腺相关病毒制剂的制作方法

1.本公开涉及用于稳定腺相关病毒的水性组合物，以及包含该水性组合物的腺相关病毒制剂。


背景技术：

2.腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20-26nm之间，含有大小在4.7kb左右的线性单链dna基因组。重组腺相关病毒(raav)是在非致病的野生型aav基础上进一步改造而成的基因载体，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫原性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗研究中得到了广泛的应用。
3.期望用于递送目的基因以治疗疾病的aav制剂具有良好的稳定性，从而使制造、包装和储存过程期间的aav效力的损失最小化。合适溶剂的选择是保证aav制剂稳定储存的关键。此外，aav制剂的储存条件优选符合药品的市场化要求，最好不采用苛刻的冷冻保存条件，能够在室温条件下储存而保持aav制剂足够的生物活性。


技术实现要素：

4.鉴于本领域的上述需求，本公开的目的之一在于提供一种用于稳定aav的水性组合物，其可以有效地减少aav制剂存储期间的效力损失。本公开的目的还在于提供一种aav制剂，其可以在室温下储存一段时间后仍保持良好的稳定性。
5.在第一方面，本公开提供一种水性组合物，其包含：选自tris-hac、kh2po
4-na3c6h5o7或它们的组合的缓冲液；选自f68、ps20、ps80或它们的组合的表面活性剂；钠盐或钾盐；选自fe
2+
、ca
2+
和mg
2+
中的一种以上；以及可选的大分子聚合物。
6.在一个实施方式中，水性组合物中缓冲液的浓度为2-100mm，优选10-30mm，更优选20mm。
7.在一个实施方式中，水性组合物中表面活性剂的浓度为0.0001％～0.5％(w/v)，优选0.005％-0.05％(w/v)，更优选0.01％(w/v)。
8.在一个实施方式中，水性组合物中钠盐或钾盐的浓度为100-800mm，优选250-400mm，更优选350mm。
9.在一个实施方式中，水性组合物中fe
2+
、ca
2+
或mg
2+
的浓度为0.01-5mm，优选0.1-2mm，更优选1mm。
10.在一个实施方式中，水性组合物中大分子聚合物的浓度为0.1％-5％(w/v)，优选0.5％-3％(w/v)，更优选2％(w/v)。
11.在一个实施方式中，水性组合物还包含糖类。在一个实施方式中，糖类包括蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖和果糖。
12.在一个优选实施方式中，水性组合物中糖类的浓度为0.1％～10％(w/v)，优选1％-5％(w/v)，更优选2％(w/v)。
13.在一个优选实施方式中，糖类为蔗糖。
14.在一个实施方式中，水性组合物的ph值为4.5-8.5，优选7.0～8.5，更优选7.0～7.5。
15.在一个实施方式中，钠盐选自氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、磷酸钠和碳酸钠，优选氯化钠。在一个实施方式中，钾盐为氯化钾。
16.在一个实施方式中，大分子聚合物选自聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、甲基纤维素、羟丙纤维素、聚维酮和海藻酸钠，优选白蛋白。
17.在第二方面，本公开提供一种腺相关病毒制剂，其包含：腺相关病毒以及根据第一方面的水性组合物。
18.在一个实施方式中，腺相关病毒的滴度为1
×
108至5
×
10
14
vg/ml。
19.在一个实施方式中，腺相关病毒为重组腺相关病毒(raav)。
20.在一个实施方式中，腺相关病毒制剂为液体制剂、冷冻制剂或冻干制剂。
21.在第三方面，本公开提供钙离子或镁离子用于稳定腺相关病毒制剂的用途。
22.在一个实施方式中，钙离子或镁离子用于稳定腺相关病毒制剂的用途包括：用于维持腺相关病毒制剂中腺相关病毒的衣壳滴度；用于维持腺相关病毒制剂中腺相关病毒的基因组滴度；用于维持腺相关病毒制剂中腺相关病毒的活性；用于维持腺相关病毒制剂中腺相关病毒的单体百分比；和/或用于提高腺相关病毒制剂中腺相关病毒的蛋白变性温度。
23.在第四方面，本公开提供一种治疗疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第二方面的腺相关病毒制剂。
24.在一个实施方式中，腺相关病毒制剂通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。
25.在一个优选实施方式中，腺相关病毒制剂通过全身途径施用，例如静脉内施用。
附图说明
