中药组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及中医药领域，尤其涉及中药组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.雄激素性脱发(androgenetic alopecia，aga)又称脂溢性脱发(seborrheic alopecia，sa)，是最常见的脱发疾病之一，是一种进行性模式型脱发，其特征是毛发密度进行性下降。根据汉密尔顿的研究，30岁时aga的平均患病率为30％，50岁时患病率为50％。aga多见于成年男性群体，并且患病率随年龄的增长而增加，其中典型的临床表现为前额及发际线后退，随着疾病的进展，患者头顶的头发也会逐渐脱落直至毛囊萎缩，无新生毛发或仅见毳毛，最终只留下枕部和颞部的头发，形成典型的马蹄形脱发。女性的脱发起病隐匿，主要是头顶头发减少，早期不易察觉，一般不累及发际线。由于aga是常见的损容性疾病之一，严重影响患者的身心健康，需要寻求更有效的治疗方法。
3.目前普遍认为aga可能与遗传相关，涉及多个基因，最明显的是x染色体上的雄激素受体基因，雄激素及雄激素受体(androgen receptor，ar)在aga中可能起着重要的作用。有研究表明，ar在aga患者头皮中有特异性的表达，在额部和头顶部表达升高，而在枕部表达正常。此外，aga与ii型5α还原酶的表达差异有关，该酶存在于毛囊的内根鞘，它可将睾酮(testoste rone，t)转化为二氢睾酮(dihydrotestosterone，dht)，而dht与ar结合的亲和力是t的5倍。ii型5α还原酶在额部的毛囊的表达较后枕部中的毛囊更高，因此额部的毛囊对雄激素更敏感，dht含量较高，这种现象在脱发患者的头皮中更为明显。当dht与其结合后激活ar信号通路，使得ar进入细胞核内结合到下游靶基因的启动子区启动该基因的转录，其中dkk-1(d ickkopf 1，dkk-1)为典型的一个下游靶基因，dkk-1转录合成后进一步负调控wnt通路，从而抑制细胞的增殖，促进毛发的脱落。因此，降低dkk-1的分泌可以发挥一定的防脱发作用。
4.aga的关键病理生理特征为炎症、毛发生长周期改变、毛囊微小化。三者相互影响，毛囊微炎症可能会导致毛囊干细胞凋亡、毛囊微小化和毛囊周围纤维化，而毛囊干细胞可影响毛发周期改变，而aga患者的毛囊随着毛发周期的循环，其生长期缩短，毛囊逐渐微型化，因此aga毛囊微小化的特征表现为生长期毛囊的数量逐渐减少，退行期和休止期毛囊的数量增加。故通过缩短毛囊休止期，延长生长期，促进毛囊由休止期进入生长期，均可能改善aga。
5.随着现代社会的发展，群众对物质依赖程度的下降，对美容方面的需求越来越高，aga是一种进行性的脱发疾病，严重影响了个人形象和自信心，目前尚无根治性的方法，而aga患病群体庞大，近年来其发病呈年轻化趋势，其治疗手段远远不足以满足患者强烈的治疗需求。目前fda批准用于治疗aga的非那雄胺和米诺地尔治疗效果有限且有一定的副作用，远不足以满足庞大的患病群体迫切的治疗需求。因此，寻求aga的替代疗法是非常必要的。中医药治疗方法多种多样、副作用较少、简单便捷，从而引起了人们的极大兴趣，中医药对于aga的治疗具有很大的市场潜力和探索空间，值得进一步研究推广，然而，现有中药生
发育发的研究方剂虽较多，但方剂疗效作用时间较长，无相关的体内药效验证实验，存在一定局限性。
6.因此开发治疗aga的中药组方，对于aga患者的治疗和临床应用具有重要意义。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了中药组合物及其制备方法和应用。本发明提供了中药组合物提取物，可促进毛发生长，在生发育发和辅助治疗脱发方面应用。本发明提供的中药组合物提取物的功能主治为：滋补肝肾、清热燥湿。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了中药组合物，以重量份数计，包括如下组分：
[0010][0011][0012]
在本发明的一些实施方案中，上述中药组合物，以重量份数计，包括如下组分：
[0013]
;
[0014]
或
[0015][0016]
;
[0017]
或
[0018]
;
[0019]
或
[0020]
[0021][0022]
本发明还提供了中药组合物的制备方法，取配方量的所述组分粉碎，醇提，收集提取液。
[0023]
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述收集提取液后还包括浓缩和/或冷冻干燥的步骤；
