一种能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡及其应用

1.本发明属于高分子材料领域，特别涉及一种能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡及其应用。


背景技术：

2.使用载体对稳定性较差的核酸疫苗、核酸药物、抗体等进行负载和保护，并将其递送至人体内的指定组织或细胞内，是实现药物疗效、疫苗效果的关键。
3.聚合物囊泡是一种中空球体结构的高分子聚集体，由两亲性嵌段共聚物在溶液中有序自组装而成。与脂质体相似，聚合物囊泡的内部水核可负载亲水性分子，疏水膜层可负载疏水性分子。由于两亲性嵌段共聚物往往较脂质有更高的稳定性和可修饰性，聚合物囊泡在稳定性和功能性方面都具备一定的优势，使其成为在药物递送、医学诊断、食品工业及化妆品行业等领域的新一代载体。
4.然而，尽管是聚合物囊泡具备较好的稳定性，长期存储问题仍然是一个限制其广泛应用的一个因素。尤其是当用于负载核酸等生物大分子时，即便生物大分子被包裹于载体内，存储一定时间后，仍然会因为水解等原因而降解，从而失去生物活性。
5.利用真空冷冻干燥技术制备药物或疫苗的冻干制剂是实现其长期存储的最有效的方法之一，可以减缓冷链运输的限制，便于常温长途运输和常温长期储存。真空冷冻干燥技术是一种药物水溶液在低温下冻结，而后在真空状态下将其中的水分直接升华干燥的技术。然而，负载药物的载体在冻干过程会面临两方面的问题：一是药物、活性成分在低温、真空、干燥的条件下可能会发生脱水、变性等反应；二是载体本身容易发生团聚或者融合。以上两点将导致复溶后的药物制剂失去原有的活性。因此，往往需要加入在药物制剂中加入辅剂进行保护，并优化冻干和复溶的条件和流程。传统的含载体的药物制剂的冻干效果评估方法主要包括制剂配方的优化、冻干和复溶工艺的优化，再根据复溶后的载体特性、载药量、体外及体内活性，反馈至配方和工艺进行进一步优化。由于每一种药物制剂的可能需要不同的保护剂，且冻干条件和流程中的各因素可能会相互影响，制剂配方和冻干工艺的优化往往费时费力。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡。
7.本发明的另一目的在于，提供上述聚合物囊泡的应用。
8.本发明的目的采用如下技术方案实现：
9.一种能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡，负载有荧光供体及荧光受体，当聚合物囊泡的完整性被破坏时，能够响应荧光信号。
10.所述的聚合物囊泡，由负载了荧光供体的聚合物囊泡和负载了荧光受体的聚合物囊泡组成。
11.上述的聚合物囊泡中，负载了荧光供体的聚合物囊泡和负载了荧光受体的聚合物囊泡可以任意比例混合。
12.所述的负载的方法包括制备囊泡前将荧光供体/受体修饰于嵌段共聚物上、在囊泡制备过程中将荧光供体/受体包载在囊泡疏水层或亲水内腔、在囊泡制备后将荧光供体/受体修饰在前段共聚物上，或导入囊泡疏水层或亲水内腔中的至少一种。
13.所述的荧光供体和荧光受体为分别含不同荧光基团的分子，其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱有明显的重叠，供体的激发波长时对受体无明显影响，供体和受体的发射光谱有一定区分。
14.所述的聚合物囊泡由两亲性嵌段共聚物组装而成。
15.上述快速检测自身完整性的聚合物囊泡在评价冻干制剂和工艺中的应用。
16.一种能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