26.图1示出了实施例1中样品a至n在37℃10d(37℃下保持10天)条件下的衣壳滴度(fortebio)和基因组滴度(qpcr)的测定结果。
27.图2示出了实施例1中样品a至n在37℃10d条件下的蛋白变性温度(tonset初始变性温度和tm变性中点温度)的测定结果。
28.图3示出了实施例1中样品a至n在37℃10d条件下的sec(病毒单体相对百分比)的测定结果。
29.图4示出了实施例1中样品a至n在37℃10d条件下的相对体外活性的测定结果。
30.图5示出了实施例2中样品j、o至u在37℃10d条件下的衣壳滴度(fortebio)和基因组滴度(qpcr)的测定结果。
31.图6示出了实施例2中样品j、o至t在37℃10d条件下的蛋白变性温度(tonset初始变性温度和tm变性中点温度)的测定结果。
32.图7示出了实施例2中样品j、o至t在37℃10d条件下的sec(病毒单体相对百分比)的测定结果。
33.图8示出了实施例2中样品j、o至u在37℃10d条件下的相对体外活性的测定结果。
34.图9示出了实施例3中样品1至7在37℃10d条件下的衣壳滴度(fortebio)和基因组
滴度(qpcr)的测定结果。
35.图10示出了实施例3中样品1至7在37℃10d条件下的相对体外活性的测定结果。
36.图11示出了实施例3中样品1至5和7在37℃10d条件下的sec(病毒单体相对百分比)的测定结果。
37.图12示出了实施例3中样品1至5和7在37℃10d条件下的蛋白变性温度(tonset初始变性温度和tm变性中点温度)的测定结果。
38.图13示出了实施例4中样品8至13在0h条件下的蛋白变性温度(tonset初始变性温度和tm变性中点温度)的测定结果。
39.图14示出了实施例4中样品8至14在37℃10d条件下的基因组滴度(qpcr)的测定结果。
40.图15示出了实施例4中样品8至14在37℃10d和250rpm 10d条件下的相对体外活性的测定结果。
具体实施方式
41.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
42.如本文所述，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值以及在适当时其分数的值(例如一个整数的十分之一和百分之一)。
43.如本文所用，术语“aav”包括天然存在的腺相关病毒和重组形式的腺相关病毒(raav)，并且包括aav的突变形式。
44.如本文所用，“治疗有效量”是指对受治者给药后产生效果的剂量。确切的剂量取决于治疗的目的，并且是本领域技术人员使用已知技术可以确定的。
45.如本文所用，“储存”或“保存”是指制剂制备后不立即施用于受试者，而是使用前在特定条件(例如特定温度等)下放置一段时间。
46.如本文所用，术语“和/或”涉及并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合。
47.在一个实施方式中，缓冲盐包括：无机酸盐，例如磷酸盐(钠或钾)、碳酸氢盐等；有机酸盐，例如枸橼酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐等；氨基酸类，例如组氨酸、精氨酸、甘氨酸等；酸性缓冲剂，例如醋酸、磷酸、盐酸、碳酸、琥珀酸、枸橼酸、盐酸组氨酸、苹果酸等；碱性缓冲剂，例如氢氧化钠、tris、hepes等。
48.在一个实施方式中，表面活性剂选自：山梨坦脂肪酸酯类、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯类、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯蜂蜡衍生物、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯脂肪酸酰胺等。
49.优选地，表面活性剂选自聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯和聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚。特别优选地，表面活性剂选自聚山梨酯20(ps20)、40(ps40)、60(ps60)、80(ps80)、85(ps85)和泊洛沙姆188。最优选地，表面活性剂选自聚山梨酯20、80和泊洛沙姆188(pluronic f68)。
50.在一个实施方式中，水性组合物中表面活性剂的浓度为0.0001％～0.5％(w/v)，例如0.001％(w/v)、0.005％(w/v)、0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.05％(w/v)、0.10％(w/v)、0.20％(w/v)、0.30％(w/v)、0.40％(w/v)。
