一种仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒及其制备方法

1.本发明属于医药制剂领域，涉及仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、制备方法及应用。


背景技术：

2.血清尿酸浓度高于408μmol/l则被定义为高尿酸血症，高尿酸血症不仅可引发痛风性关节炎，还可导致尿酸性肾病和肾结石，被认为是代谢综合征、糖尿病、心血管疾病和慢性肾脏疾病的指标。痛风是一种常见且复杂的炎症性关节炎，由嘌呤代谢和生活方式因素影响导致尿酸单钠晶体在关节周围沉积而引起。尿酸单钠晶体在关节周围的沉积会引起剧烈的疼痛和炎症反应，严重影响人们的正常生活。目前，痛风性关节炎的成功治疗依赖于维持降尿酸治疗来纠正高尿酸血症。尿酸酶是一种能催化体内尿酸转化为可溶性代谢物排出体外，有效降低血液中尿酸水平的治疗性蛋白。以尿酸酶为基础的疗法更是已经被探索为治疗痛风的一种有效的新兴策略。然而由于人类和其他高等灵长类动物中缺乏尿酸酶基因，对于人类而言尿酸酶是一种外源性酶，在体内具有稳定性差、活性低、半衰期短和免疫原性高等缺点限制了尿酸酶的临床应用。将尿酸酶制备的不同递送系统，克服其缺点使其更好满足临床需是目前研究的热点之一。
3.由于单一疗法存在局限性，联合疗法已成为高尿酸血症和痛风性关节炎治疗的新趋势，并已有研究证实了联合疗法治疗高尿酸血症和痛风性关节炎的优势。尿酸酶在催化尿酸降解的过程产生的过氧化氢大量积聚存在毒性会对dna造成损伤，同时高浓度的过氧化氢会减缓尿酸降解反应的速度，影响尿酸酶的治疗效果。过氧化氢酶能有效催化过氧化氢分解产生无毒的氧气和水，同时也能加快尿酸降解反应的速率。过氧化氢酶催化过氧化氢降解的反应可与尿酸酶催化尿酸酶降解的反应一起形成级联反应，更加安全高效的发挥对高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗效果。聚多巴胺纳米粒是一种既具有近红外响应又具有抗炎活性的光敏剂，在药物递送、分子成像和癌症治疗方面广泛应用。聚多巴胺纳米粒具有粘附性可积聚在关节部位且其本身具有一定的抗炎活性，并在近红外光照射下自发温和升温在炎症部位通过光热疗法发挥抗炎效果。故当尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒同时包裹于纳米粒中应用时，这种复合酶疗法联合光热疗法可更好的发挥对高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗效果。透明质酸和环糊精聚合物作为载体材料递送蛋白类药物和小分子药物，其具有生物相容性好、水溶性高，靶向性和长循环的特点。红细胞膜和血小板均从血液中提取，均来自体内，均可作为药物载体使用，其细胞膜均含多种膜蛋白，可逃避单核吞噬细胞系统的清除，从而延长血液循环时间。血小板具有炎症靶向性，红细胞膜和血小板的仿生融合膜可提高药物在炎症部位的蓄积量。因此，红细胞膜和血小板的仿生融合膜能比红细胞膜或血小板更好的发挥作用。具有红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹的纳米粒可望使得到的纳米粒既有纳米载体特性，又具有红细胞膜和血小板的仿生融合膜的生物特性，可更好地提高药物的稳定性，增加药物在炎症部位的蓄积，提升药物的疗效并降低毒副
作用。
4.经查询专利及文献，目前尚无血小板或红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹双酶类纳米药物的任何研究报道，尚无红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的任何研究报道，尚无红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹聚多巴胺纳米粒的任何研究报道，尚无红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒的任何研究报道。本发明制备得到的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒可以增加尿酸酶的稳定性，提高尿酸酶抵抗较宽范围温度和ph的能力，使尿酸酶在生理条件下更好的发挥降尿酸作用从而提高其治疗效果；纳米粒可以增加过氧化氢酶的稳定性，使过氧化氢酶将尿酸酶催化尿酸降解产生的有毒过氧化氢分解为氧分子和水，从而减少有毒物质的积聚，加快尿酸酶催化尿酸降解的速率，达到安全高效的治疗高尿酸血症和痛风性关节炎的目的。同时，通过红细胞膜和血小板的仿生融合膜的免疫逃避能力、长循环能力以及血小板的炎症靶向能力使纳米制剂靶向炎症部位并在炎症部位蓄积，聚多巴胺纳米粒既是具光热转换效果又具抗炎活性，故在外源近红外激光照射下使聚多巴胺纳米粒温和升温发挥抗炎作用，同时自身也可在炎症部位积聚发挥抗炎作用，减少炎症反应，从而提高其对高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗效果。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒及其制备方法。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒克服了尿酸酶稳定性差、生物利用度低、免疫原性高、靶向性较差等缺点，并通过血小板表面的内源性生物大分子在体内对炎症部位释放的趋化因子、信号分子的主动识别作用，使纳米粒靶向至炎症部位并在此蓄积，同时结合聚多巴胺纳米粒的光热作用，协同发挥对高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗作用。本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒制备工艺简单，成本较低，易于控制，易于工业化生产。本研究为尿酸酶提供了可供选择的新型制剂，可用于高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗。
6.本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒，其特征在于，包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层，所述的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺30-270份，氢氧化钠5-45份，超纯水1为15000-135000份，超纯水2为300-1000份，所述的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和环糊精聚合物，透明质酸和环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸90-500份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐100-600份，环糊精50-300份，无水甲酰胺1为3000-18000份，无水甲酰胺2为3000-18000份，所述的环糊精包括：羟丙基-α-环糊精、磺丁基-α-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、磺丁基-γ-环糊精的一种，制剂中尿酸酶含量为0.1-10u/ml，过氧化氢酶含量为10-1000u/ml，缓冲液1和缓冲液2在同一配方中类型相同，且浓度相等，均为50-160mm，缓冲液1和缓冲液2的ph相同，均为8.0-9.5，制剂中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒2-16份，透明质酸和环糊精聚合物25-250份，磷脂30-600份，胆固醇10-150份，缓冲液1为2500-20000份，缓冲液2为2500-20000份，所述的缓冲液1和缓冲液2，在同一配方中类型相同，包括硼酸-硼酸缓冲液、碳酸
钠-碳酸氢钠缓冲液、n，n-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的一种。本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒，制备方法包括如下步骤：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将处方量的盐酸多巴胺分散于处方量超纯水1中，得到液体a；处方量的氢氧化钠溶于处方量超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，20-30℃范围是搅拌使其自聚合1-4小时，10000-15000转/分离心15-30分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤3-5次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和环糊精聚合物的制备方法：将处方量的透明质酸和处方量1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于处方量无水甲酰胺1中，冰浴搅拌1-4小时，得到液体c，将处方量环糊精溶解于处方量无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌36-72小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析36-72小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒溶解于处方量缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取处方量的磷脂和胆固醇，溶解于二氯甲烷、三氯甲烷、无水乙醇、甲醇、乙醚中的一种或多种有机溶剂中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，20-30℃振荡水化1-2.5小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和环糊精聚合物溶解于处方量的缓冲液2中，超声8-15分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌1-3小时，分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取全血，按照1ml全血加入0.5mg肝素钠混匀后得到肝素抗凝全血，取抗凝全血，静置，离心5-15分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3-8次至上层液体澄清后，加入低渗生理盐水(将0.9％生理盐水用超纯水稀释4倍得到低渗生理盐水)使红细胞裂解，裂解后，离心5-15分钟，除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3-8次至上层液体澄清后，除去上清液，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取3-10ml稀释后的全血平铺到5-20ml试剂盒中的分离液液面上方，200-250g离心15-25分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入5-15ml试剂盒中的细胞洗涤液，500-600g离心20-30分钟，弃上清液，沉淀用5-15ml的细胞洗涤液重悬血小板，500-600g离心20-30分钟，弃上清液，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻30-90分钟后取出，20-30℃放置30-60分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程3-5次后，低温离心5-10分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤3-6次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比1:2至2:1混合后，冰浴超声10-20分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比1:2至2:1混合均匀，冰浴超声10-20分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0007]
本发明提供的透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物被成功合成，透明质酸与羟丙基-β-环糊精连接后生成的酯键可在1704cm-1
