二硫键修饰的纳米聚集体及其制备方法和应用

1.本发明涉及药物领域，更具体地，涉及二硫键修饰的纳米聚集体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.硫氧还蛋白还原酶-硫氧还蛋白(trxr-trx)系统和谷胱甘肽还原酶-谷胱甘肽-谷氧还蛋白(gr-gsh-grx)系统是生物体内氧化还原平衡的两大调控系统。trxr主要通过从nadph提供电子来维持内源性底物trx的还原状态，并调节各种基于氧化还原的信号通路，这些信号通路几乎涉及细胞功能的所有方面，如分化、增殖和死亡。
3.二硫化物是各种氧化还原体系的天然底物，但不同的构型可能表现出不同的特异性。特定的硫醇/二硫键交换反应是生物系统中许多重要途径的基础。线型二硫化物在细胞内硫醇-二硫化物的交换和还原过程中表现出不可逆性和非特异性，其中环状二硫化物通常表现出不同的动力学和热力学。线状二硫化物进入细胞后发生不可逆的裂解，导致其连接的化合物在细胞内释放。
4.在申请人之前的工作中，筛选出了trxr抑制剂cpul1，cpul1的结构记载在专利cn201510894070.0中，专利中的吡喃并[3,2-α]吩嗪衍生物即为cpul1，但cpul1较差的溶解性极大地限制了其进一步的抗肿瘤应用。


技术实现要素：

[0005]
发明目的：本发明的目的提供一种载药率高、粒径均一的二硫键修饰的纳米聚集体；本发明的另一目的是提供一种二硫键修饰的纳米聚集体的制备方法；本发明的另一目的是提供一种二硫键修饰的纳米聚集体的应用。
[0006]
技术方案：本发明的一种二硫键修饰的纳米聚集体，所述纳米聚集体包括cpul1和含有二硫键的化合物，纳米聚集体由cpul1和含有二硫键的化合物通过非共价相互作用修饰而成。
[0007]
二硫键(-s-s-)具有很好的生物活性(如抗肿瘤活性)以及独特的化学性质。二硫键可以在硫醇的存在下发生生物降解反应，且对trxr和gsh刺激具有响应性。二硫键还可以在高活性氧的肿瘤细胞内部发生氧化反应以增强药物递送系统的亲水性。基于这一特性，将二硫键作为前药分子或者载体，通过发生水解反应促进纳米颗粒的解体和释放。用二硫键修饰的纳米药物在没有进入细胞内部时可以稳定存在，在肿瘤细胞高浓度的trxr、gsh以及ros作用下，可以迅速降解并释放药物，可以有效避免药物的过早释放而对正常细胞产生的毒副作用。
[0008]
进一步地，含有二硫键的化合物为硫辛酸或二硫代二丙酸。
[0009]
进一步地，纳米聚集体的粒径为90-700nm。
[0010]
另一方面，本发明提供一种上述的二硫键修饰的纳米聚集体的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
(1)cpul1、含有二硫键的化合物分别溶于有机溶剂中，得到cpul1溶液及其含有二硫键的化合物溶液；
[0012]
(2)含有二硫键的化合物溶液中加入水，初次搅拌得到混合溶液，在上述混合溶液中加入步骤(1)中的cpul1溶液，再次搅拌均匀后得到二硫键修饰的纳米聚集体。
[0013]
进一步地，步骤(1)中，cpul1溶液和含有二硫键化合物溶液的摩尔浓度比为1：0.5-1：4。
[0014]
进一步地，步骤(1)中，有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酸乙酯、乙酸丙酯、二甲基亚砜或乙醇中任意一种。
[0015]
进一步地，步骤(2)中，所述初次搅拌和/或再次搅拌为磁力搅拌。
[0016]
进一步地，步骤(2)中，初次搅拌和/或再次搅拌温度为20-60℃，搅拌速度为50-1000rpm，搅拌时间为0.5-3h。
[0017]
进一步地，步骤(2)中，纳米聚集体中cpul1和/或含有二硫键的化合物的摩尔浓度为0.16-16mm/l。
[0018]
另一方面，本发明提供一种上述的纳米聚集体在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明的纳米聚集体的粒径在纳米级别，可以延长体内循环周期。纳米粒粒径较小，具有较好的epr效应，易于在肿瘤部位积聚，同时纳米粒结构中的二硫键具有靶向能力，可以对trxr进行特异性反应，提高细胞内ros水平，更有效地促进癌细胞凋亡。
[0019]
本发明借助epr效应和二硫键的线粒体靶向性构建了含环1，2-二硫杂环戊烷单元的硫辛酸(la)或含线状二硫单元的二硫代二丙酸(da)修饰的纳米聚集体，同时与不含二硫键的己二酸(aa)制备的无二硫化物的纳米聚集体cpul1-aa nas进行对照，发现二硫键修饰的纳米聚集体更稳定和可控。
