一种抑制黑色素瘤生长的双核酸序列及应用的制作方法

1.本发明涉及分子生物学和医药技术领域，尤其涉及一种抑制黑色素瘤生长的双核酸序列及应用。


背景技术：

2.黑色素瘤是来源于黑素细胞的恶性肿瘤，全球发病率持续上升。黑色素瘤在我国虽然属于少见恶性肿瘤，但病死率高，经济负担重。在亚洲人和其他有色人种中，肢端黑色素瘤约占50%，常见的原发部位多见于肢端例如足底、手指末端及甲下等肢端部位；而白种人皮肤黑色素瘤约占 90%。皮肤黑色素瘤ⅰ～ⅳ期 5 年生存率分别为 97%、84%、68%、 55%、17%。黑色素瘤常表现预后差，早期易转移，除化疗外，免疫和靶向治疗取得长足的进步，但中国人群以肢端类型为主，基因突变比例小，影响靶向药物的使用。由于传统治疗方案敏感度差、毒副作用强、耐药性强，总体的治疗疗效有限，亟须探索新型的治疗方案，提高疗效，延长患者生存期、提高生存质量。
3.il-2诱导的t细胞激酶 itk（interleukin-2 inducible t-cell kinase）在黑色素瘤中表达类，促进黑色素瘤生长。降低itk活性能够抑制黑色素瘤细胞生长，因此，itk可能是治疗黑色素瘤的一个潜在药物靶点。但目前只有一种抑制itk药物应用在血液癌症治疗中，开发靶向itk药物具有重要意义。
4.mat2b基因编码的蛋白是mat(蛋氨酸氨基转移酶)家族，mat2b编码的蛋白是mat的一个调节亚基。mat2b基因恶性黑色素瘤细胞系中高表达。下调mat2b基因后，细胞增殖受到抑制并促进了凋亡,抑制小鼠肿瘤的生长。mat2b基因是一个潜在的恶性黑色素瘤分子靶点。


技术实现要素：

5.为了解决上述的技术问题，本发明提供一种抑制黑色素瘤生长的双核酸序列及应用，解决现有黑色瘤治疗疗效有限的问题。
6.本发明提供一种抑制黑色素瘤生长的双核酸序列的应用，降低itk基因和mat2b基因表达水平的物质在制备治疗或预防黑色素瘤的药物中的应用。
7.其中，所述降低itk基因和mat2b基因表达水平的物质功能包含以下任意一种或多种：(1)抑制黑色素瘤细胞增殖；(2)抑制黑色素瘤克隆形成能力；(3)降低黑色素瘤细胞迁移能力。
8.其中，所述降低itk基因和mat2b基因表达水平的物质包括针对itk基因和mat2b基因的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质。
9.所述实施基因干扰的物质为sirna干扰序列：其中siitk: sense: acu cag agg ugg ugg aag a，序列如seq id no:1所示；antisense: uga guc ucc acc acc uuc u，序列如seq id no:2所示；
simat2b:sense: gac aag aga ugg aga caa a，序列如seq id no:3所示；antisense: cug uuc ucu acc ucu guu u，序列如seq id no:4所示。
10.本发明具有如下有益效果：提供itk基因和mat2b基因在黑色素瘤治疗中的应用，通过特异性干扰itk基因和mat2b基因可有效抑制黑色素瘤的恶性进展，itk基因和mat2b基因可作为治疗黑色素瘤靶点，具有良好的临床应用价值。
附图说明
11.图1为本实施例1黑色素瘤细胞中itk基因和mat2b基因干扰前后的qpcr效果图。
12.图2为本实施例2中干扰itk基因和mat2b基因后，黑色素瘤细胞增殖能力对比图。
13.图3为本实施例3干扰itk基因和mat2b基因后，黑色素瘤细胞凋亡对比图。
14.图4为本实施例4干扰itk基因和mat2b基因后黑色素瘤细胞增殖能力的克隆结果分析图。
15.图5为本实施例5干扰itk基因和mat2b基因后黑色素瘤细胞迁移能力的transwell结果图。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
17.实施例1本实施例中，对a375黑色素瘤细胞中itk基因和mat2b基因干扰（shrna慢病毒感染a375细胞）前后的qpcr效果进行验证。
18.本实施例包含qpcr荧光定量pcr实验，包含以下方法：1.1.rna抽提（1）收集细胞（6孔板），2000rpm离心5min，去上清后在细胞沉淀中加入1ml trizol试剂，混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5 ml 管中。
19.（2）每管加入200μl氯仿，上下颠倒ep管15 s，室温静置10 min。在4℃、12600 rpm，离心15 min。
20.（3）吸取上层液体移至新的1.5 ml ep管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10 min。4℃、12600 rpm离心12 min，弃上清。
21.（4）加1 ml、75%乙醇，洗涤沉淀。4℃、12000 rpm离心5 min，弃大部分上清。
22.（5）在4℃、12000 rpm离心5 min，弃上清，室温干燥。
23.（6）待rna沉淀透明，加rnase-free水至完全溶解，nanodrop 2000/2000c分光光度计分析测定所抽提rna的浓度及质量。
24.反转录获得cdna：1.2. rna 反转录（1）1μl oligo dt和2μg total rna加入pcr管中，补充rnase-free h2o至10μl；混匀后离心，70℃温浴10min；之后置于冰水混合物中冰浴，使oligo dt和模板退火。
25.（2）在上述混合物中，按比例配制反应体系，混匀，短暂离心。比例：5
×
rt buffer 4μl，10 mmdntps 2μl，rnasin（40u/μl）0.4μl，m-mlv-rtase（200 u/μl）1μl，rnase-free h2o 2.6μl。
26.（3）上述体系42℃水浴反应1 h，然后在70℃水浴10 min，将得到的rt 产物cdna置于-20℃保存备用。
27.1.3. real-time pcr 检测（1）按下列比例配置反应体系：sybr premix ex taq 6.0 μl，引物mix（5 μm）0.3μl，模板（反转录产物）0.6μl，rnase-free h2o 5.1μl。
28.（2）两步法进行real-time pcr，并制作熔解曲线，程序如下：stage1 95度30s；stage2 95度5s，60度30s，40个循环；stage3 95度15s，60度30s，95度15s。
29.1.4.数据分析相对定量分析δct=目标基因ct值-内参基因ct值；-δδct=nc组δct平均值-各样品δct值；2-δδct
反映各样品相对nc组样品目标基因的相对表达水平。
30.参照图1所示，图a柱状图显示itk基因抑制前后的比较，加入itk-sirna后，显著抑制itk基因的表达（**p《0.01）。
31.图b柱状图显示mat2b基因抑制前后的比较，加入mat2b-sirna后，显著抑制mat2b基因的表达。
32.实施例2本实施例用siitk和simat2b干扰itk基因和mat2b基因后，采用celigo法检测细胞数量，分析细胞的生长增殖情况。
33.具体方法为：（1）各组细胞经胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数。
34.（2）根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度，培养体系为100μl/孔，铺板中确保每孔加入细胞数目一致，37℃、5%co2培养箱培养。
35.（3）从铺板后第二天开始，每天celigo检测读板一次，连续检测读板5天。
36.（4）调整analysis settings的输入参数，准确计算每次扫描的带绿色荧光的细胞的数量。对数据进行统计，绘出连续5天的细胞增殖曲线。
37.参照图2所示，横坐标代表天数。通过图2显示肿瘤细胞的增殖能力显著降低，由此可证明实施例中干扰itk基因和mat2b基因后，可降低黑色素瘤细胞增殖能力。
38.实施例3本实施例干扰itk基因和mat2b基因后，黑色素瘤细胞凋亡的研究。
39.本实施例中通过annexin v-apc单染法检测细胞凋亡，具体方法为：（1）在6 孔板中细胞生长至覆盖率约为70%时诱导凋亡。
40.（2）对于贴壁细胞，上清细胞需收集。胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，收集于5 ml离心管中，每组设三个复孔。对于悬浮细胞，直接收集。
41.（3）在1300 rpm离心5min，去上清，d-hanks洗涤细胞沉淀。用binding缓冲液buffer洗涤细胞沉淀，1300 rpm、3 min离心，然后收集细胞。
42.（4）用200μl binding 缓冲液重悬细胞沉淀。加10μl annexin v-apc染色，室温（避光）10min。之后，根据细胞量调整加入适量binding缓冲液，上机（流式细胞仪）检测。
43.参照图3数据所示，发现经双核酸干扰后，肿瘤细胞凋亡数增多（*p《0.05）。由此可证明本发明实施例中干扰itk基因和mat2b基因后，增加黑色素瘤细胞凋亡。
44.实施例4本实施例干扰itk基因和mat2b基因后，黑色素瘤细胞增殖能力研究；本实施例采用细胞克隆团检测方法：具体方法如下：(1).用lipofectamine 2000（thermo fisher）转染siitk和simat2b于a375细胞，置于37℃培养箱中培养。
45.(2).细胞计数，取约1000细胞/孔铺于6孔板，每孔含2ml培养基。
46.(3).2周后弃去培养液，4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，pbs清洗。
47.(4).镜下计数细胞克隆团，并统计分析。
48.参照图4所示，在a375细胞中用双核酸序列干扰itk基因和mat2b基因后，肿瘤细胞增殖能力显著降低，克隆团相对数量的统计图如下。**p《0.01。由此可验证干扰itk基因和mat2b基因降低黑色素瘤细胞增殖能力的克隆。
49.实施例5本实施例研究干扰itk基因和mat2b基因后，黑色素瘤细胞迁移能力研究；本实施例采用transwell细胞迁移能力检测方法，其方法如下：(1) a375细胞在含有 10%fbs（胎牛血清）的细胞培养基中处理和培养。
50.(2) 用1xpbs清洗，胰酶消化。调整细胞数为 3
ꢁ
x 10
5 cell/ml。
51.(3) 在板孔中加入 0.6 ml 含有 10%
ꢁ
fbs 的 dmem 培养基，小室置于板孔中，底部接触培养基。
52.（4）细胞小室上层加入3
ꢁ
x
ꢁ
104ꢁ
细胞，在培养箱中37
°
c 培养48小时。吸去孔内和小室内培养液（5）pbs清洗两次，4％多聚甲醛固定30min，结晶紫染色30min，pbs洗去多余染料。
53.（6）小室内细胞擦拭干净，对滤膜底部细胞置于镜下观察，用imagej软件对小室外侧的细胞计数并统计分析。
54.参照图5所示，在a375胞中用双核酸序列干扰itk基因和mat2b基因后，肿瘤细胞的迁移能力显著降低，由此可验证干扰itk基因和mat2b基因可降低黑色素瘤细胞迁移能力。
55.本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。