处观察到(图1)，本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒平均粒径小于200nm(图2)。本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒提高了尿酸酶对炎症部位的靶向能力。细胞膜对纳米粒进行伪
装，能够使纳米粒具有生物膜的表面特征蛋白和特殊功能。本发明制备的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒与红细胞膜、红细胞膜和血小板的仿生融合膜的聚丙酰胺凝胶电泳(sds-page)结果相比较，均有红细胞膜的特征蛋白cd47(50kda)；本发明制备的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒与血小板、红细胞膜和血小板的仿生融合膜的聚丙酰胺凝胶电泳(sds-page)结果相比较，均显示有血小板的特征蛋白cd47(50kda)、cd62p(90kda)、cd61(110kda)(图3)。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒具有炎症靶向性的原因分析如下：(1)血小板通过分泌细胞因子、趋化因子，靶向到炎症部位，在炎症因子的作用下，血小板可聚集在炎症部位并且同时发挥靶向作用；(2)仿生融合膜包裹的纳米粒继承了生物膜的表面特异蛋白，使红细胞膜和血小板仿生融合膜的免疫逃避属性、长循环能力和血小板的炎症靶向特性在纳米粒中得到保留，提高了药物对炎症部位的靶向能力。
[0008]
本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒提高了尿酸酶的稳定性，增强了其抵抗较宽范围温度和ph的能力(图4a,4b)。在温度稳定性实验中，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性在任何温度下都高于游离的尿酸酶。在温度20-70℃范围内，37℃时尿酸酶活性最高，70℃时活性最低。在37℃时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性约为相同温度下游离尿酸酶活性的1.31倍；在70℃时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性约为相同温度下游离尿酸酶活性的1.23倍。这说明尿酸酶的最适温度为37℃，且在高温环境下不耐受，在高温环境中活性显著降低。ph稳定性实验中，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性在任何ph时都高于游离的尿酸酶。在ph 6.5-9.5范围中，ph 9.0时尿酸酶活性最高，ph 6.5时活性最低。在ph 9.0时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性约为相同ph时游离尿酸酶活性的1.52倍；在ph 6.5时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性约为相同ph时游离尿酸酶活性的1.21倍。这说明尿酸酶的最适ph为9.0并且不耐酸性环境，在酸性环境中活性明显降低。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒增强尿酸酶抵抗较宽范围ph和温度的能力的原因可能有：(1)透明质酸和环糊精聚合物修饰的脂质纳米粒其分子层结构对酶起保护作用，使蛋白酶处在更佳条件的空间中从而更好地维持自身活性，抵抗不利的酸性环境和高温环境；(2)仿生融合膜包裹纳米粒形成一个相对隔离的空间，从而保护蛋白酶不受体生理环境中多种代谢酶的干扰，提高药物在体内的稳定性。
[0009]
本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒对巨噬细胞的细胞毒性均较小，在高浓度下细胞存活率也在85％以上(图5)。在5分钟808nm近红外激光(功率为1.5w/cm2)照射下，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒可使巨噬细胞细胞活力一定程度下降，并呈浓度依赖性，但即使是浓度最高时其相对细胞活力也有82％。说明无论激光照射与否，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒均对巨噬细胞造成的细胞毒性较小，其具有较好的细胞生物安全性。
[0010]
本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒可以降低尿酸酶在尿酸存在下产生的过氧化氢的细胞毒性(图6)。在尿酸存在下，游离尿酸酶的相对细胞活力为45％，而仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的相对细胞活力为94％。究其原因，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶与过氧化氢酶的共同包裹，可形成明显的级联反应，尿酸酶催化尿酸降解产生的有毒产物过氧化氢，可被过氧化氢酶快速分解成
氧气等，过氧化氢的分解同时也可加快尿酸酶催化尿酸降解的反应过程。
[0011]
本发明提高的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒明显提高了尿酸酶在体内血清尿酸酶活性-时间曲线下面积、延长了尿酸酶在体内的半衰期和平均滞留时间(图7)。给药2小时后，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶活性最高为94.96％，是游离尿酸酶活性的3.14倍，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒在大鼠体内的血清尿酸酶活性-时间曲线下面积、半衰期和平均滞留时间分别是游离尿酸酶的5.15倍、4.83倍和4.74倍。结果表明，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒显著提高了尿酸酶的生物利用度，延长了药物在体内的循环时间。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒使尿酸酶生物利用度明显提高的原因可能包括：(1)仿生融合膜与纳米粒的双重保护作用使得尿酸酶免受蛋白酶水解和吞噬细胞的清除；(2)仿生融合膜的免疫逃避属性使纳米粒逃避单核吞噬细胞系统的清除，从而延长了血液循环时间，提高药物在体内的稳定性；(3)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒改善了尿酸酶的体内行为，提高其生物利用度。
[0012]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒能快速降低高尿酸血症大鼠血清尿酸水平(图8)。在4小时，模型组大鼠血清尿酸水平最高，此时仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组大鼠血清尿酸水平仅为模型组大鼠血清尿酸水平的23％，而尿酸酶组大鼠血清尿酸水平为模型组大鼠血清尿酸水平的47％；在10小时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组大鼠血清尿酸水平降至与正常组大鼠血清尿酸水平一致，而尿酸酶组大鼠血清尿酸水平与模型组相当，尿酸酶组大鼠血清尿酸水平是仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组大鼠血清尿酸水平的2.4倍。结果表明，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒具有比游离尿酸酶更快的降尿酸效果，能提高尿酸酶在体内的降尿酸效果，更快更好的发挥对高尿酸血症的治疗作用。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒对高尿酸血症大鼠具有更好降尿酸效果的可能原因包括：(1)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶与过氧化氢酶形成级联反应，过氧化氢酶催化过氧化氢降解的同时加快了尿酸酶催化尿酸降解的过程；(2)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒提高了尿酸酶在体内的稳定性，使尿酸酶在体内保持较高的活性更好的发挥降尿酸效果。
[0013]
本发明提供的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒联合光热疗法对痛风性关节炎大鼠治疗效果最佳(图9)。在48小时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒+光照组大鼠脚踝肿胀仅为0.03mm，基本恢复正常，而此时仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组、游离尿酸酶组、模型组大鼠脚踝肿胀分别为0.66mm、1.29mm、1.53mm，均未恢复正常且存在不同程度肿胀，在72小时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组脚踝基本恢复正常，而游离尿酸酶组和模型组未完全恢复。结果表明，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒联合光热疗法可以更好的发挥抗炎作用，更有利于改善痛风性关节炎大鼠脚踝的肿胀情况，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒能提高尿酸酶对痛风性关节炎大鼠的治疗效果。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒+光照组对痛风性关节炎大鼠疗效最佳的可能原因包括：(1)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中含有聚多巴胺纳米粒，在激光照射下，聚多巴胺纳米粒温和升温有利于减轻炎症反应，改善脚踝的红肿程度；(2)聚多巴胺纳米粒本身具有抗炎活性，踝关节注射给药后可在关节处发挥抗炎作用；(3)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒相较于游离酶在体内具有更高
的稳定性，使尿酸酶在体内较长时间维持较高活性。
[0014]
本发明的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒递送系统，具有稳定性好、免疫原性低和生物相容性好的特点，为高尿酸血症和痛风性关节炎治疗中的大分子治疗药物递送提供了一种有效手段。所述仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒，其中红细胞膜和血小板的仿生融合膜能延长药物在体内的循环半衰期，增强药物在体内的稳定性，降低免疫系统对药物的免疫活性，提高药物的生物相容性。除此以外，血小板对炎症部位还具有靶向性，能增加炎症部位纳米药物、光热剂蓄积，协同光热疗法，使尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒对高尿酸血症和痛风性关节炎等疾病治疗效果增强。
[0015]
本发明不同于通常研究报道的含有尿酸酶或过氧化氢酶或聚多巴胺纳米粒中的一种或多种药物的纳米粒递送载体和制备工艺。尿酸酶或过氧化氢酶的递送载体研究报道的有：常规脂质体、聚合物囊泡、无机纳米粒、金属有机框架、纳米胶束、纳米胶囊和微针等。本发明中的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒是一种新型制剂。目前有个别红细胞血小板融合膜载带小分子药物或未载带药物的报道，如红细胞血小板融合膜包裹替扎拉明或红细胞血小板融合膜包裹聚吡咯纳米粒；目前尚无红细胞膜和血小板的仿生融合膜仿生制剂载带大分子药物的研究，尚未见红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。本发明首次将尿酸酶和过氧化氢酶包载于透明质酸和环糊精聚合物修饰的脂质纳米粒中，再在外层包裹红细胞膜和血小板的仿生融合膜，形成具有良好光热转换能力、生物相容性、逃避免疫反应能力和炎症靶向能力的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。该纳米粒可以增加尿酸酶的稳定性，提高尿酸酶抵抗较宽范围温度和ph的能力，提高尿酸酶的生物利用度且具有较好的细胞生物相容性并通过血小板的主动募集将治疗酶、光敏剂蓄积于炎症部位，协同光热疗法，同时通过过氧化氢酶催化过氧化氢降解加快尿酸降解速率，提高药物对高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗效果。