51.在一个实施方式中，水性组合物中hsa的浓度为0.1％-5％(w/v)，例如0.5％(w/v)、1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)、4％(w/v)、4.5％(w/v)。
52.在一个实施方式中，水性组合物中fe
2+
、ca
2+
或mg
2+
的浓度为0.01-5mm，例如0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm。
53.在一个实施方式中，fe
2+
由fecl2提供。
54.在一个实施方式中，ca
2+
由cacl2提供。
55.在一个实施方式中，mg
2+
由mgcl2提供。
56.本领域公知，aav衣壳起到靶向递送作用，将目的基因组包裹在病毒衣壳内部形成组合物，整体性质仍与蛋白衣壳相似。
57.应理解，本公开的腺相关病毒制剂包含aav，所述aav的衣壳蛋白可以是任何aav血清型的衣壳蛋白。
58.在一些实施方案中，aav包含选自以下的衣壳蛋白：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-11、aav-12、aav-13、aav-14、aav-15、aav-16、aav-dj、aav-dj8、aav-dj9、aavrh8、aavrh8r、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aav32.33、aav3b、aavv66、aavxl32、aav.php.b和aav2.1。
59.在一些实施方案中，腺相关病毒制剂是重构的冻干制剂。
60.在一些实施方式中，腺相关病毒制剂在长时间储存时保持显著的aav活性。
61.在一些实施方式中，腺相关病毒制剂是无菌的。“无菌”是指制剂中基本上没有免疫原性成分，例如基本上没有微生物(例如真菌、细菌、病毒、孢子形式等)。
62.在一些实施方式中，本公开的水性组合物或腺相关病毒制剂包含药学上可接受的其他成分。
63.下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。
64.实施例
65.实施例1.不同缓冲液和ph值的稳定性作用
66.本领域公知，ph是影响蛋白稳定性的重要因素，蛋白质的物理、化学稳定性均受到ph的影响。在本实施例中，研究不同缓冲溶液和ph值对aav稳定性的影响。
67.比较不同ph下的aav稳定性：缓冲液10mm pb-ca(kh2po4/na3c6h5o7(枸橼酸钠))缓冲范围覆盖ph 5.0～7.5，10mm aa(hac/naac)缓冲范围覆盖ph 4.5/5.0，10mm tris-aa(tris-hac)缓冲范围覆盖ph 8.5。以上缓冲液的ph范围覆盖4.5～8.5，用于比较不同ph下的aav稳定性。
68.比较不同缓冲液中的aav稳定性：10mm aa、10mm his-aa(his/hac)、10mm ca(c6h8o7(枸橼酸)/na3c6h5o7)、10mm sa(琥珀酸/naoh)缓冲范围均覆盖ph 5.0；10mm pb(kh2po4/na2hpo4)、10mm tris-aa、10mm pb-ca缓冲范围均覆盖ph 7.5。上述缓冲液用于比
较不同缓冲液对aav稳定性的影响。
69.如下表1所示，每个样品含有相同滴度的raav(bbm-h803，其衣壳为aavxl32.1，描述于wo 2019241324 a1，分子量约4000kda)，同时含有一定浓度的盐(nacl)和表面活性剂(f68)。
70.表1.样品a-n的配方设计
[0071][0072]
考察上述样品在配制完成后即刻(0h)以及在37℃下保存10天(37℃10d)条件下的fortebio(衣壳滴度)、qpcr(基因组滴度)、相对体外活性、sec(病毒单体相对百分比)、蛋白变性温度(初始变性温度t
onset
和变性中点温度tm)。结果数据如下表2所示。
[0073]
表2.样品a-n的稳定性测试结果
[0074]
[0075][0076]
如表1可知，在0h的条件下，不同样品的衣壳滴度(fortebio)、基因组滴度(qpcr)和sec均没有明显差异，蛋白变性温度表现出一定差异，并且趋势与37℃10d条件下的趋势一致。
[0077]
如图1所示，a-n样品在37℃10d条件下的衣壳滴度和基因组滴度的趋势基本一致。
[0078]
其中，a和b样品的测定结果显示，ph 5.0下的aav稳定性优于ph 4.5。g和h样品的测定结果显示，ph 7.5下的aav稳定性优于ph 8.5。i至n样品的测定结果显示，在ph 7.5-5.0范围内，aav滴度首先随ph降低而增加，在ph 5.5(m样品)处达到最大滴度，然后随ph降低而略有降低。
