一种神经修复材料的制作方法

一种神经修复材料
1.本技术是2020年8月12日递交的申请号为cn202010804103.9，发明名称为“一种神经修复材料”的分案申请。
2.技术领域
3.本发明涉及神经修复材料技术领域，具体为一种神经导管，用于修复受损或断裂的神经。
4.

背景技术：

5.神经损伤常见于各种外伤以及其他条件所造成的神经细胞部分或全部的损伤，是一种临床常见并且多发的损伤类型之一，常导致患者感觉和运动功能障碍或丧失，严重影响患者的日常生活质量和工作效率。寻找有效治疗神经损伤的治疗措施迫在眉睫；神经组织再生工程已成为修复神经系统损伤治疗的研究热潮，其关键是采用材料来支撑神经细胞的成长，较好的材料既可充当植入细胞或宿主神经干细胞的附着基质，其本身或其降解产物还可以促进神经细胞的生长；例如采用神经导管（nerve guide conduit，ngc）可以为神经断裂或长距离截断后再生提供多种有利的条件。在神经再生中，可暂时固定并支持缺损神经的两端，引导神经元的轴突轴向生长，避免外生和形成神经瘤，为神经再生提供一个相对隔绝的微环境，富集神经再生所需的神经营养因子，减少外源杂细胞的入侵，防止神经胶质疤痕的形成。
6.神经修复材料应该具有以下基本特点：(1)具有生物相容性和生物可降解特性，并且其降解速率合适可控，降解产物无毒性；(2)支持并促进轴突生长，具有合适的机械性能(强度、柔韧性)，以利于手术操作；(3)材料合成方便，容易加工成型。即理想的神经修复材料，首先应具有良好的组织、细胞生物相容性；其次应有合适的力学性能，再者应有利于促进轴突的生长延伸，同时不存在有害因子和各类不利成份，来抑制或破坏神经元的再生；最后应对神经元轴突的再生具有良好的导向作用。
7.目前已有的神经修复材料，按材料是否可降解，分为可降解性材料和不可降解性材料，可降解性材料主要包括：天然来源的材料和人工合成的材料。天然来源的材料，如细胞外基质（ecm），明胶、壳聚糖、藻酸盐、纤维素、透明质酸、脂质体、蚕丝蛋白等，组织相容性好，抗原性低，像ecm材料还具有天然的孔隙结构系统，利于细胞粘附，但通常其生物力学性能较差，缺乏足够的物理强度来保护受损部位；人工合成材料，通常是高分子材料，如pga，pla，plga等，这类材料其物理特性通常会较好，包括具有一定的机械强度，柔韧性，可降解性，渗透性；但是人工合成材料具有一定的细胞毒性，且生物相容性较差，致使宿主出现较强的炎症反应。有的合成材料，虽然能与宿主达到免疫耐受，但与细胞相容性差，不利于细胞的粘附和组织修复。由天然材料与人工材料复合而成的混合型材料，可以弥补单一品种材料的不足，具有一定的优势，但也不具有完全的优势，难以做到在修复材料的微观立体空
间结构、生物力学性能、生物相容性、有益活性成份含量、材质降解速度、降解产物活性等多指标方面，达到十全十美的程度。
8.去细胞神经修复材料是目前研究最多，也是最被看好的，真正能有效促进神经损伤修复的产品。
9.现有专利技术：d1：山东隽秀生物科技股份有限公司申请的发明专利201711282138.5，一种细胞外基质神经修复膜及其制备方法；其公开的神经修复膜是由异种动物周围神经处理而得到的多孔膜。该发明还公开了一种细胞外基质神经修复膜的制备方法，通过将异种动物周围神经进行去细胞处理后，最大限度的保留促进神经再生的有益成分，制得的细胞外基质神经修复膜安全性好，能特异性促进损伤神经的再生。
10.d2：中国医科大学申请的发明专利201911040953.x，一种新型复合材料制备的神经修复导管及其制备方法；其公开的制备方法，包括获取神经外膜导管，将神经外膜导管进行去细胞处理，得去细胞神经外膜导管；将去细胞神经外膜导管外层裹以高分子材料。该发明的方法，将外膜和神经纤维分离开来，使神经外膜能形成一个良好的管腔结构，在外面裹以一层高分子材料，使导管更加坚韧不易塌陷；供体神经来源更加广泛，根据不同直径要求的神经取材进行制备，适用于修复大间隙神经缺损。
11.d3：北京博辉瑞进生物科技有限公司申请的发明专利201710124327.3，一种去细胞神经修复材料、制备方法和应用。其公开的所述去细胞神经修复材料包含胶原蛋白、多糖物质、活性因子和促进神经再生因子，所述修复材料具有三维网状多孔结构，无免疫原性、可体内降解，并且可以是片状或中空管状。并且其去细胞原料为猪小肠粘膜下层组织。