附图说明
[0016]
图1为本发明制得的透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物的红外光谱图。
[0017]
试验条件：采用傅里叶变换红外光谱仪测定透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物的红外光谱。
[0018]
结果显示：图中1704cm-1
处峰的出现，可证明透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物合成成功。透明质酸显示在1616cm-1
处的c＝o拉伸，其对应于羧基，1042cm-1
处的c-oh基团和1155cm-1
处的c-o-c基团。羟丙基-β-环糊精和透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物均显示羟丙基-β-环糊精的特征峰在948cm-1
和1150cm-1
附近。透明质酸与羟丙基-β-环糊精连接后生成的酯键可在1704cm-1
处观察到。
[0019]
图2为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的粒径。
[0020]
试验条件：采用马尔文激光粒度仪测定仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的粒径。
[0021]
结果显示：仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒粒径为(167.03
±
1.42)nm，pdi为0.15
±
0.02。
[0022]
图3为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜、血小板、红细胞膜和血小板的仿生融合膜的表面膜蛋白表征。
[0023]
试验条件：取红细胞膜、血小板、红细胞膜和血小板的仿生融合膜、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒，分别按4:1与蛋白上样缓冲液混合，100℃高温下加热10分钟使蛋白变性，作为电泳上样液品。配制8％分离胶和5％浓缩胶后进行蛋白上样。浓缩胶控制电压80伏，浓缩胶走过后电压调为120伏跑至样品的溴酚蓝条带走至近低端1厘米时，取下胶板，用考马斯亮蓝快速染色液染色30分钟后，用纯水反复洗涤至凝胶背景清晰，在凝胶成像系统下拍照。
[0024]
结果显示：仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜、红细胞膜和血小板的仿生融合膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)结果相比较，均存在红细胞膜的特征蛋白cd47(50kda)，说明红细胞膜提取后其蛋白结构没有被破坏，进而表明红细胞膜的生理功能不受影响；本发明制备的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒与血小板、红细胞膜和血小板的仿生融合膜的sds-page结果相比较，血小板上的特征蛋白cd47(50kda)、cd62p(90kda)、cd61(110kda)在仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的蛋白条带上均有显示，说明血小板提取后其膜蛋白结构依然完整，其生理功能不受影响。
[0025]
图4为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒具有抵抗较宽范围温度和酸碱度影响的能力。
[0026]
试验条件：将尿酸溶液分别放置在20、30、37、40、50、60、70℃水浴锅中孵育，取游离尿酸酶、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒测定其在不同温度尿酸溶液中尿酸酶的活性。37℃时游离尿酸酶的活性被定为100％，计算不同温度下游离酶在37℃的相对活性；将ph 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的尿酸溶液于37℃水浴中孵育，分别向不同ph的尿酸溶液中加入尿酸酶、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒后，测定溶液中尿酸酶的活性。ph 9.0时的游离尿酸酶活性被定义为100％，计算不同ph时游离酶在ph 9.0的相对活性。a图为温度稳定性实验结果；b图为ph稳定性实验结果。
[0027]
结果显示：仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的最适温度为37℃，在37℃时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性约为游离尿酸酶的1.31倍，高于37℃，随着温度升高尿酸酶活性下降，且仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性始终高于游离尿酸酶；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的最适ph为9.0，在ph 9.0时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶的活性约为游离尿酸酶的1.52倍，且在酸性环境中尿酸酶活性最低。以上结果说明仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒增强了尿酸酶抵抗较宽范围温度和ph的能力。
[0028]
图5为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的体外细胞毒性。
[0029]
试验条件：取对数生长期的巨噬细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板，在含有10％胎牛血清的dmem培养基中孵育24小时，弃去培养液，将尿酸酶、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒分别加入96孔板内孵育6小时后，对其中一部分仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒在808nm波长下，给予近红外激光照射，每孔照射时间为5分钟，继续孵育至24小时，用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(mtt)测定法检测细胞活力。
[0030]
结果显示：给药后尿酸酶组、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒+光照组的细胞存活率均在85％以上，且仿生融合
膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒+光照组的细胞存活率与浓度呈正相关，说明无论激光照射与否，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒均对巨噬细胞具有较好的细胞生物安全性。
[0031]
图6为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的体外过氧化氢毒性。
[0032]
试验条件：取对数生长期的nci-h1688细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板，在含有10％胎牛血清的rpmi 1640培养基中孵育24小时，弃去培养液，将分别将含有仅含尿酸酶200nm的游离尿酸酶、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和含有尿酸酶200nm和尿酸1mm的游离尿酸酶、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒分别加入96孔板内孵育12h后，用mtt测定法检测细胞活力。
[0033]
结果显示：给药后在不存在尿酸的情况下，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组与游离尿酸酶组的相对细胞活力均在90％以上，在尿酸存在的情况下，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组的相对细胞活力明显高于游离尿酸酶组，说明尿酸酶催化尿酸降解产生的过氧化氢具有明显细胞毒性，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中的过氧化氢酶能有效催化过氧化氢降解，降低过氧化氢的细胞毒性，能显著提高仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的生物安全性。
[0034]
图7为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒血清尿酸酶活性-时间曲线图。
[0035]
试验条件：12只sd雄性大鼠(在给药前禁食12小时，但不禁水)，随机分为2组，每组6只，分别尾静脉注射尿酸酶、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒，给药剂量以尿酸酶计算是相同的。给药后定时采血，进行药代动力学研究。
[0036]
结果显示：给药后仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的尿酸酶活性始终高于游离尿酸酶，在给药2小时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶活性最高为94.96％，是游离尿酸酶活性的3.14倍；同时仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒在大鼠体内的血清尿酸酶活性-时间曲线下面积、半衰期和平均滞留时间也明显高于游离尿酸酶，其中血清尿酸酶活性-时间曲线下面积为游离酶的5.15倍，半衰期为游离酶的4.83倍，平均滞留时间为游离酶的4.74倍，以上结果说明仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒明显提高尿酸酶的体内循环时间和生物利用度。
[0037]
图8为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒血清尿酸水平图。
[0038]
试验条件：24只sd雄性大鼠随机分为4组，每组6只，分别为正常组、高尿酸血症模型组、尿酸酶组、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组，除正常组外其余各组均按500mg/kg灌胃给予次黄嘌呤混悬液和100mg/kg皮下注射氧嗪酸钾混悬液，建立高尿酸血症大鼠模型，连续6天，第7天治疗组分别尾静脉注射尿酸酶、仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒，给药剂量以尿酸酶计相同。给药后定时采血，用尿酸检测试剂盒检测血清尿酸水平。
[0039]
结果显示：模型组血清尿酸水平显著升高且维持较长时间，表明高尿酸血症模型建立成功，给药后，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组的血清尿酸水平始终低于游离尿酸酶组，在10小时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组的血清尿酸水
平为186.5μmol/l，与正常组血清水平基本一致，而此时游离尿酸酶组的血清尿酸水平为439.7μmol/l，在12小时，游离尿酸酶组的血清尿酸水平基本恢复正常，以上结果表明仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒能提高尿酸酶对的高尿酸血症的治疗效果。(其中
*
p《0.05，
**
p《0.01,
***
p《0.001)
[0040]
图9为本发明制得的仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒脚踝直径变化图。
[0041]
试验条件：25只sd雄性大鼠随机分为5组，每组5只，左腿用脱毛后，用游标卡尺测定脚踝初始直径后，除正常组外，其余各组大鼠左侧踝关节以注射20mg/kg注射尿酸钠混悬液造模，造模30分钟后模型组关节注射生理盐水，其余各组分别关节注射游离尿酸酶和仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒，其中仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒+光照组在给药30分钟后用808nm激光照射5分钟，各组均按时测定脚踝直径。