[0024]
所述浓缩的温度为70℃，浓缩比为1:15；所述冷冻干燥的压强为1pa，温度为-65℃，冷冻时间为24h。
[0025]
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述醇提采用包括90％乙醇浸泡，所述浸泡的时间为30min。
[0026]
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述醇提采用包括50％乙醇浸泡，所述浸泡的时间不少于72h。
[0027]
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述醇提采用超声提取；所述超声提取的时间为30min，次数为3次。
[0028]
本发明还提供了中药组合物提取物的制备方法，取上述中药组合物与乙醇混合、过滤后，与丁二醇和甘油水溶液混合，获得所述中药组合物提取物。
[0029]
上述制备方法中，所述甘油水溶液的体积分数为50％。
[0030]
上述制备方法中，所述取上述中药组合物与乙醇混合的时间为72h。
[0031]
本发明还提供了上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物在制备生发和/或育发的药物和/或制剂中应用。
[0032]
本发明还提供了上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物在制备治疗和/或预防雄激素脱发的药物和/或制剂中的应用。
[0033]
本发明还提供了上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物在制备调控dkk-1基因表达的药物和/或制剂中的应用。
[0034]
本发明还提供了药物或制剂，包括上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物以及药学上可接受的辅料。
[0035]
在本发明的一些实施方案中，上述药物或制剂中其剂型包括：内服汤剂、丸剂、外用淋洗或喷雾中的一种或多种。
[0036]
本发明还提供了药物组合包括上述中药组合物和/或上述制备方法获得的中药组合物及其他任意有效成分。
[0037]
本发明还提供了上述药物或制剂的使用方法，取样本给予所述药物或制剂。
[0038]
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中所述给予的剂量为0.01～4g/kg。
[0039]
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中所述给予的剂量为0.01～0.44g/kg(人)。
[0040]
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中所述给予的剂量为0.064～2.8g/kg(大鼠)。
[0041]
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中所述给予的剂量为0.091～4g/kg(小鼠)。
[0042]
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中所述给予的途径包括：淋洗或喷雾。
[0043]
本发明提供了中药组合物，以重量份数计，包括如下组分：
[0044][0045]
本发明的有益效果包括：
[0046]
(1)本发明提供的中药组合物提取物中各单药黑芝麻、首乌藤、墨旱莲、侧柏叶、泽兰、粉萆薢、黄芩、黄柏、桂枝、三七、降香、苏合香，选择一定份数制备提取物，能够促进c57bl/6小鼠毛发生长，调控dpc细胞中参与雄激素脱发发生过程中的关键细胞因子dkk-1基因的表达，从而发挥生发育发的功效。
[0047]
(2)本发明提供的中药组合物提取物，可促进毛发生长，在生发育发和辅助治疗脱发方面应用。
[0048]
(3)本发明提供的中药组合物提取物的功能主治为：滋补肝肾、清热燥湿。
[0049]
(4)本发明提供的中药组合物提取物适用于包括已脱发患者或预防脱发人群，临床表现为发少稀疏、掉发增多、头皮油腻潮湿、细软枯黄等。
[0050]
(5)本发明提供的中药组合物组方方解及作用机理为：本组方滋补肝肾、清热燥湿。“发为血之余”，方中泽兰、侧柏叶活血化瘀、凉血止血，且有生发乌发之功效，二者共为君药。黑芝麻、墨旱莲滋补肝肾，凉血止血，一则有益精血、生发乌发之功效，二则合侧柏叶凉血止血之功效；三七、降香活血化瘀，消肿止痛，与泽兰相辅相成，共奏活血化瘀之功效；黄芩、黄柏、粉萆薢清热燥湿；上药共为臣药。桂枝温通经脉，首乌藤养血安神，以上为佐药。少量苏合香为使药，可芳香开窍，辟秽止痛。诸药合用，既可活血化瘀、凉血止血，亦可滋补肝肾，补益精血以扶正补虚，也可化瘀止血、清热燥湿，以缓局部湿热之症状，还可养血安神，芳香开窍，病症结合标本兼治。