17.(1)将嵌段共聚物或嵌段共聚物和需负载的疏水分子加入有机溶剂中，溶解制得嵌段共聚物溶液；
18.(2)取一部分嵌段共聚物溶液，加入荧光供体；
19.(3)在剩余的嵌段共聚物溶液中，加入荧光受体；
20.(4)将加入了荧光供体和荧光受体的嵌段共聚物溶液分别处理得到聚合物囊泡，将两者混合即得到能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡。
21.步骤(1)中所述的疏水分子为疏水性小分子药物。
22.步骤(1)中所述的嵌段共聚物为聚乙二醇-聚乳酸(peg-pla)、聚乙二醇-聚己内酯(peg-pcl)、pla-peg-pla、peg-pla-peg、pcl-peg-pcl、 peg-pcl-peg中的至少一种。
23.所述的嵌段共聚物中聚乙二醇的分子量为1000～5000，聚乳酸和聚己内酯的分子量为3000～20000。
24.所述疏水性小分子药物优选为紫杉醇(ptx)或阿霉素(dox)。
25.步骤(1)中所述的有机溶剂优选为四氢呋喃(thf)。
26.步骤(1)中所述的嵌段共聚物与有机溶剂的配比优选为2～15mg:1ml。
27.步骤(1)中所述的溶解的方法为搅拌或超声震荡中的至少一种。
28.上述搅拌的条件为100～500r/min，15～30min。
29.步骤(2)中所述的荧光供体为疏水性荧光染料供体。
30.所述疏水性荧光供体优选为dio染料或香豆素6染料中的至少一种。
31.步骤(3)中所述的荧光受体为疏水性荧光染料受体。
32.所述疏水性荧光受体优选为dii染料或尼罗红染料中的至少一种。
33.步骤(4)中所述的处理的方法为注入水中搅拌或吹干得到薄膜后溶于水搅拌中的至少一种。
34.步骤(4)中所述的混合的为按加入了荧光供体的聚合物囊泡与加入了荧光受体的聚合物囊泡的质量比1～3:1～3的比例混合；优选为按质量比1:1的比例混合。
35.一种评价冻干制剂和工艺的方法，包括如下步骤：
36.(1)将上述快速检测自身完整性的聚合物囊泡进行冻干和存储；
37.(2)将冻干和存储后的聚合物囊泡复溶，使用荧光分析设备检测其fret 荧光强度，根据fret值判断聚合物囊泡的完整性。
38.所述的冻干的方法包括预冻、升华干燥和解析干燥中的至少一种。
39.所述的存储的方法包括常温、低温和超低温存储中的至少一种。
40.所述的复溶的方法包括加水后振荡、搅拌、超声中的至少一种。
41.所述的荧光分析设备包括荧光分光光度计和高通量荧光分析设备中的至少一种。
42.所述的fret值越低，证明复溶后的聚合物囊泡的完整性越好。
43.一种评估方法，是通过上述评价冻干制剂和工艺的方法获取冻干工艺优化效果的方法。
44.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
45.本发明提供了一种能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡及其应用。首先分开制备负载荧光供体和荧光受体的聚合物囊泡，再将其混合后，进行冻干保存和复溶，并检测复溶后溶液中的由于荧光能量共振转移(fret)产生的荧光强度，从而实现高通量、便捷地对药物、疫苗配方和冻干复溶工艺进行筛选，大大提升优化的效率。
附图说明
46.图1是本发明制备的快速检测自身完整性的聚合物囊泡的原理图。
47.图2是传统的聚合物囊泡冻干制剂和工艺的优化方法以及本发明提供的评价冻干制剂和工艺的方法的流程图。
48.图3是实施例1中混合聚合物囊泡的透射电镜结果图。
49.图4是混合聚合物囊泡荧光光谱示意图。
50.图5是冻干复溶后，保存效果良好和效果不佳的fret光谱示意图。