[0042]
结果显示：模型组大鼠脚踝肿胀始终是最大的，表明痛风性关节炎模型建立成功，在48小时，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒+光照组脚踝肿胀为0.03mm，与正常组基本一致，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒组、游离尿酸酶组、模型组在此时脚踝肿胀分别为0.66mm、1.29mm和1.41mm，以上结果表明仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒联合光热疗法能显著降低炎症反应对痛风性关节炎具有显著的治疗效果，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒能在关节处积聚并发挥作用提高尿酸酶对痛风性关节炎的治疗作用。
具体实施方式
[0043]
为了进一步说明本发明及其优点，给出了下列特定的实施例，应理解这些实施例仅用于具体说明而不是作为本发明范围的限制。
[0044]
实施例1：
[0045]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺30份，氢氧化钠5份，超纯水1为15000份，超纯水2为300份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物，透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸90份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐100份，羟丙基-α-环糊精50份，无水甲酰胺1为3000份，无水甲酰胺2为3000份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为0.1u/ml，过氧化氢酶含量为10u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为硼酸-硼砂缓冲液，且浓度相等，均为50mm，硼酸-硼砂缓冲液的ph为8.0，制剂中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒2份，透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物25份，磷脂30份，胆固醇10份，缓冲液1为2500份，缓冲液2为2500份。
[0046]
(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将30份的盐酸多巴胺分散于15000份超纯水1中，得到液体a；5份氢氧化钠溶于300份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，20℃搅拌使其自聚合1小时，10000转/分离心15分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤3次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物的制备方法：将90份透明质酸和100份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于3000份无水甲
酰胺1中，冰浴搅拌1小时，得到液体c，将50份羟丙基-α-环糊精溶解于3000份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌36小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析36小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量尿酸酶、过氧化氢酶和2份聚多巴胺纳米粒溶解于2500份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取30份磷脂和10份胆固醇，溶解于5ml甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，20℃振荡水化1小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物溶解于2500份缓冲液2中，超声8分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌1小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取全血，按照1ml全血加入0.5mg肝素钠混匀后得到肝素抗凝全血，取抗凝全血，静置，离心5分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3次至上清澄清后，加入将0.9％生理盐水用超纯水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心5分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取3ml稀释后的全血平铺到5ml试剂盒中的分离液液面上方，200g离心15分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入5ml试剂盒中的细胞洗涤液，500g离心20分钟，弃上清，沉淀用5ml的细胞洗涤液重悬血小板，500g离心20分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻30分钟后取出，20℃放置30分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程3次后，低温离心5分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤3次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比1:2混合后，冰浴超声10分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比1:2混合均匀，冰浴超声10分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0047]
实施例2：
[0048]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺42份，氢氧化钠9.6份，超纯水1为27000份，超纯水2为420份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物，透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸144份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐160份，甲基-β-环糊精80份，无水甲酰胺1为5400份，无水甲酰胺2为7850份，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为0.82u/ml，过氧化氢酶含量为802u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，且浓度相等，均为140mm，三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的ph为9.3，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒3.6份，透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物106份，磷脂188份，胆固醇71份，缓冲液1为13483份，缓冲液2为12455份。
[0049]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将42份盐酸多巴胺分散于27000份超
纯水1中，得到液体a；9.6份氢氧化钠溶于420份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，21℃范围是搅拌使其自聚合1.2小时，10500转/分离心16分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤4次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物的制备方法：将144份透明质酸和160份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于5400份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌1.1小时，得到液体c，将80份甲基-β-环糊精溶解于7850份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌38小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析38小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和3.6份聚多巴胺纳米粒溶解于13483份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；取188份磷脂和71份胆固醇，溶解于6ml无水乙醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，21℃振荡水化1.1小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物溶解于12455份缓冲液2中，超声9分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌1.2小时，分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心6分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤4次至上清澄清后，加入将0.9％生理盐水用超纯水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心5分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤4次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取4ml稀释后的全血平铺到6ml试剂盒中的分离液液面上方，210g离心16分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入6ml试剂盒中的细胞洗涤液，510g离心21分钟，弃上清，沉淀用6ml的细胞洗涤液重悬血小板，510g离心21分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻35分钟后取出，21℃放置32分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程4次后，低温离心6分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤4次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比3:2混合后，冰浴超声11分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比3:2混合均匀，冰浴超声11分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0050]
实施例3：
[0051]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺54份，氢氧化钠11.1份，超纯水1为33000份，超纯水2为380份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物，透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸156份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐180份，羟丙基-α-环糊精129份，无水甲酰胺1为7700份，无水甲酰胺2为5500份，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为3.57u/ml，过氧化氢酶含量为664u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为硼酸-硼酸缓冲液缓冲液，且浓度相等，均为110mm，硼酸-硼酸缓冲液的ph为