附图说明
[0051]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0052]
图1示各组小鼠毛发生长情况；
[0053]
图2示各组小鼠新生毛发生长状况评分；
[0054]
图3示中药组合物(实施例9、对比例3、对比例4)对dpc细胞dkk-1基因表达的影响。
具体实施方式
[0055]
本发明公开了中药组合物及其制备方法和应用。
[0056]
应该理解，表述
“……
中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
[0057]
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
[0058]
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
[0059]
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
[0060]
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
[0061]
本发明提供了一种中药组方，该中药组方提取物可在雄激素脱发动物模型中一定程度上逆转雄激素的作用，促进c57bl/6小鼠毛发生长；可调控dpc细胞中参与雄激素脱发发生过程中的关键细胞因子dkk-1的基因表达，从而发挥生发育发的功效。
[0062]
本发明提供的可用于制备生发育发的药物，由如下组分制成：黑芝麻0.01～15份、首乌藤2.5～100份、墨旱莲2.5～100份、侧柏叶2.5～100份、泽兰0.4～10份、粉萆薢2.5～100份、黄芩1.5～60份、黄柏1.5～60份、桂枝1.5～50份、三七0.75～30份、降香0.75～30份和苏合香0.075～3份。上述不同配比的中药组方均具有生发育发的作用，获得了优选的生发育发中药组方。
[0063]
本发明另一方面提供了中药组方提取物的制备方法，各单药粉碎后，用90％乙醇提取后浓缩，冷冻干燥(温度-65℃、时间24h、真空度1pa)，溶解制得。
[0064]
本发明另一方面提供了中药组合物提取物的制备方法，取配方量的三七，黑芝麻，降香，泽兰，粉萆薢，黄芩，黄柏，侧柏叶，首乌藤，墨旱莲，桂枝和苏合香加入6重量倍体积分数为50％的乙醇水溶液中泡制至少72h，得到泡制后的中药固液混合物，过滤分离，加入2.5％1,3-丁二醇，2.5％体积分数为50％的甘油水溶液，搅拌均匀即得到中药组合物提取物。
[0065]
本发明提供的中药组方提取物，可在一定程度上逆转雄激素的作用，促进c57bl/6小鼠毛发生长，调控dpc细胞中参与雄激素脱发发生过程中的关键细胞因子dkk-1的基因表达，从而发挥生发育发的功效。
[0066]
本发明提供的中药组方另一方面应用于制备生发育发的药物，包括汤剂、丸剂等不同内服药物和包括淋洗、喷雾等不同外用药物。
[0067]
本发明实施例1～实施例10、对比例1～对比例4、验证例1～验证例3中，所用原料及试剂均可由市场购得。
[0068]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0069]
实施例1
[0070]
黑芝麻3.75份、首乌藤2.5份、墨旱莲2.5份、侧柏叶2.5份、泽兰2.5份、粉萆薢2.5份、黄芩1.5份、黄柏1.5份、桂枝1.5份、三七0.75份、降香0.75份、苏合香0.075份。使用浓度(生药量)为人：0.11g/kg；大鼠：0.7g/kg；小鼠：1g/kg。
[0071]
实施例2
[0072]
黑芝麻7.5份、首乌藤5份、墨旱莲5份、侧柏叶5份、泽兰5份、粉萆薢5份、黄芩3份、黄柏3份、桂枝3份、三七1.5份、降香1.5份、苏合香0.15份。使用浓度(生药量)为人：0.22g/kg；大鼠：1.4g/kg；小鼠：2g/kg。
[0073]
实施例3
[0074]
黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰10份、粉萆薢10份、黄芩6份、黄柏6份、桂枝6份、三七3份、降香3份、苏合香0.3份。使用浓度(生药量)为人：0.44g/kg；大鼠：2.8g/kg；小鼠：4g/kg。
[0075]