[0079]
f、g和i样品的ph均为7.5，区别在于缓冲液不同(分别为pb、tris-aa、pb-ca)，结果显示这三种不同缓冲液中的aav稳定性差异不大，但ph 7.5的tris-aa缓冲体系略有优势。b至e样品的ph均为5.0，区别在于缓冲液不同，测定结果显示，在ph相同的情况下，不同缓冲液中的aav滴度比较接近。
[0080]
a至n样品在37℃10d条件下的蛋白变性温度测定结果(如图2所示)与滴度测定结果趋势一致。在ph 5.0的情况下，仅c样品(his-aa缓冲液)的蛋白变性温度略低。
[0081]
如图3所示，在37℃10d的条件下，a至e样品以及m至n样品(ph为4.5～5.5)的sec测
定结果显示，不同缓冲体系的病毒单体相对百分比均较高。a和b样品的sec测定结果显示，与ph 4.5相比，ph 5.0下病毒单体相对百分比更高。f、g和i样品的ph均为7.5，区别在于缓冲液不同(分别为pb、tris-aa、pb-ca)，结果显示这三种不同缓冲液中的病毒单体相对百分比有显著差异，i样品(pb-ca缓冲液)明显高于f和g。i至n样品使用相同的缓冲液，但ph从7.5至5.0依次降低，结果显示病毒单体相对百分比随着ph降低而逐渐升高。
[0082]
如图4所示，a至n样品在37℃10d条件下的体外活性结果与其它检测结果的趋势差异显著。a至e样品的体外活性测定结果显示，ph 4.5和ph 5.0条件下样品活性均较低，其中a样品与b样品使用同一缓冲液，但ph值不同，结果显示ph 5.0的b样品的体外活性优于ph 4.5的a样品。f至i样品的体外活性测定结果显示，g样品(tris-aa，ph 7.5)表现出非常显著的活性(105％)，远高于具有相同ph的其他缓冲液的f样品(15％)、i(53％)或具有不同ph的相同缓冲液的h样品(30％)。i至n样品的体外活性测定结果显示，在缓冲液均为pb-ca的情况下，当ph 6.0～7.0时，aav具有良好的活性。
[0083]
实施例2.不同辅料的稳定性作用
[0084]
采用10mm pb-ca的缓冲体系，研究糖(蔗糖)、表面活性剂种类(f68、ps20、ps80)、二价盐种类(mgcl2、cacl2)和大分子蛋白(人血清白蛋白hsa)对aav稳定性的影响。此外，还比较了cacl2在不同ph下的稳定性作用。
[0085]
如下表3所示，每个样品含有相同滴度的raav和相同浓度的nacl。
[0086]
表3.样品j、o-u的配方设计
[0087][0088][0089]
考察上述样品在配制完成后即刻(0h)以及在37℃下保存10天(37℃10d)条件下的fortebio、qpcr、相对体外活性、sec和蛋白变性温度。结果数据如下表4所示。
[0090]
表4.样品j、o-u的稳定性测试结果
[0091][0092]
如表4所示，j和o-t样品在0h的条件下，不同样品的衣壳滴度(fortebio)、基因组滴度(qpcr)和sec均没有明显差异，蛋白变性温度表现出一定差异，并且趋势与37℃10d条件下的趋势一致。
[0093]
在37℃10d的条件下，j和o样品的测定结果显示，添加蔗糖可以一定程度上提高基因组滴度。j、p至r样品的测定结果显示，在ph 7.0的条件下，添加cacl2或mgcl2可以显著提高衣壳滴度和基因组滴度，并且cacl2明显优于mgcl2(如图5所示)。然而，q样品与实施例1中m样品测定结果对比显示，在ph 5.5条件下，添加cacl2未能改善衣壳滴度或基因组滴度。j、s至u样品的测定结果显示，将f68更换为ps20或ps80或者添加hsa均可以使基因组滴度略微增加。
[0094]
上述结果表明，在ph 7.0的条件下，添加cacl2或mgcl2可以显著增加aav稳定性，并且cacl2明显优于mgcl2。但是，在ph 5.5时，cacl2几乎不起稳定性作用。此外，添加蔗糖或hsa，或者将f68更换为ps20或ps80，均可以使aav稳定性略微增加。
[0095]
此外，j和o-t样品在37℃10d的条件下，蛋白变性温度测定结果(如图6所示)与滴度测定结果趋势一致，但样品间蛋白变性温度差异较小(q样品的蛋白变性温度最高)。
[0096]
在37℃10d的条件下，j和o样品的sec测定结果显示，添加蔗糖不影响病毒单体相对百分比。j、p和q样品的sec测定结果显示(如图7所示)，在ph 5.5或ph 7.0条件下，添加cacl2可以显著改善病毒单体相对百分比(增加至95％以上)。j、p和r样品的sec测定结果显示，添加mgcl2也可以明显提高病毒单体相对百分比，但效果差于cacl2。此外，j、s和t样品的sec测定结果显示，将f68更换为ps20、ps80后，病毒单体相对百分比没有明显变化。
[0097]
