一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒及其制备方法

1.本发明属于生物医用功能材料技术领域，具体涉及一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒及其制备方法。


背景技术：

2.急性肾损伤(acute kidney injury，aki)是临床常见危重病症之一，死亡率高达40％～80％，约有13％的患者在三年内进展为慢性肾脏病。肾脏纤维化是各种不同原因引起的慢性肾脏病(chronic kidney disease,ckd)共同的病理生理基础，也是所有ckd的最终结果。目前在临床工作中，抑制或逆转急、慢性肾损伤的治疗手段十分有限，基于当前治疗的局限性，需要探索研究和开发治疗肾脏疾病的新方法。
3.干细胞是能够产生广泛、复杂的多能细胞谱系的祖细胞，来源广且免疫源性低，具有抗细胞凋亡、血管生成、抗炎症、免疫调节等生物学功能，可以有效的修复损伤组织。这使得干细胞被广泛应用于多种疾病治疗和研究中，并在多种自身免疫性疾病、代谢性疾病、神经系统疾病治疗中取得较好的效果，更通过组织工程技术，在不同程度的器官损伤、组织缺损中也显示出不错的再生效果。证明干细胞治疗成为一种很有前景的治疗策略。
4.如何提高外源性msc的治疗效果，除了要有高质量的干细胞外，关注其安全、高效的归巢率是必要的，即msc在目标组织的脉管系统里被捕获，随后跨越血管内皮细胞迁移至目标组织的过程。目前干细胞治疗主要是通过循环系统给药(包括静脉注射、动脉注射)和局部注射，其中静脉注射因操作简便、侵袭性小、可重复性强，在治疗中最常使用。但静脉注射存在发生细胞滞留肺部而造成到达损伤部位发挥治疗作用的细胞数量减少。因此，如何提高外源性干细胞的归巢率是亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明提供一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒及其制备方法。本发明的纳米颗粒材料首先是在氧化剂存在的条件下使多胺基和多酚化合物氧化、交联、聚合形成具有多种活性基团(胺基、羧基、酚羟基和双键等)的纳米颗粒；然后通过点击化学反应，将巯基化处理的多肽e7和l-丝氨酸同时修饰在纳米颗粒表面，纳米颗粒表面的多肽e7可以特异性的与干细胞相结合，将多酚纳米颗粒修饰到干细胞膜表面，颗粒表面修饰的l-丝氨酸可以导航血液中的干细胞到受损肾脏组织部位，从而发挥其相应的生物学功能，有效的治疗急、慢性肾脏病。
6.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
7.s1：将多酚化合物、多胺基化合物和氧化剂共溶于碱性缓冲液中，于15～35℃下搅拌反应5～48h；
8.s2：对反应后的溶液进行离心，取沉淀，再依次进行清洗和冷冻干燥处理，得多酚
纳米颗粒；
9.s3：分别用半胱氨酸修饰丝氨酸和多肽e7，获得巯基化的丝氨酸sh-s和巯基化的多肽sh-e7；
10.s4：将sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒分散于水中，然后用紫外辐照0.5～60min，再离心、清洗、冷冻干燥，即得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
11.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
12.进一步，多酚化合物、多胺基化合物和氧化剂在碱性缓冲液中的终浓度分别为0.5～10mg/ml、0.5～10mg/ml和0.1～5mg/ml
13.进一步，多酚化合物为儿茶酚、阿魏酸、间苯二酚、黄酮类、花青素类、黄酮醇及其苷类、异黄酮类、没食子酸、鞣花酸、单宁酸、原花青素和邻苯三酚类中的至少一种。
14.进一步，多胺基化合物为乙二胺、戊二胺、2,2,4-三甲基六亚甲基二胺、1,8-二氨基辛烷、甲基环己烷二胺、1,3-二氨基甲基环己烷、2,4,6-三氨甲基环己烷、1,4-双二氨已基环己烷和2-(3,4-二羟基苯基)乙胺中的至少一种。
15.进一步，氧化剂为过氧化氢、过硫酸铵、浓硝酸、高碘酸钠、高锰酸钾和重铬酸钾中的至少一种。
16.进一步，碱性缓冲液为ph值为8～11的磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸-naoh缓冲液、甘氨酰胺缓冲液或碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。
17.进一步，巯基化的多肽sh-e7经过以下步骤制得：将多肽e7和半胱氨酸按1～3:0.5～1的质量比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气18～22min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗5～7次，再干燥，即得。