[0020]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
[0021]
(1)载药率达100％，在纳米聚集体中，不含有其他载体材料，避免了载药率低而需要大量注射的问题和载体材料可能带来的额外毒性；
[0022]
(2)粒径均一的纳米粒子，可以延长体内循环周期、提高疏水药物的生物利用度，且易通过肿瘤部位的epr效应，在肿瘤部位积聚，降低对正常组织的暴露，更好地发挥抗肿瘤效果；
[0023]
(3)具有靶向性，可以特异性靶向trxr，诱导产生过量的ros，导致线粒体功能紊乱，进而触发细胞凋亡；
[0024]
(4)纳米药物的制备方法简单易行，可以节省成本，安全无污染。
附图说明
[0025]
图1为实施例1中cpul1-la nas的水合粒径分布，(a)为cpul1和la的摩尔比1：0.5的水合粒径分布；(b)为cpul1和la的摩尔比1：0.8的水合粒径分布；(c)为cpul1和la的摩尔比1：1的水合粒径分布；(d)为cpul1和la的摩尔比1：1.5的水合粒径分布；(e)为cpul1和la的摩尔比1：2的水合粒径分布；(f)为cpul1和la的摩尔比1：3的水合粒径分布；
[0026]
图2为实施例1中cpul1-la nas的稳定性，数据以平均值
±
sd表示(n＝3)；
[0027]
图3a为实施例1中cpul1-la nas在0.05mg/ml浓度中的透射电镜图像；
[0028]
图3b为实施例1中cpul1-la nas(摩尔比为1:1)水合粒径分布图；
[0029]
图4为实施例1中cpul1，cpul1-la nas和la的紫外光谱；
[0030]
图5为实施例1中cpul1和cpul1-la nas的荧光光谱；
[0031]
图6为实施例2中cpul1-da nas的水合粒径分布，(a)为cpul1和la的摩尔比1：0.5的水合粒径分布；(b)为cpul1和la的摩尔比1：1的水合粒径分布；(c)为cpul1和la的摩尔比1：1.5的水合粒径分布；(d)为cpul1和la的摩尔比1：2的水合粒径分布；(e)为cpul1和la的摩尔比1：3的水合粒径分布；(f)为cpul1和la的摩尔比1：4的水合粒径分布；
[0032]
图7为实施例2中cpul1-da nas(摩尔比为1:2)的水合粒径分布图；
[0033]
图8为实施例2中cpul1-da nas(摩尔比为1:2)的zeta电位分布图；
[0034]
图9为实施例2中cpul1-da nas(摩尔比为1:2)的稳定性，数据以平均值
±
sd表示(n＝3)；
[0035]
图10为实施例2中cpul1-da nas在0.05mg/ml浓度中的透射电镜图像；
[0036]
图11为实施例2中cpul1，cpul1-da nas和da的紫外光谱；
[0037]
图12为实施例2中cpul1和cpul1-da nas的荧光光谱；
[0038]
图13为实施例3中dmso-d6/d2o(5:1)中的la，dmso-d6/d2o(1:5)中的cpul1-la nas，dmso-d6/d2o(5:1)中的cpul1-la nas，dmso-d6/d2o(5:1)中的cpul1和dmso-d6(5:1)中的cpul1的氢谱图；
[0039]
图14为实施例3中dmso-d6/d2o(5:1)中的da，dmso-d6/d2o(1:5)中的cpul1-da nas，dmso-d6/d2o(5:1)中的cpul1-da nas，dmso-d6/d2o(5:1)中的cpul1和dmso-d6中的cpul1的氢谱图；
[0040]
图15为对比例中用流动力学尺寸表示的cpul1-aa nas的稳定性，数据以平均值
±
sd表示(n＝3)；
[0041]
图16为实施例4中cpul1-la nas(100μm)在1mm gsh水溶液中不同时间点的尺寸变化；
[0042]
图17为实施例4中cpul1-la nas(100μm)在trxr(50nm)/nadph(200μm)响应下的尺寸变化；
[0043]
图18为实施例5中不同浓度的样品(la、da、aa、cpul1、cpul1-la nas(摩尔比为1:1)、cpul1-da nas(摩尔比为1:2)、、cpul1-aa nas(摩尔比为1:2))对huh7细胞的杀伤作用结果图；
[0044]
图19为实施例5中不同配比的cpul1-la nas对huh7细胞的杀伤作用结果图；
[0045]
图20为实施例5中不同配比的cpul1-da nas对huh7细胞的杀伤作用结果图；
[0046]