51.图6是实施例6冻干超声复溶后，囊泡发生破坏和融合的透射电镜结果图。
具体实施方式
52.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
53.下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
54.实施例1
55.称取10mg嵌段共聚物peg
2000-pcl
5000
，加入到1ml的dcm(二氯甲烷) 中，搅拌15分钟制得10mg/ml的嵌段共聚物溶液。加入20μl 1mg/ml的dio 染料(供体)dmso溶液。将溶液通过旋蒸除去dcm，得到透明薄膜。然后加入10ml去离子水，室温下搅拌12h即制得负载供体的聚合物囊泡。
56.称取10mg嵌段共聚物peg
2000-pcl
5000
，加入到1ml的dcm中，搅拌15 分钟制得10mg/ml的嵌段共聚物溶液。加入20μl 1mg/ml的dii染料(受体) dmso溶液。将溶液通过旋蒸除去dcm，得到透明薄膜。然后加入10ml去离子水，室温下搅拌12h即制得负载受体的聚合物囊泡。
57.将两种聚合物囊泡溶液以1：1质量比的形式进行混合，即得到混合聚合物囊泡。用
本方法制备的混合囊泡平均粒径为120nm，粒径分布(pdi)为0.20。
58.实施例2
59.本实施例使用两种不同聚合度的嵌段共聚物制备聚合物囊泡，称取2mg嵌段共聚物peg
2000-pla
15000
加入到200μl的thf中，超声震荡溶解获得嵌段共聚物溶液。加入20μl 1mg/ml的香豆素6染料(供体)thf溶液。将嵌段共聚物溶液注入1ml去离子水中，并快速搅拌，即制得负载供体的聚合物囊泡，通过透析除去多余的有机溶剂。
60.称取2mg嵌段共聚物peg
2000-pcl
5000
，加入到200μl的thf中，超声震荡溶解获得嵌段共聚物溶液。加入20μl 1mg/ml的尼罗红染料(受体)thf 溶液。将嵌段共聚物溶液注入1ml去离子水中，并快速搅拌，即制得负载供体的聚合物囊泡，通过透析除去多余的有机溶剂。
61.将两种聚合物囊泡溶液以1：1质量比的形式进行混合。用本方法制备的混合囊泡平均粒径为180nm，粒径分布(pdi)为0.15。
62.实施例3
63.本实施例使用两种不同聚合度的嵌段共聚物制备聚合物囊泡，称取2mg嵌段共聚物peg
2000-pcl
5000
，加入到200μl的thf中，超声震荡溶解获得嵌段共聚物溶液。加入20μl 1mg/ml的香豆素6染料(供体)thf溶液。将嵌段共聚物溶液注入1ml去离子水中，并快速搅拌，即制得负载供体的聚合物囊泡，通过透析除去多余的有机溶剂。
64.称取2mg嵌段共聚物peg
2000-pla
15000
，加入到200μl的thf中，超声震荡溶解获得嵌段共聚物溶液。加入20μl 1mg/ml的尼罗红染料(受体)thf 溶液。将嵌段共聚物溶液注入1ml去离子水中，并快速搅拌，即制得负载供体的聚合物囊泡，通过透析除去多余的有机溶剂。
65.将两种聚合物囊泡溶液以1：1的形式进行混合。用本方法制备的混合囊泡平均粒径为150nm，粒径分布(pdi)为0.20。
66.实施例4验证聚合物囊泡在不同冻干温度下的稳定性
67.取1ml实施例1制备的混合聚合物囊泡溶液3份装于西林瓶中，分别采用不同的预冷方式进行冻干保存：液氮(-196℃)、-20℃、-80℃。将西林瓶放置于液氮(-196℃)、-20℃及-80℃中，待囊泡溶液彻底冻结后取出。将西林瓶放置于真空干燥机中，在-50℃进行真空干燥12h，即获得冻干样品。将冻干样品置于4度冰箱内储存1周。取冻干保存处理后的样品，各加1ml水手动摇匀2 分钟进行复溶。
68.冻干复溶后的聚合物囊泡使用荧光分光光度计对其fret荧光强度进行检测，激发波长为483纳米，检测波长为565纳米。经检测，使用液氮、-20℃及
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80℃预冷的混合聚合物囊泡溶液在565纳米的相对荧光强度为1.0：2.2：1.8。同时，使用动态激光散射进行粒径分析，结果显示，使用液氮、-20℃及-80℃预冷的混合聚合物囊泡溶液的囊泡平均粒径分别约为130nm，180nm，160nm。可见，使用液氮预冷对peg
2000-pcl
5000
聚合物囊泡冻干保存，复溶后发生团聚和崩溃的颗粒数量少，稳定性优于-20℃及-80℃预冷，荧光分析的结果与粒径分析结果一致，使用荧光检测可以快速检测复溶后的聚合物囊泡的完整性，无需复杂的粒径测试。
69.实施例5验证聚合物囊泡经不同冻干稳定剂处理后的稳定性
70.取1ml实施例2制备的混合聚合物囊泡溶液6份装于西林瓶中，加入5％重量比的不同冻干保护剂，评估其对冻干复溶效果的影响。加入的冻干保护剂包括：蔗糖、葡萄糖、海藻
糖、菊粉、羟丙基-β-环糊精以及甘露醇。冻干条件统一使用液氮进行预冷，待囊泡溶液彻底冻结后取出。将西林瓶放置于真空干燥机中，在-50℃进行真空干燥12h，即获得冻干样品，将冻干样品置于4度冰箱内储存1周。复溶条件统一使用加水手动摇匀2分钟。
71.冻干复溶后的聚合物囊泡使用酶标仪对其fret荧光强度进行检测，激发波长为450纳米，检测波长为620纳米。结果显示，加入蔗糖、葡萄糖、海藻糖、菊粉、羟丙基-β-环糊精以及甘露醇的冻干复溶溶液在620纳米的相对荧光光强比值为3.2：3.3：3.0：2.5：1.0：3.7。使用动态激光散射进行粒径分析，结果显示，除羟丙基-β-环糊精保护的聚合物囊泡的粒径几乎不变外，其余囊泡的平均尺寸增大20～100nm不等，实验结果证明，证明羟丙基-β-环糊精处理后的聚合物囊泡发生团聚和崩溃的颗粒数量少，完整性较其他几种冻干稳定剂更好，从而快速筛选出羟丙基-β-环糊精为上述冻干复溶条件下，保护效果更优的冻干保护剂，且粒径测试结果与fret荧光数据相吻合，证明荧光检测可以快速检测复溶后的聚合物囊泡的完整性。
72.实施例6验证聚合物囊泡经不同复溶方法处理后的稳定性
73.取1ml实施例3制备的混合聚合物囊泡溶液6份装于西林瓶中，加入5％甘露醇和5％蔗糖。冻干条件统一使用液氮进行预冷，待囊泡溶液彻底冻结后取出，在-50℃进行低压真空除水12h，将冻干样品置于4度冰箱内储存1周。使用三种不同的复溶条件：用加水手动摇匀2分钟、超声2分钟、涡旋2分钟。
74.冻干复溶后的聚合物囊泡使用荧光分光光度计对其fret荧光强度进行检测，激发波长为450纳米，检测波长为620纳米。结果显示，手动摇匀、超声、涡旋的冻干复溶溶液在620纳米的荧光光强比值为1.0：2.3：1.0。使用透射电镜对超声复溶后的囊泡进行拍摄(图6)，发现有很大程度的囊泡破坏和融合现象。实验结果证明，超声复溶会破坏囊泡结构，复溶后的聚合物囊泡完整性较差，不适宜用于复溶过程；tem结果证明与fret分析的结果相符，证明本发明所制备的能够快速检测自身完整性的聚合物囊泡通过结合fret荧光分析和酶标仪等高通量荧光分析设备，能够高通量快速检测聚合物囊泡的完整性，无需使用粒径测试、电镜等相对复杂的实验手段，从而实现高通量、便捷地对药物、疫苗的配方/制备工艺和冻干复溶工艺进行筛选，大大提升优化的效率(如图4及图5所示)。
75.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。