12.d4：温州医科大学申请的发明专利201510679135.x，一种结合去细胞神经应用的去细胞神经修复材料，公开了该材料由去细胞同种异体或去细胞异种生物体的神经、修复材料、微管蛋白抑制剂、神经营养因子和干细胞组成，具有良好的生物相容性，提供神经再生修复所需的营养供应，能长时间维持神经再生最佳的理化和生物学微环境，具有防止神经瘤形成和促进缺损神经修复双重作用的去细胞神经修复材料。
13.d5：申请人卢世璧的申请号cn201010147529.8的发明专利，公开了一种神经组织基质源性组织工程支架材料的制备及其应用。以神经组织为原料，通过药物膨胀、机械粉碎、酶解处理、透析收集等手段提取出利于神经再生的基质成分(包括纳米级胶原微丝、纤粘蛋白微丝和层粘蛋白微丝)，去除了不利于神经再生的免疫原性成分(包括雪旺细胞、磷脂和轴突)。所制备出的神经组织基质源性材料单独或配以其他高分子材料可进一步通过定向结晶、冷冻干燥和交联制备成三维多孔取向支架，或者利用电纺丝技术制备纳米级别薄膜，再缠绕形成神经再生导管。
14.d6：申请人卢世璧的申请号cn201010033726.7的发明专利，一种组织工程神经支架及其制备方法和应用；公开了采用软骨素酶abc，去除异体神经中的硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitinsulfateproteoglycans，cspgs)，得到细胞外基质的基底膜管，作为组织工程神经支架；适合修复周围神经缺损，对促进轴突再生作用非常明显，是较好的神经移植医用材料。
15.d7：山东省眼科研究所申请号cn201810845538.0的发明专利;一种去细胞神经基质材料及其制备方法和应用，公开的方法是将神经组织块消毒、清洗，震荡破碎，核酸酶酶
andolfactory-ensheathing glia with chondroitinase promotes locomotor recoveryafter complete transection of the spinal cord. j neurosci, 2005,25,1169-1178）。黄玉笛等研究发现chabc能通过降解大鼠变性视网膜异常沉积的cspgs，抑制光感受器细胞的凋亡，从而促进损伤视网膜的修复（硫酸软骨素酶缓解视网膜变性大鼠光感受器细胞凋亡, 扬州大学学报, 2012, 4, 465-466）。张宇等证明，胶质细胞源性神经营养因子缓释微球及nogoa、chabc缓释微球联合应用，能有效促进大鼠损伤神经再生神经功能的修复（中国组织工程研究, 2012, 16, 5401-5406）；王莹等研究发现，去细胞鼠坐骨神经材料经chabc处理注入骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells, mscs)后，可以修复大鼠缺损的坐骨神经（中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编）；康思雯等研究发现chabc联合mscs，在修复神经缺损中，能促进血管内皮生长因子(vegf)的表达等（中国解剖学会2012年年会论文文摘汇编）。神经组织横断损伤后，神经再生和功能恢复不仅需要受损轴突的生长，还需要形成有效的突触连接，这样才能正确传导神经冲动。
20.神经组织材料去细胞，经过去细胞处理，免疫原性细胞成分去除，能有效避免免疫排斥反应，同时神经能够保留原有的大部分空间构架和重要的ecm蛋白，像层粘连蛋白，纤维粘连蛋白等，与神经元生长环境相似，能很好的引导新生轴突的延伸生长。但是d6和d7两项发明专利的产品，使用chabc来降解cspgs，以达到消除硫酸软骨素（cs）和或cspgs对神经元再生的抑制作用；但是在该专利中，去细胞的组织，特别是去细胞猪神经组织（如胫神经中），其本身所含有的硫酸软骨素相对而言就不高，要比透明质酸浓度要低；但使用了较高浓度的硫酸软骨素酶abc，并且作用时间较长，37度达到6小时。因为硫酸软骨素酶abc是一种混合酶，其不仅消化硫酸软骨素，而且还会消化其中的透明质酸，将其降解为二寡糖；由于采用硫酸软骨素，高浓度长时间地处理去细胞神经组织，必然会破坏其中的透明质酸及其交联，进而直接影响去细胞材料的力学性能如拉伸强度；因为去细胞材料中的天然透明质酸大分子，具有优异的天然交联作用（胶原蛋白和透明质酸之间交联），能增强ecm的力学性能。
21.所以找到一种既能简化去除硫酸软骨素的方法，又不破坏材料本身力学性能，是本发明的主要目的。
22.