9.1，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒9.1份，透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物106份，磷脂257份，胆固醇56份，缓冲液1为7142份，缓冲液2为7210份。
[0052]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将54份盐酸多巴胺分散于33000份超纯水1中，得到液体a；11.1份氢氧化钠溶于380份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，22℃范围是搅拌使其自聚合1.4小时，11000转/分离心16分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤5次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物的制备方法：将156份透明质酸和180份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于7700份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌1.4小时，得到液体c，将129份羟丙基-α-环糊精溶解于5500份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌40小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析39小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和9.1份聚多巴胺纳米粒溶解于处7142份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取257份磷脂和56份胆固醇，溶解7ml于三氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，22℃振荡水化1.4小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物溶解于7210份缓冲液2中，超声10分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌1.4小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心7分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤5次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用纯化水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心7分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤4次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取5ml稀释后的全血平铺到7ml试剂盒中的分离液液面上方，215g离心17分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入7ml试剂盒中的细胞洗涤液，520g离心22分钟，弃上清，沉淀用7ml的细胞洗涤液重悬血小板，520g离心22分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻40分钟后取出，22℃放置34分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程5次后，低温离心7分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤6次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比7:6混合后，冰浴超声12分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比7:5混合均匀，冰浴超声12分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0053]
实施例4：
[0054]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺66份，氢氧化钠19.3份，超纯水1为57900份，超纯水2为571份，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物，透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物中各组分质量
份数比为：透明质酸333份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐371份，磺丁基-β-环糊精176份，无水甲酰胺1为12482份，无水甲酰胺2为12482份，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为4.86u/ml，过氧化氢酶含量为382u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，且浓度相等，均为80mm，三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的ph为8.2，制剂中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒5.7份，透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物40份，磷脂102份，胆固醇34份，缓冲液1为3500份，缓冲液2为3800份。
[0055]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将66份盐酸多巴胺分散于57900份超纯水1中，得到液体a；19.3份氢氧化钠溶于571份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，23℃范围是搅拌使其自聚合1.6小时，11500转/分离心18分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤3次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物的制备方法：将333份透明质酸和371份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于12482份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌1.6小时，得到液体c，将176份磺丁基-β-环糊精溶解于12482份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌42小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析42小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和5.7份聚多巴胺纳米粒溶解于3500份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取102份磷脂和34份胆固醇，溶解于19ml甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，23℃振荡水化1.6小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物溶解于3800份缓冲液2中，超声11分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌1.6小时，分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心8分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤6次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心8分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤5次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取6ml稀释后的全血平铺到10ml试剂盒中的分离液液面上方，220g离心18分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入8ml试剂盒中的细胞洗涤液，530g离心23分钟，弃上清，沉淀用8ml的细胞洗涤液重悬血小板，530g离心23分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻45分钟后取出，23℃放置36分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程3次后，低温离心8分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤6次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比4:7混合后，冰浴超声13分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比9:10混合均匀，冰浴超声13分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0056]
实施例5：
[0057]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红
细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺78份，氢氧化钠13.4份，超纯水1为39000份，超纯水2为642份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和羟丙基-γ-环糊精聚合物，透明质酸和羟丙基-γ-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸231份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐150份，羟丙基-γ-环糊精147份，无水甲酰胺1为9428份，无水甲酰胺2为9500份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为2.29u/ml，过氧化氢酶含量为523u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为n，n-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，且浓度相等，均为120mm，n，n-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的ph为9.3，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒7.4份，透明质酸和羟丙基-γ-环糊精聚合物135份，磷脂325份，胆固醇87份，缓冲液1为9242份，缓冲液2为9000份。