实施例4
[0076]
黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰10份、粉萆薢10份、黄芩6份、黄柏6份、桂枝6份、三七3份、降香3份、苏合香0.3份。使用浓度为50μg/ml。
[0077]
实施例5
[0078]
三七30份，黑芝麻0.01份，降香30份，泽兰0.4份，粉萆薢100份，黄芩60份，黄柏60份，侧柏叶100份，首乌藤100份，墨旱莲100份，桂枝50份，苏合香3份。使用浓度(生药量)为人：0.01g/kg；大鼠：0.064g/kg；小鼠：0.091g/kg。
[0079]
对比例1
[0080]
黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰0份、粉萆薢0份、黄芩0份、黄柏0份、桂枝0份、三七0份、降香0份、苏合香0份。使用浓度为50μg/ml。
[0081]
对比例2
[0082]
黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰10份、粉萆薢0份、黄芩6份、黄柏6份、桂枝6份、三七3份、降香0份、苏合香0份。使用浓度为50μg/ml。
[0083]
实施例6中药组合物提取物的制备方法
[0084]
将实施例1配方中各药按黑芝麻3.75份、首乌藤2.5份、墨旱莲2.5份、侧柏叶2.5份、泽兰2.5份、粉萆薢2.5份、黄芩1.5份、黄柏1.5份、桂枝1.5份、三七0.75份、降香0.75份、苏合香0.075份称量后混合粉碎，用1000ml 90％乙醇浸泡30min后，标准超声提取30min，共3次，上清液使用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液。使用旋转蒸发仪将滤液制成提取物冻干粉，称取2.79g冻干粉(生药量22.325g，提取率：12.5％)，溶于223.25ml的75％乙醇中混合均匀进行使用，获得中药组合物提取物溶液。涂抹使用，使用浓度(生药量)为人：0.11g/kg；大鼠：0.7g/kg；小鼠：1g/kg。
[0085]
实施例7中药组合物提取物的制备方法
[0086]
将实施例2配方中各药按黑芝麻7.5份、首乌藤5份、墨旱莲5份、侧柏叶5份、泽兰5份、粉萆薢5份、黄芩3份、黄柏3份、桂枝3份、三七1.5份、降香1.5份、苏合香0.15份称量后混
合粉碎，用1000ml 90％乙醇浸泡30min后，标准超声提取30min，共3次，上清液使用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液。使用旋转蒸发仪将滤液制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，称取5.58g冻干粉(生药量44.65g，提取率：12.5％)，溶于223.25ml的75％乙醇中混合均匀进行使用，获得中药组合物提取物溶液。涂抹使用，使用浓度(生药量)为人：0.22g/kg；大鼠：1.4g/kg；小鼠：2g/kg。
[0087]
实施例8中药组合物提取物的制备方法
[0088]
将实施例3配方中各药按黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰10份、粉萆薢10份、黄芩6份、黄柏6份、桂枝6份、三七3份、降香3份、苏合香0.3份称量后混合粉碎，用1000ml 90％乙醇浸泡30min后，标准超声提取30min，共3次，上清液使用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液。使用旋转蒸发仪将滤液制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，称取11.16g冻干粉(生药量89.3g，提取率：12.5％)，溶于223.25ml的75％乙醇中混合均匀进行使用，获得中药组合物提取物溶液。涂抹使用，使用浓度(生药量)为人：0.44g/kg；大鼠：2.8g/kg；小鼠：4g/kg。
[0089]
实施例9中药组合物提取物的制备方法
[0090]
将实施例4配方中各药按黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰10份、粉萆薢10份、黄芩6份、黄柏6份、桂枝6份、三七3份、降香3份、苏合香0.3份称量后混合粉碎，用1000ml 90％乙醇浸泡30min后，标准超声提取30min，共3次，上清液使用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液。使用旋转蒸发仪将滤液制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于dmso中制成提取物母液，获得中药组合物提取物溶液，用于细胞实验，使用浓度为50μg/ml。