图21为实施例5中不同浓度的样品(la、da、aa、cpul1、cpul1-la nas(摩尔比为1:1)、cpul1-da nas(摩尔比为1:2)、、cpul1-aa nas(摩尔比为1:2))对l02细胞的杀伤作用结果图；
[0047]
图22a为实施例6中游离的cpul1和cpul1-la nas在huh7细胞荧光强度随时间变化的曲线；
[0048]
图22b为实施例6中用流式细胞仪比较同一时间点的游离cpul1和cpul1-la nas在huh7细胞内的荧光强度；
[0049]
图23a为实施例6中游离的cpul1和cpul1-da nas在huh7细胞荧光强度随时间变化的曲线；
[0050]
图23b为实施例6中用流式细胞仪比较同一时间点的游离cpul1和cpul1-da nas在huh7细胞内的荧光强度；
[0051]
图24为实施例7中用流式细胞仪检测不同浓度(q1，死亡细胞；q2，晚期凋亡或坏死细胞；q3，早期凋亡细胞；q4，活细胞)cpul1、cpul1-la nas诱导的huh7细胞凋亡比率；
[0052]
图25为实施例7中用流式细胞仪检测不同浓度(q1，死亡细胞；q2，晚期凋亡或坏死细胞；q3，早期凋亡细胞；q4，活细胞)cpul1、cpul1-lda nas诱导的huh7细胞凋亡比率；
[0053]
图26为实施例8中采用激光共聚焦显微镜检测cpul1、cpul1-la nas在huh7细胞不同时间点的线粒体定位图片；
[0054]
图27为实施例8中采用激光共聚焦显微镜检测cpul1、cpul1-da nas在huh7细胞不同时间点的线粒体定位图片；
[0055]
图28为实施例9中细胞ros产生:通过荧光图像和流式细胞术分析huh7细胞中cpul1和cpul1-la nas的荧光强度；
[0056]
图29为实施例9中细胞ros产生:通过荧光图像和流式细胞术分析huh7细胞中cpul1和cpul1-da nas的荧光强度；
具体实施方式
[0057]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0058]
实施例1：cpul1-la nas的制备及表征
[0059]
本实施例提供的纳米聚集体包括cpul1和la，制备方法如下：
[0060]
(1)将4.34mg的cpul1溶于100μl二甲基亚砜中，得到cpul1摩尔浓度为100mm/l的溶液a；将2.06mg的la溶于100μl二甲基亚砜中，得到la摩尔浓度为100mm/l的溶液b；
[0061]
(2)取100μl溶液b注入到4.14ml去离子水中，在25℃下以500rpm的转速进行磁力搅拌，得到溶液c；取100μl溶液a注入到溶液c中混合，得到溶液d，在25℃下以500rpm的转速进行磁力搅拌0.5h，得到纳米聚集体。
[0062]
(3)保持cpul1的量不变，通过调节la的量为1.03mg、1.64mg、3.09mg、4.12mg、6.18mg来制备其他摩尔比(1：0.5、1：0.8、1：1.5、1：2、1：3)的纳米聚集体。
[0063]
用动态光散射(dls)来研究cpul1与la不同摩尔比的纳米聚集体的尺寸和尺寸分布，如图1所示，cpul1与la的摩尔比为1：0.5、1：0.8、1：1比摩尔比为1：1.5、1：2和1：3的纳米聚集体显示出更合适的颗粒尺寸和较均匀的尺寸分布。cpul1-la nas的表面电荷为+34.15mv。如图2所示在25℃的温度时cpul1-la nas在10天内表现出良好的稳定性。如图3a和图3b所示，当摩尔比为1：1时，流体力学直径和多分散指数分别为160nm和0.128，透射电子显微镜显示cpul1和la自组装成均匀的球形粒子。如图4，cpul1-la nas的uv-vis光谱显示出cpul1的典型吸收峰。如图5，cpul1-la nas的发射光谱与cpul1在dmso中的发射光谱相似，最大发射峰略有红移至552nm。然而，在相同浓度下，cpul1-la nas在水中的荧光强度远低于在dmso中的荧光强度。
[0064]
实施例2：cpul1-da nas的制备及表征
[0065]
本实施例提供的纳米聚集体包括cpul1和da，制备方法如下：
[0066]
(1)将4.34mg的cpul1溶于100μl二甲基亚砜中，得到cpul1摩尔浓度为100mm/l的溶液a；将2.10mg的da溶于100μl二甲基亚砜中，得到da摩尔浓度为100mm/l的溶液b；
da nas和cpul1-aa nas是否可以选择性地降低trxr。如表1所示，测量了nadph消耗引起的340nm处的吸光度变化，并计算了反应前30分钟内的衰减率。在gsh体系中，a
340