j和o-t样品在37℃10d的条件下，体外活性测定结果显示，添加蔗糖、mgcl2、hsa或者将f68更换为ps20、ps80均不会带来明显变化。如图8所示，令人惊讶地，在ph 7.0的情况下，添加cacl2可以实现非常突出的体外活性(133％)。但在ph 5.5的情况下，体外活性依然较低。
[0098]
实施例3.各成分浓度对aav稳定性的影响
[0099]
为了获得各成分的最佳浓度，设计了以下样品配方(表5)进行实验。各样品中aav滴度均为2
×
10
13
vg/ml。
[0100]
表5.样品1-7的配方设计
[0101]
样品缓冲液phnacl浓度表面活性剂补充成分110mm aa5.5300mm0.01％ps80-210mm aa5.5300mm0.01％ps801mm cacl2310mm aa5.5300mm0.01％ps805mm cacl2410mm aa5.5300mm0.05％ps80-510mm aa5.5400mm0.01％ps80-610mm aa5.5300mm0.01％ps802％hsa720mm tris-aa7.4350mm0.01％f681mm cacl2[0102]
考察上述样品在配制完成后即刻(0h)以及在37℃下保存10天(37℃10d)条件下的fortebio、qpcr、相对体外活性、sec和蛋白变性温度。结果数据如下表6所示。
[0103]
表6.样品1-7的稳定性测试结果
[0104][0105][0106]
如表6所示，在0h的条件下，不同样品的衣壳滴度(fortebio)、基因组滴度(qpcr)、sec和蛋白变性温度均没有显著差异，体外活性均较高。
[0107]
在37℃10d的条件下，通过样品1-3的比较可以看出，在ph 5.5的aa缓冲液中添加1mm cacl2不会引起滴度改变；将cacl2浓度提高至5mm可以使基因组滴度、体外活性、病毒单体相对百分比和蛋白变性温度(如图12所示)均略微提高。通过样品1和4的比较可以看出，ps80浓度从0.01％增加至0.05％可以使衣壳滴度和基因组滴度均略微提高，而对体外活性基本没有影响。通过样品1和5的比较可以看出，提高氯化钠浓度也可以使衣壳滴度、病毒单体相对百分比和蛋白变性温度略微提高，并显著改善体外活性。通过样品1和6的比较可以
看出，添加hsa可以显著改善体外活性。
[0108]
如图9至图11所示，令人惊讶地，样品7的基因组滴度、体外活性和病毒单体百分比明显高于样品1-6。
[0109]
实施例4.cacl2在不同缓冲体系中的稳定性作用
[0110]
在本实施例中，研究cacl2在不同缓冲体系(ph、缓冲液)中对aav的稳定性作用，同时将hsa和tris作为稳定剂考察稳定性，。各样品的配方如表7所示。
[0111]
表7.样品8-14的配方设计
[0112][0113][0114]
考察上述样品在配制完成后即刻(0h)、在37℃下保存10天(37℃10d)、室温下(20-25℃)以250rpm振摇10天(250rpm 10d)以及在-25℃/4℃反复冻融5个循环(-25℃/4℃5c)的sec、fortebio、qpcr、蛋白变性温度和相对体外活性。结果数据如下表8所示。
[0115]
表8.样品8-14的稳定性测试结果
[0116][0117][0118]
如表8所示，样品8-14在0h的条件下，不同样品的衣壳滴度(fortebio)、基因组滴度(qpcr)和sec均没有明显差异，蛋白变性温度在ph 5.5/6.5时最高(如图13所示)。
[0119]
如图14所示，样品8-14在37℃10d的条件下，基因组滴度在ph 4.5～8.5之间首先随ph增加而增加，在ph 7.5时达到最大值，然后随ph增加而下降；额外添加20mm tris对基因组滴度的影响不明显；额外添加hsa可以使基因组滴度略微提升。
[0120]
比较样品在37℃10d、250rpm 10d和-25℃/4℃5c条件下的测试结果可以看出，冻融对样品质量影响非常小，振摇对样品体外活性影响较大。如图15所示，37℃10d和250rpm10d条件下样品的体外活性趋势一致，在ph 4.5-8.5之间随ph变大而增大；额外添加20mm tris对样品体外活性的影响不明显；额外添加hsa可以使样品体外活性略微提升。
[0121]
令人惊讶地，cacl2在不同ph条件下的稳定性作用差异惊人显著。
[0122]
综合上述实验结果可知，添加cacl2可以显著改善aav稳定性，特别是在ph 7.5～
8.5的情况下。此外，增加nacl浓度或添加hsa均能增加aav稳定性。
[0123]
本公开中提及的所有出版物、专利申请、专利、核酸和氨基酸序列以及其他参考文献均通过引用全文的方式并入本文。
[0124]
虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。