一种氯化矢车菊素的应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种氯化矢车菊素的应用。


背景技术：

2.流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属的单股负链rna病毒，常通过禽类传递到人导致流行性感冒发生。
3.流行性感冒为急性呼吸系统疾病，传播快、传染性强，常导致人和动物高发病率和死亡率。高致病性禽流感可以非常迅速地在禽类之间传播，造成全面感染，病死率高达100％；禽流感不断重组实现跨物种传播，因此近年来禽流感猪流感频发，而对人类社会的伤害更为严重，20世纪以来人类经历四次人流感大流行，流行范围跨越欧、亚、非，造成上千万人死亡。近十余年来，流感爆发频率明显加快，高致病性毒株不断报道，危害巨大。流感对公共卫生和养殖业构成严重威胁，也给社会和国家带来了巨大的经济损失。
4.目前有效针对流感病毒的治疗方案是疫苗和化学药物治疗。疫苗是最有效针对病毒的方法之一，但是流感病毒变异性强、亚型多、宿主广，常常流行迅速，而疫苗的研发和作用周期较长，所以并不能及时的产生作用，因此一些有效针对病毒以及病毒引起的相关疾病的药物研发就显得尤为重要。目前常见化学药物主要是神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦、利巴韦林等)、离子通道抑制剂(如金刚烷类)和rna聚合酶抑制剂(如巴洛沙韦)。神经氨酸酶抑制剂为临床常用抗流感药物，但药物种类单一，陆续出现不同程度的耐药毒株；而其他种类药物自身也存在毒性或为应用受限。所以对其他种类抗流感药物的研发迫在眉睫。
5.氯化矢车菊素是花青素的一种单体形式，花青素具有较强的抗氧化性，能清除体内的氧自由基，起到保护作用，现已广泛应用于食品、化妆品、保健品等产品。而且在黑米、桑葚、黑豆等多种有色植物中均含有，来源充足，易于生产；花青素为天然食物源性，几乎无毒。如果能开发氯化矢车菊素应用于抗流感药物的生产，将具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，解决现有抗流感药物存在的药物种类单一、易产生耐药性、有一定毒性或其他应用限制等问题，提供氯化矢车菊素的新用途，针对a型流感病毒在如下(1)-(4)中至少一种的应用：
7.(1)抗流感病毒药物或相关产品；
8.(2)抑制流感病毒核酸或蛋白成分复制或表达合成的产品；
9.(3)抗流感病毒引起的相关疾病的药物或相关产品；
10.(4)抗炎症的药物或相关产品。
11.采用如下技术方案：
12.一种氯化矢车菊素的应用，氯化矢车菊素在制备抗流感病毒制剂中的应用。
13.流感常引起肺部炎症为主的一系列炎症反应，所以从临床症状入手，抑制炎症反应，从而达到治疗流感肺炎的目的。而中医自古以来就有许多使用中药清热解毒的治疗方
法，所以从能够抗炎抗氧化的植物成分入手，筛选出其中的活性成分，并进行细胞和病毒相关试验，发现单体化合物氯化矢车菊素具有抗流感病毒的功能，比同类的化合物矢车菊素-3-o-葡萄糖苷具有更好的效果，且能够抑制炎症反应。
14.优选的，所述流感病毒包括a型流感病毒。
15.优选的，所述a型流感病毒包括流感病毒毒株a/pr8/34。
16.一种含有氯化矢车菊素的抗流感病毒制剂。
17.优选的，包括治疗或预防流感的药物。
18.优选的，包括缓解或消除流感病毒引起的炎症反应的制剂。
19.优选的，包括抑制流感病毒核酸或蛋白成分复制或表达合成的制剂。
20.优选的，所述流感病毒为流感病毒毒株a/pr8/34，抑制所述流感病毒毒株a/pr8/34的m1基因和np基因的复制或表达。
21.优选的，所述流感病毒为流感病毒毒株a/pr8/34，抑制所述流感病毒毒株a/pr8/34的m1蛋白和np蛋白的复制或表达。
22.优选的，所述抗流感病毒制剂中，氯化矢车菊素的浓度不低于50um。
23.与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