的本底衰变速率为1.12
×
10-3
min-1
，而nadph的氧化速率不随纳米聚集体的加入而发生明显变化，表明gsh不能还原纳米聚集体。在trxr和nadph混合体系中分别加入cpul1-la nas、cpul1-da nas和cpul1-aa nas时，nadph的氧化速率分别为17.3
×
10-3
min-1
、8.3
×
10-3
min-1
和6.6
×
10-3
min-1
，分别是背景衰减值0.54
×
10-3
min-1
的34倍、16倍和13倍。值得注意的是，cpul1-aa nas的有效性主要归因于cpul1固有的trxr抑制能力。因此，这些结果表明，本纳米聚集体中的二硫键单位能够与trxr进行特异性反应，和trxr抑制剂cpul1具有协同作用。
[0080]
表1：不同纳米聚集体对nadph的消耗率
[0081][0082][0083]
实施例5：cpul1-la nas和cpul1-da nas的细胞毒性评价
[0084]
本实施例中用四甲基偶氮唑盐比色法检测了cpul1-la nas、cpul1-da nas和cpul1-aa nas以及la、da和aa对huh7肝癌细胞和正常l02细胞的杀伤作用,其方法如下：
[0085]
(1)细胞培养：将huh7细胞培养于含有10％胎牛血清的dmem中，将l02细胞培养于含有10％胎牛血清的rpmi-1640中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。
[0086]
(2)细胞活力测定：用四甲基偶氮唑盐(mtt)比色法检测la、da、aa、cpul1、cpul1-la nas(摩尔比为1：1)、cpul1-da nas(摩尔比为1：2)和cpul1-da nas(摩尔比为1：2)对huh7细胞和l02细胞的细胞毒作用。以6000个细胞/孔将huh7和l02两种细胞接种于96孔板中，孵育12h后，分别向两种细胞中加入10μl不同浓度(2.5、5、10、20、40μm)的la、da、aa、cpul1、cpul1-la nas(摩尔比为1：1)、cpul1-da nas(摩尔比为1：2)和cpul1-aa nas(摩尔比为1：2)样品。培养48h后加入10μl的mtt(5.0mg/ml)。孵育4h后，取出培养基，加入150μl二甲基亚砜溶解紫色晶体。用多功能酶标仪测定溶液在490nm处的吸光度。以未经任何处理培养的细胞作为对照。每组设置3个平行复孔。
[0087]
如图18所示，所有单体几乎没有细胞毒性。而cpul1-la nas(摩尔比为1：1)、cpul1-da nas(摩尔比为1：2)、cpul1-aa nas(摩尔比为1：2)的ic
50
值分别为4.78
±
0.23μm、4.30
±
0.25μm、10.11
±
0.35μm。除cpul1-aa nas外，其余两种纳米聚集体的细胞毒性约为游离cpul1的2倍(ic
50
＝9.30
±
0.66μm)，这可能归因于纳米聚集体的线粒体靶向能力以及特异性选择trxr响应，说明通过该方法制备的自组装纳米聚集体能够以更低的药物浓度达到更好的肿瘤抑制效果。此外,如图19和图20，还测试了不同摩尔比的cpul1-la nas和cpul1-da nas的细胞毒性，但ic
50
值无显著差异。值得注意的是，如图21所示所有纳米聚集体对正常l02细胞都显示出非常弱的细胞毒性，这意味着它们具有巨大的生物安全潜力。
[0088]
实施例6：cpul1-la nas和cpul1-da nas的肿瘤细胞摄取
[0089]
在本实施例中，通过流式细胞仪观察huh7细胞对cpul1-la nas和cpul1-da nas的内吞作用进行观察，其方法如下：
[0090]
将培养的细胞接种于12孔板，每孔5万细胞，加入1ml dmem液体培养基(含10％胎牛血清)，摇匀后置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24h使其完全贴壁。huh7细胞分别用cpul1和提供的纳米聚集体处理1h、2h、4h和6h，其中cpul1的药物浓度分别为2.5μm、5μm和10μm。4h后，用pbs缓冲液洗三次，用4％多聚甲醛固定，再用pbs洗涤细胞3次，然后用dapi染细胞核。荧光显微镜下获取细胞荧光图像，由于cpul1自身带有绿色荧光，所以当ex＝490nm时药物分子可以直接在细胞内成像无需添加其他染料。
[0091]