18.进一步，巯基化的丝氨酸sh-s经过以下步骤制得：将丝氨酸和半胱氨酸按2～4:1～2的质量比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气20～25min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗3～5次，再干燥，即得。
19.进一步，sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒在水中的终浓度分别为0.05～1mg/ml、0.05～1mg/ml和0.5～10mg/ml；紫外辐照的紫外线波长为254nm～365nm，紫外辐照时间为5～45min。
20.本技术还公开了一种采用上述方法制得的导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
21.本发明的有益效果是：
22.1、本发明使多酚化合物与多胺基化合物在氧化剂存在的情况下氧化、交联、聚合，形成具有多种活性基团的多酚纳米颗粒，各种活性基团既协同作用，也各自发挥相应的生物学功能。其中羧基、胺基和酚羟基可以协同维持纳米颗粒的亲水性，使亲水性的纳米颗粒具有优异的生物相容性；酚羟基可以维持多酚相应的生物学功能，如调节病灶组织的炎症；双键作为进一步接枝特异性生物活性物质的连接基团，可以与半胱氨酸修饰的多肽e7与l-丝氨酸反应，通过点击化学反应，将两种特异性蛋白修饰到纳米颗粒表面，使纳米颗粒具有特异性捕获的干细胞的性能并将干细胞靶向到肾脏病灶组织，提高干细胞的归巢率，进一步发挥其相应的生物学功能。
23.2、多酚化合物的邻酚羟基结构与多胺基化合物的胺基在氧化剂存在的条件下发生多种化学反应，如迈克尔加成反应、席夫碱反应、自由基聚合反应、氢键反应、π-π堆积等
反应，形成具有优异生物相容性的多酚纳米颗粒。随后，纳米颗粒表面的双键在紫外辐照下，可以与巯基化的多肽e7与l-丝氨酸发生点击化学反应，将特异性活性蛋白化学接枝到颗粒表面。
24.3、本发明制备方法首次将构建了同时具有特异性捕获干细胞并将其导航到受损肾脏组织部位的多酚纳米颗粒，有望提高外源性高质量干细胞的归巢率；且该纳米颗粒具有调节病变组织部位炎症的性能，使干细胞更好的发挥生物学功能，修复病变组织。整个纳米颗粒制备过程操作简单，反应条件温和，反应药物健康、绿色天然，制得的纳米颗粒具有优异的特异性捕获干细胞并将其导航到急、慢性肾脏病组织，提高干细胞归巢率同时实现了干细胞的靶向治疗，为急、慢性肾脏病治疗提供了一种有效的治疗策略。
附图说明
25.图1为导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒的透射电镜图；
26.图2为肾脏组织荧光染色结果。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
28.实施例1
29.一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒，其经过以下步骤制得：
30.s1：将儿茶酚、乙二胺和高碘酸钠分别用ph为9的磷酸盐缓冲液溶解，再将儿茶酚溶液、乙二胺溶液与高碘酸钠溶液混合，所得混合溶液中儿茶酚、乙二胺与高碘酸钠的终浓度分别为1mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml，然后在15℃的恒温条件下持续搅拌、反应30h；
31.s2：将s1反应后的溶液用10000r/m的速度离心5min，去上清液，再用up水分散沉淀，再次以10000r/m速度离心5min，以去除纳米颗粒中残留的磷酸盐缓冲剂和高碘酸钠，然后将颗粒进行冷冻，得多酚纳米颗粒；
32.s3：将多肽e7(eplqlkm)和半胱氨酸按2:0.8的质量比混合，再将混合物按1.4g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气20min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗6次，再干燥，得巯基化的多肽sh-e7；将丝氨酸和半胱氨酸按3:1的质量比混合，再将混合物按1.5g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气20min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗4次，再干燥，得巯基化的丝氨酸sh-s；
33.s4：用up水分别溶解sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒，再将三种溶液混合，所得混合溶液中sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒的终浓度分别为0.05mg/ml、0.05mg/ml和2mg/ml；然后立即用波长为254nm的紫外线辐照5min，将sh-s和sh-e7修饰到多酚纳米颗粒表面；
34.s5：将紫外辐照后的混合溶液以10000r/m的速度离心5min，去上清液，并将底部剩余纳米颗粒进行冷冻干燥处理，制得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
35.实施例2
36.一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒，其经过以下步骤制得：
37.s1：将花青素、戊二胺和30％过氧化氢分别用ph为8.5的磷酸盐缓冲液溶解，再将三种溶液混合，所得混合溶液中花青素、戊二胺和过氧化氢的终浓度分别为1mg/ml、1mg/ml和25％，然后在20℃的恒温条件下持续搅拌、反应20h；
38.s2：将s1反应后的溶液用10000r/m的速度离心5min，去上清液，再用up水分散沉淀，再次以10000r/m速度离心5min，以去除纳米颗粒中残留的磷酸盐缓冲剂和过氧化氢，然后将颗粒进行冷冻，得多酚纳米颗粒；
39.s3：将多肽e7(eplqlkm)和半胱氨酸按3:1的质量比混合，再将混合物按1.5g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气22min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗7次，再干燥，得巯基化的多肽sh-e7；将丝氨酸和半胱氨酸按2:1的质量比混合，再将混合物按2g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气25min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗5次，再干燥，得巯基化的丝氨酸sh-s；
40.s4：用up水分别溶解sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒，再将三种溶液混合，所得混合溶液中sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒的终浓度分别为0.1mg/ml、0.25mg/ml和2.5mg/ml；然后立即用波长为254nm的紫外线辐照15min，将sh-s和sh-e7修饰到多酚纳米颗粒表面；
41.s5：将紫外辐照后的混合溶液以10000r/m的速度离心5min，去上清液，并将底部剩余纳米颗粒进行冷冻干燥处理，制得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
42.实施例3
43.一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒，其经过以下步骤制得：
44.s1：将单宁酸、2-(3,4-二羟基苯基)乙胺和过硫酸铵分别用ph为9的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris)溶解，再将三种溶液混合，所得混合溶液中单宁酸、2-(3,4-二羟基苯基)乙胺和过硫酸铵的终浓度分别为2mg/ml、1mg/ml和2mg/ml，然后在25℃的恒温条件下持续搅拌、反应15h；
45.s2：将s1反应后的溶液用10000r/m的速度离心5min，去上清液，再用up水分散沉淀，再次以10000r/m速度离心5min，以去除纳米颗粒中残留的tris和过硫酸铵，然后将颗粒进行冷冻，得多酚纳米颗粒；
46.s3：将多肽e7(eplqlkm)和半胱氨酸按2:1的质量比混合，再将混合物按2g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气18min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗5次，再干燥，得巯基化的多肽sh-e7；将丝氨酸和半胱氨酸按3:2的质量比混合，再将混合物按2g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气20min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗5次，再干燥，得巯基化的丝氨酸sh-s；
47.s4：用up水分别溶解sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒，再将三种溶液混合，所得混合溶液中sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒的终浓度分别为0.4mg/ml、0.4mg/ml和5mg/ml；然后立即用波长为312nm的紫外线辐照20min，将sh-s和sh-e7修饰到多酚纳米颗粒表面；
48.s5：将紫外辐照后的混合溶液以10000r/m的速度离心5min，去上清液，并将底部剩余纳米颗粒进行冷冻干燥处理，制得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
49.实施例4
50.一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒，其经过以下步骤制得：
51.s1：将鞣花酸、甲基环己烷二胺和高锰酸钾分别用ph为10的硼酸盐缓冲液溶解，再将三种溶液混合，所得混合溶液中鞣花酸、甲基环己烷二胺和高锰酸钾的终浓度分别为5mg/ml、2.5mg/ml和2.5mg/ml，然后在30℃的恒温条件下持续搅拌、反应24h；
52.s2：将s1反应后的溶液用10000r/m的速度离心5min，去上清液，再用up水分散沉淀，再次以10000r/m速度离心5min，以去除纳米颗粒中残留的硼酸盐和高锰酸钾，然后将颗
粒进行冷冻，得多酚纳米颗粒；
53.s3：将多肽e7(eplqlkm)和半胱氨酸按2:0.8的质量比混合，再将混合物按1.4g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气20min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗6次，再干燥，得巯基化的多肽sh-e7；将丝氨酸和半胱氨酸按3:1的质量比混合，再将混合物按1.5g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气20min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗4次，再干燥，得巯基化的丝氨酸sh-s；
54.s4：用up水分别溶解sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒，再将三种溶液混合，所得混合溶液中sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒的终浓度分别为0.5mg/ml、0.5mg/ml和8mg/ml；然后立即用波长为312nm的紫外线辐照25min，将sh-s和sh-e7修饰到多酚纳米颗粒表面；
55.s5：将紫外辐照后的混合溶液以10000r/m的速度离心5min，去上清液，并将底部剩余纳米颗粒进行冷冻干燥处理，制得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
56.实施例5
57.一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒，其经过以下步骤制得：
58.s1：将异黄酮、1,3-二氨基甲基环己烷和高碘酸钠分别用ph为10的tris缓冲液溶解，再将三种溶液混合，所得混合溶液中异黄酮、1,3-二氨基甲基环己烷和高碘酸钠的终浓度分别为8mg/ml、4mg/ml和4mg/ml，然后在32℃的恒温条件下持续搅拌、反应8h；
59.s2：将s1反应后的溶液用10000r/m的速度离心5min，去上清液，再用up水分散沉淀，再次以10000r/m速度离心5min，以去除纳米颗粒中残留的tris和高碘酸钠，然后将颗粒进行冷冻，得多酚纳米颗粒；
60.s3：将多肽e7(eplqlkm)和半胱氨酸按3:1的质量比混合，再将混合物按1.5g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气22min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗7次，再干燥，得巯基化的多肽sh-e7；将丝氨酸和半胱氨酸按2:1的质量比混合，再将混合物按2g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气25min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗5次，再干燥，得巯基化的丝氨酸sh-s；
61.s4：用up水分别溶解sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒，再将三种溶液混合，所得混合溶液中sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒的终浓度分别为0.8mg/ml、0.8mg/ml和8mg/ml；然后立即用波长为254nm的紫外线辐照45min，将sh-s和sh-e7修饰到多酚纳米颗粒表面；
62.s5：将紫外辐照后的混合溶液以10000r/m的速度离心5min，去上清液，并将底部剩余纳米颗粒进行冷冻干燥处理，制得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
63.实施例6
64.一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒，其经过以下步骤制得：
65.s1：将原花青素、2,4,6-三氨甲基环己烷和浓硝酸分别用ph为10的甘氨酰胺缓冲液溶解，再将三种溶液混合，所得混合溶液中原花青素、2,4,6-三氨甲基环己烷和硝酸的终浓度分别为6mg/ml、4mg/ml和50％，然后在20℃的恒温条件下持续搅拌、反应40h；
66.s2：将s1反应后的溶液用10000r/m的速度离心5min，去上清液，再用up水分散沉淀，再次以10000r/m速度离心5min，以去除纳米颗粒中残留的甘氨酰胺和硝酸，然后将颗粒进行冷冻，得多酚纳米颗粒；
67.s3：将多肽e7(eplqlkm)和半胱氨酸按2:1的质量比混合，再将混合物按2g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气18min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗
5次，再干燥，得巯基化的多肽sh-e7；将丝氨酸和半胱氨酸按3:2的质量比混合，再将混合物按2g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气20min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗5次，再干燥，得巯基化的丝氨酸sh-s；
68.s4：用up水分别溶解sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒，再将三种溶液混合，所得混合溶液中sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒的终浓度分别为0.2mg/ml、0.1mg/ml和2.5mg/ml；然后立即用波长为365nm的紫外线辐照40min，将sh-s和sh-e7修饰到多酚纳米颗粒表面；
69.s5：将紫外辐照后的混合溶液以10000r/m的速度离心5min，去上清液，并将底部剩余纳米颗粒进行冷冻干燥处理，制得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
70.实施例7
71.一种导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒，其经过以下步骤制得：
72.s1：将绿原酸、1,4-双二氨已基环己烷和高碘酸钠分别用ph为8.5的tris缓冲液溶解，再将三种溶液混合，所得混合溶液中绿原酸、1,4-双二氨已基环己烷和高碘酸钠的终浓度分别为2mg/ml、2mg/ml和2mg/ml，然后在30℃的恒温条件下持续搅拌、反应24h；
73.s2：将s1反应后的溶液用10000r/m的速度离心5min，去上清液，再用up水分散沉淀，再次以10000r/m速度离心5min，以去除纳米颗粒中残留的tris和高碘酸钠，然后将颗粒进行冷冻，得多酚纳米颗粒；
74.s3：将多肽e7(eplqlkm)和半胱氨酸按3:1的质量比混合，再将混合物按1.5g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气22min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗7次，再干燥，得巯基化的多肽sh-e7；将丝氨酸和半胱氨酸按2:1的质量比混合，再将混合物按2g:1ml料液比共溶于浓度为20wt％的哌啶中，鼓吹氮气25min，然后分离并用n,n-二甲基甲酰胺清洗5次，再干燥，得巯基化的丝氨酸sh-s；
75.s4：用up水分别溶解sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒，再将三种溶液混合，所得混合溶液中sh-s、sh-e7和多酚纳米颗粒的终浓度分别为0.8mg/ml、0.8mg/ml和8mg/ml；然后立即用波长为365nm的紫外线辐照35min，将sh-s和sh-e7修饰到多酚纳米颗粒表面；
76.s5：将紫外辐照后的混合溶液以10000r/m的速度离心5min，去上清液，并将底部剩余纳米颗粒进行冷冻干燥处理，制得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒。
77.结果分析
78.上述各实施例所得导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒性能类似，以实施例7中制得的多酚纳米颗粒为例，对其性能进行说明。
79.图1为导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒的透射电镜图，从图中可看出，半胱氨酸修饰的多肽e7(sh-e7)和半胱氨酸修饰的丝氨酸(sh-s)成功的接枝到多酚纳米颗粒表面，即得到的干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒表面装载了多肽e7和丝氨酸。
80.用导航干细胞靶向肾脏病灶组织的多酚纳米颗粒修饰干细胞，然后将修饰后的干细胞从兔子的耳源静脉注射进血管中，2天后取出肾脏组织并做特异性荧光染色，结果如图2所示，其中，图2a为肾脏组织，图2b和图2c分别为不同尺度下的肾脏组织免疫荧光染色结果，其中图2b虚线内组织为肾小球，图2c箭头所指示的偏白色部分为肾小球组织中干细胞分泌的特异性标记物cd44，说明sh-e7和sh-s处理后的多酚纳米颗粒确实具有导航干细胞到肾脏病灶组织的生物学功能。
81.虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。