[0058]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将78份盐酸多巴胺分散于39000份超纯水1中，得到液体a；13.4份氢氧化钠溶于642份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，24℃范围是搅拌使其自聚合1.8小时，12000转/分离心19分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤4次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和羟丙基-γ-环糊精聚合物的制备方法：将231份透明质酸和150份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于9428份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌3小时，得到液体c，将147份羟丙基-γ-环糊精溶解于9500份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌46小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析46小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和羟丙基-γ-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒溶解于9242份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和7.4份聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取325份磷脂和87份胆固醇，溶解于10ml甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，24℃振荡水化1.8小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和羟丙基-γ-环糊精聚合物溶解于9000份缓冲液2中，超声12分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌1.8小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心9分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤7次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心9分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤7次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取7ml稀释后的全血平铺到13ml试剂盒中的分离液液面上方，220g离心19分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入9ml试剂盒中的细胞洗涤液，550g离心24分钟，弃上清，沉淀用9ml的细胞洗涤液重悬血小板，550g离心24分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻50分钟后取出，24℃放置38分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程4次后，低温离心8分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤6次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比8:7混合后，冰浴超声14分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米
粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比5:4混合均匀，冰浴超声14分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0059]
实施例6：
[0060]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒与红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺90份，氢氧化钠15份，超纯水1为45000份，超纯水2为500份，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物，透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸180份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐200份，羟丙基-β-环糊精100份，无水甲酰胺1为6000份，无水甲酰胺2为6000份，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为1u/ml，过氧化氢酶含量为100u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，且浓度相等，均为100mm，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的ph为9.0，制剂中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒4份，透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物50份，磷脂120份，胆固醇40份，缓冲液1为5000份，缓冲液2为5000份。
[0061]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将90份盐酸多巴胺分散于45000份超纯水1中，得到液体a；15份氢氧化钠溶于500份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，25℃范围是搅拌使其自聚合2小时，12000转/分离心20分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤4次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物的制备方法：将180份透明质酸和处200份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于6000份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌2小时，得到液体c，将100份羟丙基-β-环糊精溶解于6000份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌48小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析48小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和4份聚多巴胺纳米粒溶解于5000份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取120份磷脂和40份胆固醇，溶解于10ml二氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，25℃振荡水化2小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和羟丙基-β-环糊精聚合物溶解于5000份缓冲液2中，超声10分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌2小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心10分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤4次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用纯化水稀释4倍后得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心10分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤4次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取5ml稀释后的全血平铺到10ml试剂盒中的分离液液面上方，220g离心20分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入10ml试剂盒中的细胞洗涤液，560g离心25分钟，弃上清，沉淀用10ml的细胞洗涤液重悬血小板，560g离心25分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻60分钟后取出，25℃放置40分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程4次后，低温离心7分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤4次后，除去上清，收
集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比1:1混合后，冰浴超声15分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比1:1混合均匀，冰浴超声15分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0062]
实施例7：
[0063]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺120份，氢氧化钠36.7份，超纯水1为109000份，超纯水2为855份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物，透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸384份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐428份，甲基-β-环糊精233份，无水甲酰胺1为14556份，无水甲酰胺2为10028份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为7.43u/ml，过氧化氢酶含量为805u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，且浓度相等，均为60mm，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的ph为9.4，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒10.8份，透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物30份，磷脂462份，胆固醇118份，缓冲液1为3000份，缓冲液2为3200份。
[0064]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将120份盐酸多巴胺分散于109000份超纯水1中，得到液体a；36.7氢氧化钠溶于855份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，26℃范围是搅拌使其自聚合2.2小时，12500转/分离心22分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤5次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物的制备方法：将384份透明质酸和428份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于14556份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌2.5小时，得到液体c，将233份甲基-β-环糊精溶解于10028份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌50小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析50小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和10.8份聚多巴胺纳米粒溶解于3000份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取462份磷脂和118份胆固醇，溶解于12ml无水乙醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，26℃振荡水化2.1小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和甲基-β-环糊精聚合物溶解于3200份缓冲液2中，超声11分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌2.2小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心11分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤7次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用纯化水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心11分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤7次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取8ml稀释后的全血平铺到15ml试剂盒中的分离液液面上方，225g离心21分钟，小心吸取最上层，即富含