在流式细胞仪检测中，选取生长状态良好的huh7细胞，接种于12孔板中(每孔30万细胞)，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24h使其完全贴壁，加入2.5μm的cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas样品溶液，分别孵育1h、2h、4h和6h。去除每孔培养基，每孔加入pbs清洗一遍，使用100μl tp消化致细胞脱落，用培养基中和tp，将得到的细胞悬液在400g离心5min，将得到的细胞沉淀物用pbs重复清洗两次后，上机检测。
[0092]
如图22a荧光信号增强显示，纳米聚集体在孵育1h后迅速定位到细胞质中，在相同条件下孵育2h、4h和6h后发出更强的绿色荧光。cpul1-la nas处理后的荧光强度随时间延长而逐渐增强。如图22b所示，在同一时间点，cpul1-la nas处理的细胞显示出比cpul1处理的细胞更大的荧光峰位移。同样如图23a和图23b所示，cpul1-da nas的结果与cpul1-la nas的结果相似。因此，这些结果说明与同样浓度的cpul1相比，本发明提供的纳米聚集体能被huh7细胞更多摄入可能得益于纳米聚集体表面的正电荷。荧光强度与细胞内单个药物分子的数量成正比，因此与他们的细胞毒性直接相关。
[0093]
实施例7：cpul1-la nas和cpul1-da nas诱导肿瘤细胞凋亡
[0094]
在本实施例中选用annexin-v-apc/7aad细胞凋亡检测试剂盒来检测cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas对huh7细胞的杀伤作用，其方法如下：
[0095]
(1)细胞培养：将huh7细胞培养于含有10％胎牛血清的dmem中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。
[0096]
(2)细胞活性观察：选取步骤(1)中状态良好的huh7细胞，以1.5
×
105cells/孔的细胞密度接种于12孔板中，放置5％co2培养箱中，37℃下培养24h使细胞完全贴壁。加入浓度为2.5μm、5μm和10μm的cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas的样品溶液进行处理。继续孵育24h后，小心弃去旧培养基，加入预热过的pbs清洗2次，用100μl胰酶(tp)对细胞进行消化，得到的细胞悬液在400g下离心5min，弃上清，用pbs重悬后重复离心步骤。将每只离心管中所得的细胞沉淀物加入500μl bing buffer悬浮细胞，分别加入5μlannexin-v-apc和5μl 7-aad染液，混匀。避光解育15min。用bd accuric6细胞流式仪在1h内进行上机检测。annexin-v-apc(ex＝633nm,em＝660nm)采用fl4通道检测，7-aad(ex＝546pm,em＝647nm)采用fl3通道检测。在检测过程中使用经调亡处理的细胞做荧光补偿调节，以消除光谱重叠而产生的实验误差。采集一万个细胞进行分区，统计每一个区域细胞百分比，分析细胞死亡的方式。
[0097]
结果显示，与相同浓度的游离cpul1处理细胞相比，cpul1-la nas处理的huh7细胞具有更高的细胞凋亡率。如图24所示，用cpul1-la nas(10μm)处理细胞后，44.2％的细胞处
于凋亡期。更准确地说，12.7％的细胞处于早期凋亡阶段，31.5％的细胞处于晚期凋亡阶段，而游离cpul1处理的细胞仅有24.9％处于凋亡阶段。当浓度为2.5和5μm时，结果与10μm时的结果一致。此外，用流式细胞仪检测了cpul1-da nas诱导的huh7细胞凋亡率，结果与cpul1-la nas相似，如图25所示。
[0098]
实施例8：cpul1-la nas和cpul1-da nas的线粒体靶向作用
[0099]
在本实施例中，测试cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas对huh7细胞线粒体的靶向作用，其方法如下：
[0100]
(1)细胞培养：将huh7细胞培养于含有10％胎牛血清的dmem中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。
[0101]
(2)纳米聚集体靶向线粒体观察：选取步骤(1)中状态良好的huh7细胞，以1
×
105cells/孔的细胞密度接种于铺有盖玻片的24孔板中，放置5％co2培养箱中，37℃下培养24h使细胞完全贴壁。用浓度为2.5μm的cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas的样品溶液处理细胞，37℃孵育2h和4h。加药孵育结束后弃去培养基，用pbs缓冲溶液清洗两遍，加入线粒体红色荧光探针mitotracker red(100nm)对huh7细胞避光染色30min。用4％多聚甲醛(pfa)固定20min，最后用pbs缓存溶液洗涤两遍以除去多余的pfa。取出盖玻片，放置于有抗淬灭剂的载玻片上，盖玻片四周滴上封固液，用激光共聚焦显微镜(clsm)检测线粒体在细胞内的定位。cpul1自身的绿色荧光与染料的红色荧光重叠产生黄色荧光。线粒体共定位程度用pearson相关系数表示。
[0102]
如图26所示，在huh7细胞中，cpul1-la nas和cpul1在孵育2h或4h可与染料共定位于线粒体，用纳米聚集体孵育2h或4h的细胞的pearson相关系数(pcc)值高于cpul1。同样，cpul1-da nas的结果与cpul1-la nas的结果相似，如图27所示。此外，随着时间的推移纳米聚集体的共定位荧光强度显著增加。这些实验结果表明，本发明提供的纳米聚集体具有良好的线粒体靶向性和快速地时间依赖性摄取特性。
[0103]
实施例9：cpul1-la nas和cpul1-da nas诱导线粒体损伤
[0104]
在本实施例中，通过测试cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas在huh7细胞内的ros增加水平来判断本发明中的纳米聚集体对线粒体的损伤作用，使用商用染料mitosox red对huh7细胞进行染色。mitosox红色线粒体超氧化物指示剂是一种新型染料，用于高选择地检测活细胞线粒体中的超氧化物。其方法如下：
[0105]
(1)细胞培养：将huh7细胞培养于含有10％胎牛血清的dmem中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。
[0106]
(2)细胞内ros水平观察：选取步骤(1)中状态良好的huh7细胞，以5
×
104cells/孔的细胞密度接种于铺有盖玻片的24孔板中，放置5％co2培养箱中，37℃下培养24h使细胞完全贴壁。用浓度为2.5μm、5μm和10μm的cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas的样品溶液处理细胞。继续孵育12h后小心弃去旧培养基，加入预热过的pbs清洗2次，用1ml染色液mitosox red(5μm)，37℃避光染色15min。吸弃染色液，并用pbs洗涤两次。取出盖玻片，放置于有抗淬灭剂的载玻片上，封片。在倒置荧光显微镜下观察细胞内ros生成情况并拍摄记录结果。
[0107]
用流式细胞仪对荧光进行定量分析，选取步骤(1)中状态良好的huh7细胞，接种于12孔板中(2.5
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105cells/孔)，放置5％co2培养箱中，37℃下培养24h使细胞完全贴壁。用浓
度为2.5μm、5μm和10μm的cpul1、cpul1-la nas和cpul1-da nas共同孵育24h，染料处理30min后，将细胞消化离心后收集起来，立即上机检测。通过调节补偿消除化合物自身荧光的干扰。
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如图28所示，cpul1-la nas以剂量依赖的方式诱导ros的产生。经cpul1-la nas处理的细胞线粒体显示出更强的红色荧光，而mitosox red被超氧化物氧化。与游离cpul1相比，细胞与相同浓度的cpul1-la nas孵育24h后，线粒体内超氧化物含量显著增加，导致超氧化物积累，线粒体膜损伤。同样，cpul1-da nas的结果与cpul1-la nas的结果相似，如图29所示。
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综上所述，本发明中的cpul1-la nas和cpul1-da nas纳米聚集体具有高的药物含量、良好的水溶液稳定性和巨大的生物安全潜力。值得注意的是，la的环状二硫化物和da的线性二硫化物赋予纳米聚集体靶向能力，通过gsh对trxr进行特异性反应。此外，cpul1-la nas和cpul1-da nas均表现出较快的细胞摄取特性，可被癌细胞内化，并能产生比游离cpul1更丰富的ros诱导细胞凋亡，从而显著提高对huh7细胞的抗肿瘤效果。本发明将为二硫化物修饰的自释放药物和细胞成像系统的个性化治疗和诊断提供新的机会。