[0091]
实施例10中药组合物提取物的制备方法
[0092]
(1)将实施例5配方中各药粉粹后按三七30份，黑芝麻0.01份，降香30份，泽兰0.4份，粉萆薢100份，黄芩60份，黄柏60份，侧柏叶100份，首乌藤100份，墨旱莲100份，桂枝50份，苏合香3份称量后，加入3800.46ml体积分数为50％的乙醇水溶液中泡制至少72h，得到泡制后的中药固液混合物。
[0093]
(2)将步骤(1)中泡制后的中药固液混合物过滤分离，加入100ml 1,3-丁二醇，100ml体积分数为50％的甘油水溶液，搅拌均匀即得到中药组合物提取物。涂抹使用，使用浓度(生药量)为人：0.01g/kg；大鼠：0.064g/kg；小鼠：0.091g/kg。
[0094]
对比例3
[0095]
将对比例1配方中各药按黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰0份、粉萆薢0份、黄芩0份、黄柏0份、桂枝0份、三七0份、降香0份、苏合香0份称量后混合粉碎，用1000ml 90％乙醇浸泡30min后，标准超声提取30min，共3次，上清液使用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液。使用旋转蒸发仪将滤液制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于dmso中制成提取物母液，获得中药组合物提取物溶液，用于细胞实验，使用浓度为50μg/ml。
[0096]
对比例4
[0097]
将对比例2配方中各药按黑芝麻15份、首乌藤10份、墨旱莲10份、侧柏叶10份、泽兰10份、粉萆薢0份、黄芩6份、黄柏6份、桂枝6份、三七3份、降香0份、苏合香0份称量后混合粉碎，用1000ml 90％乙醇浸泡30min后，标准超声提取30min，共3次，上清液使用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液。使用旋转蒸发仪将滤液制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于
dmso中制成提取物母液，获得中药组合物提取物溶液，用于细胞实验，使用浓度为50μg/ml。
[0098]
验证例1
[0099]
构建dht诱导的脱发动物模型，在动物模型中，观察中药组合物提取物低、中、高不同浓度(实施例6、实施例7、实施例8)对小鼠毛发生长的影响，具体实验过程为：
[0100]
(1)c57bl/6小鼠(7周龄)适应性饲养5天后脱毛，设置对照组、模型组、米诺地尔组、实施例6组、实施例7组、实施例8组。模型组、米诺地尔组及实施例组脱毛后第1天皮下注射dht诱导构建雄激素性脱发小鼠模型，前5天注射dht浓度为7mg/kg，后16天注射dht浓度为3.5mg/kg，对照组注射相应体积的不含有dht的生理盐水。
[0101]
(2)方剂给药：dht或对照溶剂注射5天后开始每日在动物脱毛背部2cm*4cm涂抹200μl的相应药物，持续15d。其中对照组、模型组涂抹75％乙醇溶液，米诺地尔组涂抹5％米诺地尔溶液，实施例6组、实施例7组、实施例8组涂抹相应的方剂溶液。
[0102]
(3)记录小鼠背部皮肤颜色变化及毛发生长情况，并进行小鼠的皮肤拍照，共记录3次。(造模当天为d0天记录一次，每10天进行一次)。
[0103]
(4)每10天对小鼠脱毛区新生毛生长状况进行评分，评分标准为：无毛发生长为分浅毛长满脱毛区为1分；新生毛长度及密度约为未脱毛区的一半为2分；新生毛长与未脱毛区无差别为3分；出现不规则毛生长的小鼠按面积比率计算。计算每组平均分值并作曲线。
[0104]
(5)数据处理：采用graphpad prism 5.0、spss20.0软件对实验数据进行分析、统计及绘制图标。
[0105]
(6)结果如下：
[0106]
如图1所示：脱毛后，各组小鼠背部脱毛区皮肤呈现粉红色。随着时间推移，在脱毛后第10天时，对照组、米诺地尔组、实施例6组、实施例7组、实施例8组小鼠脱毛区皮肤显著变黑且己开始长出毛发，其中实施例8组小鼠脱毛区毛发较为浓度，毛发长度也较长，而模型组小鼠脱毛区皮肤才开始变黑。第20天时，对照组、实施例6组、实施例7组、实施例8组小鼠脱毛区毛发基本长满，毛发浓密，但模型组小鼠脱毛区毛发尚未完全长满。很明显，模型组小鼠背部脱毛区毛发生长速度落后于其他组，且实施例8组的小鼠毛发生长速度最快。
[0107]
表1 各组小鼠新生毛发生长状况评分
[0108][0109]
其中，表1对应图2的数据。
[0110]
如图2和表1所示，与模型组比较，对照组、米诺地尔组、实施例6组、实施例7组、实施例8组小鼠脱毛区在脱毛后第10天开始有明显的新生毛发长出，评分值逐日增加，且实施例8组小鼠毛发生长最快，提示实施例8组的方剂具有显著的促毛发生长作用；第20天时，模
型组小鼠背部脱毛区尚未完全长满，但对照组及实施例各组小鼠脱毛区新生毛发与未脱毛区已无显著差别。与对照组相比，
**
p《0.01，与模型组相比，
#
p《0.05，
#
p《0.01。
[0111]
验证例2
[0112]
利用qpcr技术，发现在人毛乳头细胞模型中，中药组合物提取物(实施例9、对比例3、对比例4)对dkk-1基因的表达影响，具体实验过程为：
[0113]
(1)dpc细胞以15万/孔铺于12孔板中，待24h细胞贴壁生长后，加入终浓度为50μg/ml的中药组合物提取物，同时设置dmso溶剂对照组，处理细胞24h；
[0114]
(2)利用fastking cdna第一链合成试剂盒(厂家：tiangen，批号：kr116-02)提取rna并反转为cdna。
[0115]
(3)qpcr反应，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。
[0116]
表2 dkk-1引物序列
[0117][0118]
(4)数据处理：采用graphpad prism 5.0、spss20.0软件对实验数据进行分析、统计及绘制图标。与对照组相比，
*
p《0.05，
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p《0.01，与实施例9组相比，
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p《0.05，
##
p《0.01。
[0119]
(5)结果如下：
[0120]
表3 中药组合物提取物(实施例9、对比例3、对比例4)在dpc细胞上的qpcr结果(n＝4)
[0121][0122]
其中，表3对应图3的数据。
[0123]
如表3和图3所示，与对照组相比，实施例9组、对比例3组和对比例4组的dkk-1基因均显著下降，且实施例9组下降的更为显著；与实施例9组相比，对比例3组和对比例4组的dkk-1基因则显著提高，以上结果提示这三组的方剂均有一定的防脱发作用，且实施例9组的效果更为显著。与对照组相比，
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p《0.01，与实施例9相比，
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p《0.05，
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p《0.01。
[0124]
验证例3
[0125]
(1)将实施例10制备的中药组合物提取物的使用方法是：每天使用两次，每次在头部(25cm2)涂抹2～4ml中药组合物提取物，十五天为一个疗程，一般经过两到四个疗程后停止用药，此时会明显长出大量头发。
[0126]
(2)临床试验：临床测试实施例10制备的中药组合物提取物促进头发生产效果，选取5人，男性4人，女性1人，男女平均年龄30～65岁，并且均有长期脱发或每天平均脱发100根左右，其中4名男性为长期局部无发患者，1名女性为严重掉发患者，分别对应采用实施例10制备的中药组合物提取物。取样品约2ml，涂抹于脱发部位(25cm2)，每天使用2次，连续使用时间1个月。防脱发效果的判定是通过评估每天洗发时头发的掉落根数计算，促生发效果是通过肉眼来计数，结果参照表4。本验证例组中病例3在30天内脱发区没有扩大，其余全部于患处长出新毛茬或绒毛且新生毛发可以持续生长，严重掉发显著减少。实验证明，实施例
10制备的中药组合物提取物对脱发患者具有防脱生发疗效。
[0127]
表4 实施例10制备的中药组合物提取物促进头发生产效果
[0128]
病例性别年龄改善情况病例1男63无发处长出新发病例2男58无发处长出新发病例3男46脱发区没有扩大病例4男60无发处长出新发病例5女37无发处长出绒毛
[0129]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。