24.本发明通过氯化矢车菊素作用于流感病毒感染的细胞，检测细胞中流感病毒的基因表达、蛋白质合成和炎症因子变化，且与同类化合物矢车菊素-3-o-葡萄糖苷的作用进行比较，证实了氯化矢车菊素能够更好抑制流感病毒的转录和蛋白质合成，并且缓解了炎症反应。与其他化学药物只针对病毒某个基因或蛋白，而流感病毒是容易变异的，所以针对特定靶点的化学药物容易耐药不同，氯化矢车菊素是从整体上缓解并发症并减少流感病毒基因和蛋白表达，流感病毒单一基因或蛋白的变化不会造成氯化矢车菊素整体疗效的变化，所以难以产生耐药性。可以说明氯化矢车菊素能用于制备抗流感病毒的药物或相关产品，无毒无副作用，从而用来治疗流感病毒造成感染及相关疾病，为抗流感药物提供新的选择。
附图说明
25.图1为空斑抑制实验显示氯化矢车菊素与矢车菊素-3-o-葡萄糖苷抑制流感病毒滴度变化的效果对比。
26.图2为rt-pcr显示氯化矢车菊素与矢车菊素-3-o-葡萄糖苷抑制流感病毒的np基因表达变化结果对比。
27.图3为rt-pcr显示氯化矢车菊素与矢车菊素-3-o-葡萄糖苷抑制流感病毒的m1基因表达变化结果对比。
28.图4为western blot显示氯化矢车菊素抑制流感病毒的蛋白质合成变化。
29.图5为elisa显示氯化矢车菊素抑制流感病毒引起的细胞因子ifnα变化。
30.图6为elisa显示氯化矢车菊素抑制流感病毒引起的细胞因子il-6变化。
具体实施方式
31.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
32.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.下述实施例中所用材料和试剂如下：
34.流感病毒毒株a/pr8/34(h1n1),a549细胞(人肺癌细胞系)和mdck细胞(马丁犬肾细胞系)，由汕头大学医学院微生物与免疫实验室保存。dmem、mem培养基和胎牛血清由gibco公司生产。氯化矢车菊素(cyanidin chloride，以下简称cc)和矢车菊素-3-o-葡萄糖苷(cyanidin-3-o-glucoside，以下简称c3c)由成都德斯特生物技术有限公司提供。流感病毒蛋白m1和np抗体购自gentex公司，内参抗体β-actin和辣根过氧化物酶标记二抗购自cell signaling公司。炎症因子elisa检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。
35.下述实施例中的所有数据都是重复三次得到的平均值，用成对t检验分析差异显著性，p＜0.05被认为具有显著性差异，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001。
36.实施例1、氯化矢车菊素抑制流感病毒的滴度变化
37.实验方法：药物处理：将适量a549细胞种于6孔板并置于37℃、5％co2环境下培养24h。用含有不同药物浓度(cc浓度设置50um、100um、150um三组，c3c浓度设置为200um、300um、400um，阳性药物pc为50um利巴韦林)的培养基与病毒混合均匀，室温静置2h。后将a549培养基更换为1ml含病毒(moi＝0.1)以及不同药物浓度的混合液,并置于37℃细胞培养箱1.5h，后弃去混合液并加入2ml病毒增殖液(1xdmem培养基+2ug/ml tpck+1％双抗+10％fbs)，继续培养24h后收取病毒上清液离心后取上清做病毒滴度检测。滴度检测：将适量mdck细胞种于6孔板中并置于37℃、5％co2环境下培养，待孔底铺满单层细胞时，弃掉培养基并用pbs洗2次，随后用之前收获的病毒上清液(与培养基稀释)感染吸附1h。将提前配制好的1.8％低熔点胶在微波炉中加热充分融化，病毒吸附完成后，pbs洗3次，将1.8％低熔点胶与2xmem(8ug/ml tpck+2％双抗)等比例混合均匀，以每孔2ml的体积在凝固前迅速加入6孔板中，静置至凝固后倒置放于37℃培养箱培养72h。后每孔加入2ml4％多聚甲醛固定1-4h，吸出多聚甲醛弃胶并晾干，每孔用2ml 0.1％结晶紫染色，20min后吸出结晶紫并用流水洗净晾干，可观察记录病毒形成的空斑数量。
38.结果：如图1通过对空斑数量进行对数处理后与没有加任何药物的对照组和阳性药物组比较，显示了氯化矢车菊素在50um开始已经具有明显抗病毒效果，而同类化合物矢车菊素-3-o-葡萄糖苷在400um时才具有等同的效果；而且随着浓度提高，氯化矢车菊素抑制病毒增殖的效果逐渐增强。
39.实施例2、氯化矢车菊抑制流感病毒的基因表达变化
40.实验方法：药物处理：将适量a549细胞种于6孔板并置于37℃、5％co2环境下培养24h。用含有不同药物浓度(cc浓度设置50um、100um、150um三组，c3c浓度设置50-300um,阳性药物pc为50um利巴韦林)的培养基与病毒混合均匀，室温静置2h。后将a549培养基更换为1ml含病毒(moi＝0.1)以及不同药物浓度的混合液,并置于37℃细胞培养箱1.5h，后弃去混合液并加入2ml病毒增殖液(1xdmem培养基+2ug/ml tpck+1％双抗+10％fbs)，继续培养24h后收集每孔底部细胞。rna提取：在收集到的每孔细胞中加入500ultrizol充分震荡裂解，在每个样本中加入200ul氯仿，充分混匀室温静置5min后4℃，12000rpm离心15min；取上层水相置于新的ep管中，加入等体积异丙醇，充分混匀室温静置10min后4℃，12000rpm离心15min；弃掉上清，加入400ul 75％乙醇，充分混匀室温静置10min后4℃，7500rpm离心5min；弃掉上清，让沉淀的白色rna自然干燥，最后加入20uldepc水溶解，并测定rna浓度和纯度。rt-pcr检测：取样本rna1ug加入4ul的5
×
all-in-one qrt supermix和1ul的enzyme mix，
并用depc水补齐20ul，以50℃15min，85℃5s为反应条件进行逆转录；以逆转录得到的cdna为模板，人源gapdh基因引物(f:ggagcgagatccctccaaaat；r:ggctgttgtcatacttctcatgg)作为内参，加入病毒基因m1(f:accaatccactaataagacatgag；r:cctgactagcaacctccatg)和np(f:cccaggatgtgctctctgat；r:tgaaagggtctattccgact)的引物，配置为cdna体积1ul，sybr mix 2.5ul，上下游引物各0.25ul，depc水1ul的5ul反应体系；采用50℃2min，95℃5min；95℃15s，60℃30s，95℃15s(40个循环)作为反应程序，后对得到的ct值进行分析。
41.结果：如图2和图3所示，氯化矢车菊cc显著抑制了a549细胞中病毒m1和np基因的表达，且抑制效果在50um时已经非常显著，而同类化合物矢车菊素-3-o-葡萄糖苷在200um才具有相当的效果。
42.实施例3、氯化矢车菊素抑制流感病毒的蛋白质合成变化
43.实验方法：药物处理方法同实施例2。蛋白质检测：将收取的每孔细胞加入适量ripa裂解液，冰上裂解充分后，高速离心取上清并按照bca测定法测出蛋白浓度，根据浓度加入对应比例的上样缓冲液并煮沸10min后获得蛋白样品。将等量蛋白样品进行sds-page凝胶电泳，再将凝胶进行转膜，脱脂奶粉封闭1h，洗膜后依次孵育一抗二抗，最后应用化学法光检测内参蛋白β-actin和病毒m1,np蛋白的表达量。
44.结果：如图4所示，氯化矢车菊cc显著抑制了a549细胞中病毒m1和np蛋白的表达。
45.实施例4、氯化矢车菊素抑制流感病毒引起的细胞炎症因子变化。
46.实验方法：将适量a549细胞种于6孔板并置于37℃、5％co2环境下培养24h。用含有不同药物(cc浓度设置为150um，阳性药物pc为50um利巴韦林)的培养基与病毒混合均匀，室温静置2h。后将a549培养基更换为1ml含病毒(moi＝0.1)以及不同药物的混合液,并置于37℃细胞培养箱1.5h，后弃去混合液并加入2ml病毒增殖液(1xdmem培养基+2ug/ml tpck+1％双抗+10％fbs)，继续培养24h后将整块6孔板置于-80℃冷冻20min，再放置于37℃培养箱，如此反复冻融三次后收集孔内所有培养液离心取上清，然后通过elisa试剂盒检测炎症因子ifnα和il-6的含量变化。
47.结果：如图5和图6所示，氯化矢车菊素能在一定程度上抑制流感病毒引起的细胞炎症因子变化。
48.以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。