技术实现要素：

23.本发明的第一目的是，提供一种新型的神经修复材料，材料中不再含有对神经元再生起抑制作用的硫酸软骨素蛋白多糖 (从患者角度来看，属于外源性cspgs)。
24.第二目的是：提供的神经修复材料，具有良好生物力学性能（如拉伸强度）和更多促愈合有益活性成份（如ha）。
25.第三目的是：提供的神经修复材料，其中的成份可与神经组织创伤处的cspgs结合(从患者角度来看，属于内源性)，可有效减缓及阻止创伤处内源性cspgs对神经再生的抑制作用。
26.第四目的是：提供的神经修复材料，在生物相容性好，免疫原性低的基础上，同时兼具良好的抗菌消炎功效。
27.为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案如下：
所述神经修复材料，经过cspgs拮抗剂的处理，所述cspgs拮抗剂为强阳性离子大分子，所述强阳性离子大分子的分子量为2千到3万，所述强阳性离子大分子为天然聚合物、及其衍生物或其类似物中的一种或其复合物。
28.进一步地，所述cspgs拮抗剂为鱼精蛋白、鱼精蛋白衍生物、鱼精蛋白结构模拟物之一或其组合物的处理，达到鱼精蛋白类强阳离子与cspgs牢固结合的目的。
29.进一步地，所述经过cspgs拮抗剂的处理中的处理，是指用含有0.1-10%鱼精蛋白、鱼精蛋白衍生物、鱼精蛋白结构模拟物之一或其组合溶液，对神经修复材料进行浸泡、涂抹、喷洒中的一种或联合方式处理。
30.进一步地，所述鱼精蛋白，是源自鲑鱼、鲱鱼、红鳟鱼、以及哺乳动物中的一种或其混合物，包括单鱼精蛋白、双鱼精蛋白和三鱼精蛋白。
31.进一步地，所述处理，是指用含有0.5-2%鱼精蛋白溶液，对去细胞神经修复材料进行浸泡，所述浸泡，每次浸泡30分钟-5小时，然后用缓冲液冲洗10-50分钟，可重复前述浸泡与清洗步骤一到三次，最后一次鱼精蛋白溶液浸泡后，不要再用缓冲液冲洗，就将其直接干燥、定型。
32.进一步地，所述神经修复材料，以去细胞材料（ecm）为主，可含有可降解材料，所述可降解材料为合成类高分子、天然多糖类高分子材料、胶原类材料之一或其复合物，通过静电纺丝、粘合或缝合与去细胞材料结合。
33.进一步的，所述合成类高分子为聚氨基酸、聚己内酯，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚乙二醇、聚氨基酸之一或其组合物。
34.进一步地，所述天然多糖类高分子材料，纤维素类、壳聚糖、海藻酸之一或其组合。
35.进一步地，所述去细胞材料中，是指去除哺乳动物组织中的细胞，所述哺乳动物为猪、牛、羊、马、驴、驼、兔，所述组织，是指腹膜、真皮、小肠粘膜下层（sis）、胃膜、骨膜、心包膜、筋膜、神经、血管中的一种或其组合。
36.进一步的优化方案为，所述去细胞神经修复材料，为去细胞的猪小肠粘膜下层、坐骨神经、股动脉血管。
37.进一步的优化方案为，所述猪为饲养月龄超过10个月以上的成年猪，去细胞材料为空肠粘膜下层。
38.进一步的优化方案为，所述去细胞为使用物理方法、化学方法、生物学方法之一或其组合，所述物理方法为渗透压法，所述化学方法为表面活性剂处理，所述生物学方法为蛋白酶消化；所述蛋白酶为胰蛋白酶。
39.进一步的优化方案为，化学方法去细胞，使用的表面活性剂为sds、tritonx-100，tritonx-200、脱氧胆酸钠、植物源表面活性剂之一或其组合物。
40.进一步的优化方案为，所述去细胞试剂为植物源表面活性剂，优化的试剂为：三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；有效的去细胞工作浓度为重量比（w/w）0.05-3%。
41.进一步地，所述神经修复材料形状为中空管状或片状，长度1-5cm，直径0.1-0.9cm，管材或片材厚度为0.1-1.5mm。
42.进一步，具体而言，使用含有0.5-2%鱼精蛋白的溶液，对神经修复材料半成品或成品，于37℃浸泡1-2小时，再用pbs缓冲液冲洗10-15分钟，重复前述浸泡与清洗步骤一到三次，最后一次浸泡后，不要再用缓冲液冲洗。
43.进一步，所述鱼精蛋白，为鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼源鱼精蛋白；优选分子量在8000道尔顿以下，优选4000-6000道尔顿范围内的。
44.进一步，所述鱼精蛋白，还可以包括医学上其可接受的硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、盐酸盐、碳酸盐等无机盐，以及有机盐形式，如马来酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、水杨酸盐、苹果酸盐等；优选硫酸盐鱼精蛋白。
45.进一步的，所述神经修复材料，为天然生物可降解材料、人工合成生物可降解材料之一或其组合。
46.进一步的，所述的天然生物可降解材料，胶原类材料、壳聚糖、海藻酸之一或其组合。
47.进一步的，所述的哺乳动物为猪、牛、羊、马、驴、驼、兔，所述组织，是指腹膜、真皮、小肠粘膜下层、骨膜、心包膜、筋膜、神经、血管中的一种或其组合。
48.进一步的，所述哺乳动物组织为，猪的小肠粘膜下层、坐骨神经、股动脉血管。
49.进一步的，所述的去细胞，为使用物理方法、化学方法、生物学方法之一或其组合，所述物理方法为渗透压法，所述化学方法为表面活性剂处理，所述生物学方法为蛋白酶消化；所述蛋白酶为胰蛋白酶，所述表面活性剂处理为sds、triton x-100，tritonx-200、脱氧胆酸钠、植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；所述表面活性剂的有效工作浓度，重量比为0.05-3%。
50.另外还可以，在本发明的神经修复材料中，加入了一些细胞因子，如生长因子和粘附因子，如神经生长因子（ngf）、脑源性神经营养因子（bdnf），通过控释或缓释这些细胞因子，能够促进受损神经元轴突的伸展和再生，有利于神经组织的再生和功能的康复，如神经传导速度恢复、复合肌肉动作电位（cmap）正常。
51.另外的技术方案，还可以包括，将去细胞组织（在去杂、去脂，去细胞、去dna、去α-半乳糖苷后）粉粹，加入蛋白酶溶液，搅拌直至溶解，得到去细胞溶液；直接在去细胞基质溶液中加入0.1-2%（w/w）的鱼精蛋白类，并充分混匀，再注入自制的各种不同形状和大小模具中，冷冻干燥定型，可得本发明的神经修复材料。
52.本发明的有益效果在于：1.本发明提供的一种神经修复材料，与现有技术相比，本发明不是利用消化酶，不是免疫学上的抗体中和，也不是现有常见的抗神经胶质增生剂，而是采用与cspgs具有明显拮抗作用的成份，例如鱼精蛋白，对神经修复材料进行处理，从而牢固结合神经修复材料上所含有的抑制神经元轴突生长的成份，不仅处理方法简便，大大缩短了处理时间，而且也不会破坏材料本身的力学性能（现有技术是要么不去除cspgs，保留力学性能；要么去除了cspgs，但降低了力学性能）。本发明的方法操作方便，制备成本低，临床实用性强，效果好；易于操作和控制，具有广阔的应用前景。
53.2.本发明提供的一种神经修复材料适度过量负载cspgs拮抗剂，不仅可以屏蔽材料本身含有的cspgs对神经再生的抑制作用，还可以与患者术部神经胶质疤痕中原有的、残留的抑制轴突生长的成份相结合，克服了外源性和内源性cspgs对神经再生的二重抑制作用，明显有利于神经元的修复和神经组织的再生和功能的康复。
54.3.本发明提供的一种神经修复材料，力学性能好，有足够的支撑强度和持久度，不易变形，具有较好的回弹性，以引导神经细胞轴向生长；即使是长距离神经损伤的修复，因
为神经修复材料既可以有较好强硬度，又可以有较慢的降解速度，同样可以修复这类长神经的损伤。
55.4.本发明提供的一种神经修复材料具有良好的生物相容性和合理的天然三维孔隙率，有利于细胞的粘附，有利于营养物质的高效运输与利用；材料中含有更多的有益成份，对神经组织再生有明显的引导和促进作用。
56.5.本发明提供的一种神经修复材料，选材无毒无害，完全可生物降解，主要的降解产物不会引发炎症；主材为去细胞基质，无免疫原性或低免疫反应性，降解速度的相对可控；适用于不同类型，不同粗细的神经缺损的修复（如老年人神经修复稍慢，儿童青少年神经修复会较快，大神经和小神经）。
57.6.本发明提供的神经修复材料所负载的鱼精蛋白，还具有抑菌作用，在人体内降解后，成为精氨酸，有益于人体健康；鱼精蛋白还具有抗肿瘤、缓解疲劳、增强肝功能、刺激垂体释放促性腺激素等多种功效。
58.发明机理：1.神经修复材料，该材料经过采用天然强阳离子（如鱼精蛋白）处理；一方面能牢固结合材料中的cspgs（外源性），另一方面还可与神经组织创伤处的cspgss结合(内源性)，即可有效减缓及阻止外源性和内源性cspgs对神经再生的抑制作用。
59.2.神经修复材料以去细胞材料为主，并且采用植物源去细胞试剂，一方面能较完好的维护ecm的三维立体结构，另一方面能保留ecm中更多生长因子和有益活性成份（如ha和肝素）。
60.3.使用本发明的神经修复材料（如神经导管），不仅可促进神经元生长锥突破疤痕组织，有利于神经再生，而且还具有良好力学性能，有足够支撑强度以引导神经细胞轴向生长。
61.4.本发明的灵感或智慧贡献，首先是，来自对神经再生障碍原因的深入分析，特别是对cspgs作用机理的深刻认识，使神经细胞表面的rptp状态发生变化；其次是，对去细胞基质（ecm）中各类葡胺聚糖(gags)和蛋白聚糖(pg)的结构组成，成份特点和功能的准确了解，最后是对强阳离子天然聚合物的准确理解，以及对以天然精氨酸聚合物（以各类鱼精蛋白为代表）为代表的活性成份的科学定位。
62.5.鱼精蛋白可以牢固结合cspgs，使cspgs抑制轴突生长的活性降低或消失，从而允许在神经创伤处（胶质疤痕）的少突胶质细胞前体细胞（opc），迁移到脱髓鞘部位，并促进其分化为成熟的少突胶质细胞（odc），进而使得神经组织再髓鞘化；鱼精蛋白还可抑制轴突生长的其他物质的活性，如髓鞘相关糖蛋白(mag)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(omgp)、nogo蛋白(勿动蛋白)、生长锥塌陷的抑制因子膜损伤聚糖(imp)，从而显著改善神经髓鞘的修复与再生；有利于促进施旺细胞的生长和增值，引导神经元轴突的再生和神经功能的恢复。
63.6.本发明需要巧妙地结合了药学（鱼精蛋白）、病理学（神经元再生、生长锥延伸、坐骨神经功能指数sfi）、生物化学（透明质酸），组织工程学（去细胞工艺）、养猪知识（仔猪、出栏商品肉猪，成年猪，种猪）、天然植物化学试剂（如三萜烯皂素）等多领域交叉学科的前沿知识，本发明绝非显而易见，更不可能通过公知常识，仅仅简单的非智力劳动就能轻易获得本发明的技术方案，本发明具有一定的难度和高度。