血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入11ml试剂盒中的细胞洗涤液，565g离心26分钟，弃上清，沉淀用11ml的细胞洗涤液重悬血小板，565g离心26分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻65分钟后取出，20-30℃放置45分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程3次后，低温离心8分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤3次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比5:4混合后，冰浴超声16分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比8:5混合均匀，冰浴超声16分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0065]
实施例8：
[0066]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺150份，氢氧化钠23.4份，超纯水1为70700份，超纯水2为460份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物，透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸126份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐140份，磺丁基-β-环糊精60份，无水甲酰胺1为4200份，无水甲酰胺2为4000份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为6.14u/ml，过氧化氢酶含量为934u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为n，n-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，且浓度相等，均为130mm，n，n-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的ph为8.7，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒12.5份，透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物213份，磷脂393份，胆固醇102份，缓冲液1为15625份，缓冲液2为11000份。
[0067]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将150份盐酸多巴胺分散于70700份超纯水1中，得到液体a；23.4份氢氧化钠溶于460份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，27℃范围是搅拌使其自聚合2.5小时，13000转/分离心24分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤3次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和磺丁基-β-环糊精环糊精聚合物的制备方法：将126份透明质酸和140份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于4200份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌2.6小时，得到液体c，将60份磺丁基-β-环糊精溶解于4000份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌58小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析36小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量尿酸酶、过氧化氢酶和12.5份聚多巴胺纳米粒溶解于15625份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取393份磷脂和102份胆固醇，溶解于14ml乙醚中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，28℃振荡水化2.2小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和磺丁基-β-环糊精聚合物溶解于11000份缓冲液2中，超声12分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌2.4小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心12分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3-8次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用纯化水稀释4倍得到的低
环糊精聚合物溶解于16600份缓冲液2中，超声13分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌2.6小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心13分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用超纯水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心7分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤5次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取9ml稀释后的全血平铺到18ml试剂盒中的分离液液面上方，235g离心23分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入10ml试剂盒中的细胞洗涤液，545g离心27分钟，弃上清，沉淀用10ml的细胞洗涤液重悬血小板，545g离心27分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻70分钟后取出，29℃放置55分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程3次后，低温离心5分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤6次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比6:5混合后，冰浴超声15分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比4:5混合均匀，冰浴超声15分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0071]
实施例10：
[0072]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺210份，氢氧化钠32.1份，超纯水1为96400份，超纯水2为784份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和磺丁基-γ-环糊精聚合物，透明质酸和磺丁基-γ-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸435份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸485份，磺丁基-γ-环糊精204份，无水甲酰胺1为11128份，无水甲酰胺2为15200份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为0.64u/ml，过氧化氢酶含量为406u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，且浓度相等，均为90mm，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的ph为9.2，其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒2.4份，透明质酸和磺丁基-γ-环糊精聚合物35份，磷脂48份，胆固醇16份，缓冲液1为4500份，缓冲液2为4500份。
[0073]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将210份盐酸多巴胺分散于96400份超纯水1中，得到液体a；32.1份氢氧化钠溶于784份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，24℃范围是搅拌使其自聚合3.6小时，14000转/分离心15分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤3次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和磺丁基-γ-环糊精聚合物的制备方法：将435份透明质酸和485份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于11128份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌3.6小时，得到液体c，将204份磺丁基-γ-环糊精溶解于15200无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌68小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析52小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和磺丁基-γ-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和2.4份聚多巴胺纳米粒溶解于4500份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶
和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取48份磷脂和16份胆固醇，溶解于17ml三氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，27℃振荡水化2.1小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和磺丁基-γ-环糊精聚合物溶解于4500份缓冲液2中，超声14分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌2.6小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心6分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤6次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用纯化水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心6分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取4ml稀释后的全血平铺到8ml试剂盒中的分离液液面上方，240g离心21分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入8ml试剂盒中的细胞洗涤液，580g离心23分钟，弃上清，沉淀用8ml的细胞洗涤液重悬血小板，580g离心23分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻78分钟后取出，23℃放置57分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程4次后，低温离心6分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤5次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比3:4至混合后，冰浴超声16分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比4:7混合均匀，冰浴超声16分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0074]
实施例11：
[0075]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺240份，氢氧化钠32.1份，超纯水1为96400份，超纯水2为784份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物，透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸282份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸314份，羟丙基-α-环糊精90份，无水甲酰胺1为4800份，无水甲酰胺2为4700份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为0.46u/ml，过氧化氢酶含量为208u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为硼酸-硼酸缓冲液，且浓度相等，均为70mm，硼酸-硼酸缓冲液的ph为8.3，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒2.8份，透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物45份，磷脂84份，胆固醇28份，缓冲液1为4000份，缓冲液2为3600份。
[0076]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将240份盐酸多巴胺分散于96400份超纯水1中，得到液体a；32.1份氢氧化钠溶于784份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a中，29℃范围是搅拌使其自聚合3.8小时，14500转/分离心28分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤3次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物的制备方法：282份透明质酸和314份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于4800份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌3.8小时，得到液体c，将90份羟丙基-α-环糊精溶解
于4700份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌70小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析70小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和2.8份聚多巴胺纳米粒溶解于4000份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取84份磷脂和28份胆固醇，溶解于18ml乙醚中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，29℃振荡水化2.4小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和羟丙基-α-环糊精聚合物溶解于3600份缓冲液2中，超声8分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌2.8小时，分别通过0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心11分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤3次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用纯化水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心5分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤4次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取7ml稀释后的全血平铺到15ml试剂盒中的分离液液面上方，245g离心15分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入14ml试剂盒中的细胞洗涤液，590g离心20分钟，弃上清，沉淀用12ml的细胞洗涤液重悬血小板，590g离心20分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻80分钟后取出，29℃放置58分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程4次后，低温离心7分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤4次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比2:3混合后，冰浴超声17分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比3:5混合均匀，冰浴超声18分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。
[0077]
实施例12：
[0078]
仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒包括尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和血小板的仿生融合膜包裹层。仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含聚多巴胺纳米粒，聚多巴胺纳米粒中各组分质量份数比为：盐酸多巴胺270份，氢氧化钠45份，超纯水1为13500份，超纯水2为1000份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中包含透明质酸和羟丁基-β-环糊精聚合物，透明质酸和羟丁基-β-环糊精聚合物中各组分质量份数比为：透明质酸540份，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸600份，羟丁基-β-环糊精300份，无水甲酰胺1为18000份，无水甲酰胺2为18000份；仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中尿酸酶含量为10u/ml，过氧化氢酶含量为1000u/ml，缓冲液1和缓冲液2均为三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，且浓度相等，均为160mm，三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的ph为9.5，仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒其余各组分质量份数比为：聚多巴胺纳米粒16份，透明质酸和羟丁基-β-环糊精聚合物250份，磷脂600份，胆固醇501份，缓冲液1为20000份，缓冲液2为20000份。
[0079]
制备方法：(1)聚多巴胺纳米粒的制备方法：将270份盐酸多巴胺分散于13500份超纯水1中，得到液体a；45份氢氧化钠溶于1000份超纯水2中，得到液体b，将液体b加入液体a
中，30℃范围是搅拌使其自聚合4小时，15000转/分离心30分钟，得到黑色沉淀，黑色沉淀用超纯水洗涤5次后，真空干燥，得到聚多巴胺纳米粒；(2)透明质酸和羟丁基-β-环糊精聚合物的制备方法：将540份透明质酸和600份1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐溶于18000份无水甲酰胺1中，冰浴搅拌4小时，得到液体c，将300份羟丁基-β-环糊精溶解于18000份无水甲酰胺2中，得到液体d，缓慢将液体d加入液体c中，冰浴搅拌72小时，得到液体e，将液体e装入透析袋中用超纯水透析72小时后，取出液体e，冷冻干燥，得到透明质酸和羟丁基-β-环糊精聚合物；(3)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和16份聚多巴胺纳米粒溶解于20000份缓冲液1中，得到尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f；称取600份磷脂和501份胆固醇，溶解于20ml无水乙醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜，向脂质薄膜中加入尿酸酶、过氧化氢酶和聚多巴胺纳米粒混合液体f，30℃振荡水化2.5小时，得到液体g；将步骤(2)得到的透明质酸和羟丁基-β-环糊精聚合物溶解于20000份缓冲液2中，超声15分钟后得到液体h，将液体h缓慢滴加入液体g中，搅拌3小时，分别通过0.45μm和0.22μm微孔滤膜过滤，得到尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(4)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血，静置，离心15分钟除去上清液，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤8次至上清澄清后，加入0.9％生理盐水用纯化水稀释4倍得到的低渗生理盐水中使红细胞裂解，裂解后，离心15分钟，除去上清，沉淀用0.9％的生理盐水洗涤8次至上清澄清后，除去上清，收集沉淀，得到红细胞膜；(5)血小板的制备方法：按照外周血血小板提取试剂盒说明书操作，取新鲜全血后，用等体积的试剂盒中的全血稀释液稀释，取10ml稀释后的全血平铺到20ml试剂盒中的分离液液面上方，250g离心25分钟，小心吸取最上层，即富含血小板的血浆层，并向富含血小板的血浆层中加入15ml试剂盒中的细胞洗涤液，600g离心30分钟，弃上清，沉淀用15ml的细胞洗涤液重悬血小板，600g离心30分钟，弃上清，沉淀加入超纯水重悬后于-80℃速冻90分钟后取出，30℃放置60分钟溶解，为冻融操作过程，反复重复冻融操作过程5次后，低温离心10分钟，弃上清，沉淀用超纯水洗涤6次后，除去上清，收集沉淀，得到血小板；(6)仿生融合膜的制备方法：将步骤(4)得到的红细胞膜与步骤(5)得到的血小板以蛋白浓度比2:1混合后，冰浴超声20分钟，得到红细胞和血小板的仿生融合膜；(7)仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将步骤(3)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒和步骤(6)得到的红细胞膜和血小板的仿生融合膜以体积比2:1混合均匀，冰浴超声10-20分钟，得到仿生融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒。