是甘露醇对nci-h292细胞凋亡率的影响结果图，图中：a24h及48h流式细胞术检测细胞凋亡结果，b24h及48h流式凋亡率对比。19.图3是nci-h292细胞中bcl-2和bax的表达结果图，图中：a24hwesternblot凝胶电泳结果，b24hbcl-2表达对比，c24hbax表达对比，d48hwesternblot凝胶电泳结果，e48hbcl-2表达对比，f48hbax表达对比。具体实施方式20.在前述中国专利“甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用”之后，发明人对甘露醇抗肿瘤进一步研究，使用药用20％甘露醇治疗癌性胸水时，有一组晚期肺癌的癌性胸水在经过甘露醇治疗后，胸水癌细胞再检出结果如表1。21.表1肺腺癌与肺鳞癌经甘露醇治疗后胸水癌细胞再检出对照表[0022][0023]如表1所示，经甘露醇治疗后，肺腺癌组(7例)和肺鳞癌组(13例)的胸水都得到了很好的控制。令人意外的是，肺鳞癌组治疗后的胸水里癌细胞再检出率却低于肺腺癌组。[0024]为此，发明人就甘露醇对肺鳞癌细胞的影响开始了更深入的研究，具体如下：[0025]1.实验目的[0026]利用cck-8、westernblot和流式细胞术实验探究甘露醇在特定浓度和孵育时间下对人肺鳞癌细胞nci-h292，人肺鳞癌细胞nci-h226、人肺鳞癌细胞nci-h2170的凋亡的影响。[0027]2.实验材料[0028]2.1实验药物[0029]20％甘露醇注射液(h13023037)(sjzno.4pharmaceutical,shijiazhuang,china)。[0030]2.2实验试剂[0031]胎牛血清(fbs)(sh30070.03)(hyclone,logan,ut,usa)；青霉素-链霉素(15140148)(thermofisherscientific,pittsburgh,pa,usa)；胰蛋白酶(15090046)(gibco,grandisland,ny,usa)；rpmi-1640培养基(11875119)(thermofisherscientific,pittsburgh,pa,usa)；pvdf膜(0.45μm)(ipvh00010)(millipore,schwalbach,germany)；starsignalwesternproteinmarker(10-200kda)(m227-01)(genstar,beijing,china)；丽春红(mfcd00003892)、吐温20(mfcd00165986)、丙烯酰胺(97064-566)、十二烷基硫酸钠(mfcd00036175)、pmsf(mfcd00007424)(amresco,solon,oh,usa)；蛋白印迹膜再生液(zn1923,biolab,beijing,china)；蛋白裂解液(ripa)(p0013c)、1.5mol/ltrishcl(ph6.8)、1.5mol/ltrishcl(ph8.8)(beyotime,shanghai,china)；ecl发光液(a38555)(thermofisherscientific,pittsburgh,pa,usa)；annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(kga108)(keygenbiotech,nanjing,china)；cck-8试剂盒(c0037)(beyotime,shanghai,china)；anti-bcl-2antibody(15071)、anti-baxantibody(89477)购自cst公司(cellsignalingtechnology,boston,usa)；anti-gapdhantibody(ab8245)、rabbitanti-mouseiggh&l(hrp)(ab6728)购自abcam公司(abcam,cambridge,uk)。[0032]2.3实验仪器[0033]forma700型超低温冰箱，thermo公司；yc-300l型药品储存柜，中科美菱低温科技有限责任公司；direct-qwithpump型超纯水仪，millipore公司；sw-cj-2fd型超净化工作台，苏州净化设备有限公司；3k15型低温高速离心机，sigma公司；bs224型电子天平，北京塞多利斯仪器系统有限公司；forma3111型水套式co2培养箱：thermoelectroncompany；yxq-ls-50sⅱ型立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业医疗设备厂；bertholdlb941微孔板式多功能酶标仪，berthold公司；westernblotting系统(型号：criteriontm电泳槽，转印槽)，tanon6600发光成像工作站，tanon公司；beckmandxflex流式细胞仪，beckman公司。[0034]2.4实验细胞株[0035]人肺鳞癌细胞nci-h292购自americantissueculturecollection(atcc,rockville,md,usa)。人肺鳞癌细胞nci-h226购自上海研域生物科技有限公司、人肺鳞癌细胞nci-h2170购自酶联(上海)生物试剂科技有限公司。[0036]3.实验方法(以人肺鳞癌细胞nci-h292为例)[0037]3.1细胞的培养条件[0038]nci-h292细胞传代培养，培养条件为含有青霉素(终浓度为100u/ml)、链霉素(终浓度为100μg/ml)以及10％fbs的rpmi-1640培养基，当细胞融合至90％时，弃去旧培养基，用2mlpbs洗涤细胞2次，弃去pbs后加入2ml0.25％胰蛋白酶-0.02％edta混合消化液，置显微镜下观察，约30s，当细胞变圆后迅速加入2ml完全培养基终止消化，轻轻吹打，收集细胞。800rpm，4℃，离心5min，弃去上清，用完全培养基重悬细胞，分瓶培养，隔天换液。[0039]3.2实验分组[0040]分组方式一[0041]化合物：甘露醇[0042]化合物浓度：0％、5％、10％、12％、15％、18％、20％[0043]孵育时间：1、2、3、4、5、6、7day[0044]cck-8实验检测各组细胞分别孵育1、2、3、4、5、6、7天后的细胞活力，并绘制增殖曲线。结果如图1所示，三个单独实验的结果均为平均值±标准差，与0％甘露醇组相比，*p《0.05,**p《0.01。[0045]分组方式二[0046]control组：nci-h292细胞正常孵育24h。[0047]20％甘露醇组：nci-h292细胞使用含20％甘露醇的培养基孵育24h。[0048]流式细胞术检测各组细胞孵育24h后的细胞凋亡情况(结果如图2)；westernblot检测各组细胞孵育24h后细胞中bcl-2、bax的蛋白表达水平(结果如图3所示)。[0049]分组方式三[0050]control组：nci-h292细胞正常孵育48h。[0051]20％甘露醇组：nci-h292细胞使用含20％甘露醇的培养基孵育48h。[0052]流式细胞术检测各组细胞孵育48h后的细胞凋亡情况(结果如图2所示)；westernblot检测各组细胞分别孵育48h后细胞中bcl-2、bax的蛋白表达水平(结果如图3所示)。[0053]3.3cck-8[0054]离心收集取各组细胞，以1×104/孔的密度接种到96孔板中，每组设3个复孔，按分组情况加入相应的培养液，分别孵育1、2、3、4、5、6、7天后，采用cck-8进行测定：pbs冲洗3次，每孔添加100μl含10％cck-8工作液的培养基，轻轻摇晃均匀，放入细胞培养箱进行孵育。孵育2h后，通过酶标仪在波长450nm处检测各自的吸光度值，并进行相应的比较分析。[0055]3.4流式细胞术检测细胞凋亡[0056]1)细胞依次根据分组方式进行对应的处理后，用pbs润洗2次；[0057]2)用不含edta的胰蛋白酶处理细胞，待细胞变形且细胞间连接消失时，使用完全培养液终止消化；[0058]3)细胞悬液转移至无菌离心管中，800rpm离心5min，吸弃上清；[0059]4)加入0.5ml染色缓冲液重悬细胞；[0060]5)加入5μlfitc染液和5μlpi染液，轻柔吹打混合均匀，室温条件下避光孵育15min；[0061]6)上流式细胞仪进行检测。[0062]3.5westernblot[0063]3.5.1细胞总蛋白提取[0064]将各组制备为细胞悬液分别接种于6孔板中，每孔细胞数为5×105，待细胞贴壁后按照实验分组进行相应处理，处理结束后，收集细胞，离心弃上清，用预冷得pbs洗涤细胞样本两次，每100μl压缩体积的细胞样本加入1ml添加了pmsf的ripa，充分裂解后，4℃12000g离心5min，立即吸取上清至一预冷的eppendorf管中，即为抽提得到的细胞蛋白，冻存于-80℃备用。通过bca法进行蛋白定量，最后加入5×loadingbuffer沸水浴10min，样品制备完成，可以-20℃保存。[0065]3.5.2凝胶电泳及转膜[0066]根据待测蛋白分子量的不同，配制10％或12％的分离胶和5％的压缩胶，灌制sds-page凝胶。加入适量提前预冷的1×电泳缓冲液后，将之前生物标记的样品或细胞内总蛋白提取物加入泳道中(预染蛋白marker和样品)。80v稳压电泳约30min，待样品进入分离胶后，调整电压为120v继续电泳。待目的条带到达合适位置时(参照预染蛋白marker的位置)，结束电泳。比照凝胶大小剪pvdf膜，置于甲醇中活化1min，随后放入转膜缓冲液中浸泡，滤纸一并放入转膜缓冲液中浸泡15min。按照pvdf膜≥凝胶≥滤纸的原则制作转膜“三明治”，确保去除气泡后开始恒压转膜。转完成后，用丽春红s染液染膜5min，随后tbst清洗2次，观察膜上的蛋白。[0067]3.5.3显影[0068]将膜用tbst从下向上浸湿后，移至含有封闭液(5％bsa或5％脱脂奶粉tbst溶液)的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h，以封闭pvdf膜的免疫球蛋白结合位点。用tbst将膜上的残余液体洗干净，然后用封口机将膜置于自封袋中，封好三边后，加入用tbst稀释至适当浓度的一抗(具体一抗及稀释比见表2)，尽可能排出气泡，封闭袋口，4℃过夜。剪开自封袋，用tbst洗膜3次，每次10min。然后将膜置于封闭袋中，加入适量适当浓度的二抗(具体二抗及稀释比见table1)，封闭袋口，室温下孵育1h。剪开自封袋，用tbst洗膜3次，每次10min。等体积混合化学发光试剂a液和b液，将膜蛋白面向下与此混合液充分接触；5min后，用tanon6600发光成像工作站进行检测，同一个pvdf膜需多次曝光时，采用strip液(蛋白印迹膜再生液)于室温摇动洗涤45min后，用tbst洗涤3次，再从封闭步骤重新开始，后续步骤同前；蛋白表达量使用imageproplus6.0软件对光密度值进行分析，蛋白相对表达量计算为目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。[0069]表2抗体及其稀释度[0070]antibodiesdilution(application)bcl-21:1000(wb)bax1:1000(wb)gapdh1:10000(wb)rabbitanti-mouseiggh&l(hrp)1:10000(wb)[0071]3.6数据分析[0072]数据采用graphpadprism5(version5.01)进行分析与作图，adobeillustratorcs6(version16.0.0)进行整理合图。所有数据均以means±sd表示，组间统计学差异采用one-wayanova和tukey’s检验，p值小于0.05认为有显著性差异。[0073]4.结果[0074]4.1人肺鳞癌细胞nci-h292研究结果[0075]如图1所示，与control组相比，5％、10％、12％、15％、18％或20％甘露醇孵育后，人肺腺癌细胞、h1299细胞株在甘露醇所致的细胞凋亡中，抑凋亡基因bcl-2起主导作用；本发明中肺鳞癌的三株癌细胞的凋亡则是以抑凋亡基因bcl-2+促凋亡基因bax共同主导。[0090]5.2在特定浓度的甘露醇溶液下，人肺鳞癌细胞nci-h292、人肺鳞癌细胞nci-h226以及nci-h2170的bcl-2、bax的表达有存在差异，这可能是导致甘露醇对不同类型肺鳞癌细胞凋亡在机理机制上有不同的可能原因。这也侧面说明为何肺鳞癌在治疗中有的治疗效果好，有的治疗不佳的问题。[0091]为此，针对不同类型癌症，特别是肺鳞癌(或肺鳞癌细胞)，需要更进一步研究，为各型肺鳞癌临床治疗，提供可靠的科学依据和针对性方案。[0092]表3三株鳞癌细胞bcl-2、bax实验数据比较表[0093]当前第1页12当前第1页12