64.本发明说明书中所述的技术名词
第一部分：神经组织相关的技术名词1.施旺细胞(schwanncell，sc)：是周围神经系统的胶质细胞，在轴突成髓鞘、周围神经元的组织化、神经元正常功能的维持、突触的形成以及对神经损伤和神经痛的反应等方面起着关键的作用。
65.2.华勒氏变性(walleriandegeneration, wd)，是由于上运动神经元的损伤所引起的轴突和髓鞘顺行性变性；1850年waller首先描述，在切断青蛙的舌咽神经及舌下神经时，发现除受损的神经纤维本身外，其远端的部分包括轴突、髓鞘也发生变性、裂解、被吞噬的现象。而这种现象广泛存在于周围神经及中枢神经系统里面；被切断的周围神经远端的组织学改变wallerian变性；中枢神经系统wallerian变性可发生于皮质脊髓束、皮质延髓束、皮质脑桥束等神经纤维束中，常见原因为脑梗死、脑出血以及肿瘤和脱髓鞘病。
66.3.神经胶质细胞（neuroglialcell,glial cell），简称胶质细胞:是神经组织中，除神经元以外的另一大类细胞，也有突起，但无树突和轴突之分，广泛分布于中枢和周围神经系统。在哺乳类动物中，神经胶质细胞与神经元的细胞数量比例约为10：1；在神经系统中的神经胶质细胞：主要有星形胶质细胞、少突胶质细胞(与前者合称为大胶质细胞)和小胶质细胞等。传统认为胶质细胞属于结缔组织，其作用仅是连接和支持各种神经成分，其实神经胶质还起着分配营养物质、参与修复和吞噬的作用，在形态、化学特征和胚胎起源上都不同于普通结缔组织。组织学特点：胶质细胞具有复杂多样的结构和表达丰富的分泌产物，它含有大部分神经递质、神经肽、激素及神经营养因子受体、离子通道、神经活性氨基酸亲和载体、细胞识别分子，并能分泌多种神经活性物质(生长因子、神经营养因子和细胞因子等)。
67.4.少突神经胶质细胞:(oligodendrocyte, odc），是指神经胶质细胞的一种，起源于外胚层;其形态：深色卵圆形核被薄而深的一层胞浆包围，核染色质成簇，具有少量放射状分枝突起，常呈串珠状。胞体较星形胶质细胞小，约6微米～8微米宽，呈圆形。胞浆中的细胞器浸没在一个深色的充满中等致密胶质颗粒的基质中。
68.5.神经胶质瘢痕：是指神经组织受损后，星形胶质细胞大量、快速进入活化增殖期，而后与小胶质细胞、巨噬细胞，以及这类细胞分泌的细胞外基质形成胶质瘢痕，此时的胶质瘢痕主要含cspgs；在组织学上，胶质瘢痕由星形胶质细胞和结缔组织组成，胶质瘢痕是抑制神经元轴突再生的主要屏障。胶质瘢痕不仅仅是神经再生的物理机械障碍，目前有较多研究表明，瘢痕中的生化成份（如cspgs等）所构成的化学障碍，应该是阻挡神经触突或生长锥伸展，以及神经组织再生的最主要障碍。
69.6.酪氨酸磷酸酶蛋白受体σ (receptor protein tyrosine phosphatase σ，rptpσ)是影响轴突生长作用的特异性受体。rptpσ是白细胞抗原家族成员，由类免疫球蛋白(ig)和纤维结合素
ⅲꢀ
(fnⅲ)重复片段等构成。该受体广泛分布于腺体和神经系统(高表达于海马，大脑皮质，嗅球，视网膜，室管膜下层)，参与神经的发育及神经组织的再生：主要表现为抑制轴突生长和参与胶质瘢痕的形成。rptpσ具有保守、正电荷胞外结构域，研究表明cspgs中带负电荷的多糖链硫酸软骨素(cs)正是rptpσ的结合位点。
70.第二部分：与神经修复材料相关活性成份的介绍。
71.1.硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitinsulfateproteoglycans，cspgs)结构组成是一组共价结合硫酸软骨素（cs）的蛋白质，由核心蛋白（cp）和糖胺聚糖
（gags）链共价连接的一个或多个线性cs组成，广泛分布于神经组织、结缔组织等机体各处。在本专利中，除非另有详细说明，所述的cspgs通常包括单独的cspgs和或cs；核心蛋白（cp）由透明质酸结构域、免疫球蛋白样结构域、内皮细胞生长因子样结构域、cs链连接的结构域、凝集素样结构域和完整的调节蛋白结构域组成;根据cp和gags链的不同cspgs可分为，aggrecan家族(包括聚集蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖等)、ng2、phosphacan等30多种，如tenascin、aggrecan、versican、brevican、neurocan(alsoknownaslecticans)、phosphacan and ng2等。研究证明，几种cspgs在神经系统损伤后形成的胶质瘢痕中表达显著上调，如磷酸蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和ng2，它们与胶质瘢痕抑制神经轴突再生的作用密切相关。研究表明，cspgs是阻碍神经损伤后再生的化学屏障，其发挥主要作用的部分是其cs链，并且与硫酸化的位置与程度有关；通过阻止cspgs的合成、阻断其作用的途径或降解cs链等手段，可以消除cspgs对神经再生抑制作用，可促进神经损伤修复。
72.2.硫酸软骨素(chondroitinsulfate,cs)：是一种糖胺聚糖(glycosaminoglycan,gag)，多从动物的软骨组织中提取，相对分子质量(mr)在10
‑‑
50kda之间。cs根据硫酸化的位置和多少又可以细分为，cs-a，cs-b（皮肤素），cs-c，cs-d，cs-e等不同类型。
73.3.抗神经胶质增生剂：是指能够降低神经胶质增生的试剂；常见的有，第一类是抗nogoa也称为内质网蛋白4(reticulon4)、神经内分泌特异性蛋白、神经突生长抑制剂、nogo、神经突生长抑制剂220；第二类为酶制剂，如软骨素酶abc(e.c.号：4.2.2.4)、β-d-木糖苷(e.c.号：217.897.1)、i型胶原蛋白酶(e.c.号：232-582-9)、丝裂霉素-c(casno)50-07-7)、mmp-3-基质金属蛋白酶(e.c.号：3.4.24，血管紧张素转换酶(acea，e.c.号：3.4.15.1)；第三类为抗体：如抗nogoa、抗tgfp1、2及3抗ng-2结构域，其他如：核心蛋白聚糖(decorin)(例如：人类核心蛋白聚糖，例如：uniprot登录号第p07585号，papn-β胺基丙酰基、甘露糖-6-磷酸(casno：3672-15-9)、被氧化的重组人数半乳凝素-1、柯佩松(copaxone)(醋酸格拉替雷)及三肽(ser-gly-gly)。
74.4.髓磷脂相关糖蛋白(myelinassociatedglycoprotein, mag)：是pns和中枢神经系统(cns)中一种微量的糖蛋白成分。
75.5.神经元周围网络（perineuronalnet，pnn），是一个高度组织化的糖蛋白网架结构，是一种包绕在特定类型神经元胞体和近端神经突周围的细胞外基质网络；其主要成分为硫酸软骨素蛋白聚糖（cspgs）、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（hspg）。
76.6.硫酸软骨素酶abc：是来源于多种细菌的胞内酶，该酶催化作用于细胞外基质成分中的糖胺多糖链中的4
‑‑
硫酸软骨素（cs-a）、6
‑‑
硫酸软骨素（cs-c）、硫酸皮肤素（cs-b）和透明质酸（ha），产物为不饱和二糖和寡糖。硫酸软骨素酶abc通过酶解硫酸软骨素蛋白多糖的糖胺多糖侧链，从而消除cspgs对神经再生轴突生长的抑制作用，间接促进神经组织的再生与修复。在神经损伤局部应用硫酸软骨素酶abc被认为是促进损伤神经的再生修复最有希望的方法之一；但硫酸软骨素酶abc在体内各种理化因素的作用下，失活较快，难以在神经损伤处，持续酶解硫酸软骨素蛋白多糖（cspgs）。
77.7.鱼精蛋白(protamine，ptm)：是从鱼类精巢中提取分离出的一种碱性蛋白质；一般由30－50个左右氨基酸组成，富含精氨酸，呈碱性，能溶于水和稀酸，不易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，稳定性好，加热不凝固。根据碱性氨基酸组成种类和数量的不同，可以将鱼精
蛋白分为单鱼精蛋白、双鱼精蛋白和三鱼精蛋白3种。其中，单鱼精蛋白仅含一种组分精氨酸，如鲑、鲱和虹鳟精蛋白等；双鱼精蛋白含有精氨酸、组氨酸或赖氨酸，如鲤精蛋白；三鱼精蛋白含有3种碱性氨基酸，如鲢、鲟精蛋白。
78.8.肝素是富含硫酸根的带负电荷的直链生物大分子化合物，是一类结构异常复杂的粘多糖，具有抗凝血、抗血栓生成、抗平滑肌细胞增殖、抗炎症等功能。肝素的精确结构还不清楚，一般认为它是由α-l-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯、n-磺基-α-d-氨基葡萄6-硫酸酯、β-d-葡萄醛酸和n-磺基-α-d-氨基葡萄糖-6-硫酸酯由糖苷键连接成“四糖”作为结构单元，再由“四糖”聚合成多糖。
79.第三部分：与神经修复材料相关的技术名词1)组织复合补片、组织再生材料、生物生物膜、生物修生物膜、生物支架、可降解生物膜、可吸收生物膜bio-mesh、bio-patch、patch、bioscaffold，ecm膜，这些个中英文名词或术语，表面上虽有不同，但其目的和用途基本是一样的；除非有特殊的具体说明，否则上述几个名词的内涵，在本发明中，都属于实质上是等同的。
80.2)神经修复材料、神经支架、神经导管、人工神经材料以及对应的英文名词，如nerve guide conduit(ngc)，在本发明中，在没有特别具体说明的情况下，这些术语或名词的意思是等同的。
81.3)细胞外基质ecm（extracellular matrix）：是存在于所有组织和器官中的非细胞成分，其不仅对细胞组织提供必需的物理支撑，为各种细胞的正常生理活动，提供适宜的场所及微环境；而且对组织的形态发生、细胞的趋化和分化，以及重要的生理生化和生物力学等方面，起到重要的杠杆调节作用，从而影响或调控组织和器官的功能。细胞50%的功能是由细胞外基质所营造的外部微环境所决定的。
82.4)组织衍生细胞外基质材料(extracellularmatrix，ecm)是由同种异体或异种的组织经过去细胞技术的处理而获得，其基础与应用研究在组织工程与再生医学的研究领域已逐渐成为研究热点。去细胞组织的细胞外基质支架材料是在有效去除天然组织中具有免疫原性的细胞成分的基础上，最大限度地保留了其天然发生的内部三维支架结构以及结构中的结构蛋白成分(通常以胶原蛋白collagen为主，可含有弹性蛋白elastins等)、特殊蛋白成分(包括纤连蛋白fn(fibronectins)、层粘连蛋白ln(laminins)、原纤蛋白等)、同时其中还携带有各类细胞生长因子(如成纤维细胞因子fgf、转化生长因子tgf、血管内皮生长因子vegf；可能也含有极少量但很重要的表皮生长因子egf和胰岛素样生长因子-1(igf-1)，另外细胞外基质中还含有糖胺聚糖（gags）类、蛋白聚糖 (包括hspg，cspgs等)等多种有益成份和生长因子，这些组织特有的内部结构和天然成分，是人工合成材料所无法完美复制和准确模拟的。
83.5)神经组织复合材料、神经组织再生材料、神经组织胶原膜、神经组织生物修复片、神经组织天然膜、人工神经组织修复材料，可降解神经组织生物膜，可吸收神经组织、神经组织再生材料、神经导管（简称），前述这些术语或名词，在本专利中，除非另有详细的说明与解释之外，可以理解为实质相同或等同，其主要成份都是胶原蛋白（主要是指其含量大于50%以上）。
84.6)神经修复材料是指用于神经组织缺损，暂时或永久性修补的片状、管状类材料。材质涵盖聚四氟乙烯/聚氨基甲酸酯类等不可吸收合成材料、合成生物可降解材料（如聚乳
酸/聚己内酯等可吸收合成材料）以及天然生物可降解材料，包括提纯胶原蛋白质类材料、去细胞（动物源性组织）ecm材料二类，其进一步ecm材料，包括同种异体、同种同体，异种动物等不同来源。
85.7)神经组织修复用胶原膜类产品，按成分或工艺分为三类：
①
去细胞基质膜（ecm膜）、
②
非去细胞基质膜（非ecm膜）、
③
混合型膜（结构组成上，既有ecm，又有非ecm膜）；非ecm膜又可分为二类，一类是纯化后的胶原膜（以i型胶原蛋白为主），这些多是取自动物的肌腱、真皮、腹膜、小肠粘膜下层等结缔组织，通过特定的处理技术提取出纯i型和或iii型胶原蛋白，再通过冷冻干燥等制成一定结构的膜片；另一个类是非纯化胶原蛋白膜，这些胶原膜，可以复合其他物质，包括不限于，可降解的聚合物或高分子物质，如聚乳酸类、壳聚糖类等，以及采用其他方法制备（如静电纺丝等），并且可以使用其他添加物（添加交联剂，改性剂、保护剂，抗菌剂等，以赋予或增强膜材料一定的性能；通常胶原蛋白主要是i型胶原蛋白、iii型胶原蛋白或其混合物；胶原蛋白还可以包括一定比例的ii型、iv型、vi型或viii型胶原蛋白或其任何组合或任何胶原蛋白类型。
86.8)去细胞（ecm）材料：包括但不限于来自，来自如猪、牛、马、羊、驴、驼、犬、兔等养殖的哺乳动物，取其小肠粘膜下层(sis)、腹膜、心包膜、羊膜、真皮、韧带、肌腱、sis、膈肌(胸膈)、网膜、肌肉或器官的筋膜；通过成熟的工艺去脂、去细胞、去dna，去其他抗原（如半乳糖苷）所获得的生物材料，主要含有i型胶原蛋白，同时来自部份组织（如真皮的ecm）也可以含有小于50%弹性蛋白。
87.9)小肠粘膜下层sis（small intestinal submucosa)，小肠组织包括空肠和回肠部分，在除去小肠粘膜层、肌层、浆膜层后所剩余的部分，首选参考us4956178中相关sis的描述和定义，并将sis作实质上广义性的拓展式理解。
88.10)糖胺聚糖gags（glycosaminoglycan）：也称粘多糖，为杂多糖的一种，主要存在于动物结缔组织中，是参与组织及软组织组织等正常生理活动的重要原料；按单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，糖胺聚糖可分为5个主要类别，透明质酸（ha)、硫酸软骨素(cs)、硫酸皮肤素(ds)、硫酸角质素(ks)、硫酸乙酰肝素和肝素(hp)。糖胺聚糖中的肝素（heparin）能抑制血小板聚集和血小板生长因子的释放，抑制血栓和瘢痕组织的过度形成。
89.11)透明质酸(hyaluronic acid)：也有学者称为玻尿酸（hyaluronan），又称糖醛酸、一种天然的线性多糖，是由葡萄糖醛酸和n-乙酞氨基葡萄糖的二糖单位，反复交替连接而成的直链均聚糖，为阴离子型聚合物，与其它粘多糖不同，它不含硫。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质，在机体内显示出多种重要的生理功能，如调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进细胞增殖、促进组织再生、创伤愈合；在全身所有的组织和体液中均含有透明质酸，是细胞外基质(ecm)中非常重要的活性成份。
90.12)去细胞基质actm（acellulartissuematrix）或无细胞组织基质：是指采用特定的试剂和处理方式，将动物器官或组织中的细胞、病毒、dna等会产生免疫排斥反应的成分充分地去除或灭活，最大限度地保留原有天然立体结构的完整性，以及尽量保留原有基质中的细胞生长因子和活性功能成份；去细胞ecm 具有天然的立体三维（3d）结构、含有生物活性因子、能够被宿主受体降解、易诱导受体干细胞移（易）位并分化等特点，被广泛应用于临床中，用于组织的修复和再生（先天缺损和后天创伤）；去细胞基质是新型的组织再生支
架，并具有良好的生物相容性、可降解性、无害性，ecm在形态上具有较大程度的可塑性。
91.13)坐骨神经功能指数（sfi）检测：自制一长60cm、宽10cm、高10cm的两端开口木槽，将70g白纸裁成与木槽等长等宽后铺于槽底。大鼠双后肢用颜料浸于双踝关节着色后，将大鼠放于槽的一端，使其自行向槽的另一方行走，每侧后肢各留下5～6个足印。
92.选择印迹清晰的足印分别测量正常足(n)和伤侧足(e)的3个指标：a、pl(足印长度)；b、ts(足趾宽度)；c、it(中间足趾宽度)。将上述指数代入bain公式，计算出坐骨神经功能指数。bain公式：sfi=109.5(ets
‑‑
nts)/nts-38.3(epl—npl)/npl+13.3(eit—nit)/nit-8.8。坐骨神经功能指数sfi=0为正常，-100为完全损伤。
93.除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和/或步骤，它们属于本文所述类型和/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值，范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，进一步指在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。
94.术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以诱导所需生物学结果的活性剂的量，例如，促进和/或恢复神经元再生和/或神经突生长。该结果可以是减轻疾病的体征，症状或原因，或生物系统的任何其他期望的改变。
95.下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
96.具体实施方式
97.实施例一：1.取材与预处理：在屠宰场，待商品肉猪（体重100公斤左右）屠宰后，取其小肠，使用机械刮除法，除去小肠的肌层、浆膜层、淋巴结；留下小肠粘膜下层（sis），置于1.0%醋酸溶液浸泡45分钟，sis与醋酸溶液的比例为1:10，再使用纯化水浸泡；2.消毒：使用含有1.0％过氧乙酸和20％乙醇的混合水溶液，sis与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100分钟，进行消毒，之后使用纯化水超声清洗3遍；3.脱脂：将sis用浓度95%乙醇，按sis与乙醇比例（w/w）为1:10，超声条件下，浸泡2小时；之后用去离子清洗3遍；4.去细胞：使用含0.8%皂素的溶液，在4℃和超声条件下浸泡sis30分钟；之后用同样浓度0.5%皂素溶液对sis进行冲洗15分钟；接着再用pbs-edta溶液对sis浸泡20分钟；可重复前述去细胞步骤一次；5.去dna和去α-半乳糖苷：用dna酶溶液和α-半乳糖苷酶溶液分别处理sis，中间及之后用pbs溶液流水式冲洗sis各三次，每次十分钟；6.将sis置于新配制的1.5％w/v鱼精蛋白溶液中，于37度作用（结合反应）30分钟，
接着pbs缓冲液漂洗；再重复浸泡30分钟一次，取出后，不要再用缓冲液漂洗；7.定型：对步骤6获得的sis半成品，三层叠放，置于管状或u状模具中，冷冻真空干燥，最后裁切、灭菌、包装即可；获得的成品长度1-5cm，直径0.1-0.9cm，厚度0.1-1mm，神经修复材料的形状中空管状或片状。
98.实施例二：对照组制备，去细胞sis（没有用鱼精蛋白溶液进行处理）步骤基本同实施例一，区别点只在于没有第六步操作。
99.实施例三：去细胞神经修复材料（淘汰母猪sis）步骤基本同实施例一，区别点只是在猪的月龄不同；取材部位都是一样的；例一是商品肉母猪，只饲养5-6个月，例三是淘汰母猪（饲养月龄达到40个月以上）。
100.实施例四：去细胞神经修复材料力学性能的检测对实施例1、2、3制备得到的神经导管样品进行检测；具体方法和结果如下表：从上表实施例一和实施例二的对比可以看出，使用鱼精蛋白处理过的sis，拉伸强度不但没有受到影响，反而对材料的力学性能有微小的加强，与现有技术（降低了材料的力学性能）相比，有了显著的提高。通过对比实施例一和实施例三，可以看出，采用母畜来源的sis，材料的力学性能得到了进一步的提升。
101.实施例五：去细胞神经修复材料中硫酸软骨素含量的检测对实施例1、2、3制备得到的神经导管样品，在干燥后，进行生物活性因子的检测；采用商业化elisa试剂盒对硫酸软骨素的含量进行检测；样品预处理方式是采用低温研磨法进行处理，检测结果如下表：从上表可以看出，使用鱼精蛋白处理后的sis材料中，残留的硫酸软骨素含量与未用鱼精蛋白处理的相比已经大幅度降低。与用酶处理的方法相比，处理时间也大大降低。
102.实施例六：动物神经缺损模拟实验采用实施例1、2、3制得的人工神经导管进行实验；实验大鼠共24只。腹卧位麻醉后，对其右下大腿外侧，纵向切开皮肤，小弯钳分离股外侧肌群，调整手术显微镜，用手术钩分离坐骨神经，暴露3.5厘米长的神经，切取2cm，人为制造神经缺损模型。选择长3.5厘米的人工神经导管，在距导管末端入针，在神经远端穿过神经，由导管内端入针，导管外侧出针，呈u字型缝合，使其固定，并打结；接着缝合肌肉膜和皮肤层。术后第八周，检测各试验组的坐骨神经功能指数（sfi），结果如下表：
从上表可以看出，使用鱼精蛋白后，坐骨神经功能指数可以更快的趋向于0（正常状态），且母畜的效果更明显。
103.本领域中普通技术人员可根据上述说明，对本发明做出多种简单的变化或调整或组合；因而，在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节和公知常识的替换，不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。