发酵乳杆菌CECT5716胞外多糖在制备预防或改善慢性肾脏疾病中的应用的制作方法

本发明属于微生物，涉及发酵乳杆菌cect 5716，尤其是一种发酵乳杆菌cect5716胞外多糖在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病中的应用。

背景技术：

1、乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的高分子量碳水化合物聚合物。研究表明，其不仅具有增黏性、保水性等理化特性，还具有抗肿瘤、抗氧化及免疫调节等多种生物学特性。

2、不同乳酸菌胞外多糖结构不同，具有的生物学特性不尽相同，具有菌株特异性，因而通过其功能特性选用合适菌株所产的胞外多糖进行干预试验最为重要。limosilactobacillus fermentum cect 5716是一株分离自健康人乳的乳酸菌，目前，国内外对发酵乳杆菌cect 5716的研究主要集中在菌株益生功能的研究，未见有发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖的研究报道，因而本发明对其胞外多糖的分离制备及改善ckd的作用等相关研究进行了总结。

3、通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

4、1、植物乳杆菌zdy2013在制备缓解肾损伤产品中应用(cn112553115a)，所述的植物乳杆菌zdy2013极耐酸耐胆盐，能在胃肠液中保持较高的存活率，并能抑制食源性致病菌的增长。此外，还能因为能调节肠道菌群多样性，达到改善宿主胃肠道健康。具有缓解肾脏纤维化，改善炎症表观症状，调节氧化应激，调控炎症因子的表达，达到有效防治高盐饮食诱导的肾损伤功效。

5、2、一种具有降低血糖功能的复合植物乳杆菌制剂及其应用(cn109136151a)，本发明提供一种复合菌，由植物乳杆菌ss18-5和植物乳杆菌ss18-37组成。复合菌中，植物乳杆菌ss18-5和植物乳杆菌ss18-37的cfu配比为1:(0.01-100)。植物乳杆菌ss18-5，保藏编号为cgmcc no.14917。植物乳杆菌ss18-37，保藏编号为cgmcc no.14918。本发明还保护复合菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗和/或预防糖尿病。本发明对糖尿病具有良好的降低血糖效果，同时显著改善胰岛素抵抗，对心脏、肝脏、肾脏、脾脏和胰腺具有保护功效。本发明具有广阔的市场应用前景。

6、通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病中的应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种发酵乳杆菌(limosilactobacillusfermentum)cect5716胞外多糖在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病药物或功能性食品中的应用。

4、进一步地，所述发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖的分子量大约为37000da左右；

5、进一步地，胞外多糖水解分析得到单糖组成为葡萄糖；

6、进一步地，采用红外、甲基化和nmr分析其结构由t-glcp-(l→、→4)-glcp-(1→和→4,6)-glcp-(1→)组成，相对摩尔比约为1:7:1。

7、进一步地，采用扫描电镜观察发现胞外多糖呈现多孔和高度支化的结构。

8、进一步地，所述发酵乳杆菌cect 5716发酵液是limosilactobacillusfermentumcect 5716菌种，于mrs 37℃静置厌氧培养12h，以体积比1～10：100的接种量接种到mrs液体培养基中，进行扩大培养得到的发酵液，进行下一步实验。

9、进一步地，所述发酵乳杆菌cect5716胞外多糖经以下步骤制备得到：

10、(1)预处理：将发酵乳杆菌cect 5716发酵液在100℃下加热20-40min，冷却后，4-10℃，5000-10000r/min离心10-20min，取上清液；

11、(2)胞外多糖的分离：向步骤(1)所得上清液中加入1-3倍体积95％无水乙醇，2-10℃静置过夜后，4-10℃，5000-10000r/min离心10-20min，弃上清，得粗多糖沉淀；

12、(3)胞外多糖的纯化即除蛋白：将步骤(2)所得沉淀复溶于蒸馏水中，加入三氯乙酸，使三氯乙酸质量终浓度为10％，置于磁力搅拌器上冰浴3-5h，离心取上清，将其ph调至中性，加入1-3倍体积95％无水乙醇进行复醇沉，2-10℃静置过夜后离心；

13、(4)透析：将步骤(3)所得沉淀复溶于蒸馏水中，选择截留量为8000da的透析袋进行透析2-3d；

14、(5)冷冻干燥：将透析后的溶液预冷冻后，冷冻干燥至少12h，得到发酵乳杆菌cect5716胞外多糖，其纯度为90-95％。

15、进一步地，纯度为90-95％的发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖经(例如，使用sepharose cl-6b凝胶柱)柱分离，得到的eps纯度高于98％的发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖。

16、进一步地，所述发酵乳杆菌cect 5716发酵液是挑取-80℃冻藏的limosilactobacillus fermentum cect 5716菌种，于mrs固体培养基平板进行划线活化，37℃静置厌氧培养12h，直至恢复活力；将恢复活力的菌株，以1～10：100的体积比的接种量接种到mrs液体培养基中，进行扩大培养得到的。

17、进一步地，所述药物或功能性食品以发酵乳杆菌cect5716胞外多糖为主要活性成分，制成医学上、食品中能够接受的剂型。

18、进一步地，所述剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂或饮剂。

19、进一步地，所述剂型中发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖的有效活性成分的质量百分数含量在1-99％。

20、进一步地，所述由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病所引发的特征包括体重下降、精神萎靡、肾脏损伤、肾间质纤维化、机体炎症反应、肠道黏膜屏障受损。

21、进一步地，所述药品或功能性食品包括主要活性成分的发酵乳杆菌cect5716胞外多糖及医学上或食品中能够接受的辅料。

22、进一步地，所述发酵乳杆菌cect5716胞外多糖在动物实验时，有效干预治疗并改善小鼠慢性肾脏疾病。

23、本发明取得的优点和积极效果为：

24、1、本发明经过动物体内实验表明，通过灌胃发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖，可以改善由腺嘌呤诱导的小鼠慢性肾脏疾病，包括外观形态、体重、精神状态、肾脏损伤、炎症反应以及肠道黏膜屏障通透性等。本发明发现了发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖的一种新用途，尤其是关于其在改善慢性肾脏疾病中的新用途，提供一种高质量的益生菌胞外多糖干预治疗慢性肾脏疾病的新方法和新手段。

25、2、本发明通过构建腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病小鼠模型，观察并测定了以发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖为有效成分，制成医学上或食品中可以接受的剂型对ckd小鼠模型体重、外观形态、肾脏器官指数、肾脏损伤、肾间质纤维化、炎症因子的表达及肠道上皮细胞屏障损伤的影响，结果发现：limosilactobacillusfermentum cect 5716胞外多糖能够显著改善小鼠外观形态及体重。

26、以上试验结果证明了以发酵乳杆菌cect5716胞外多糖为有效成分，制成医学上或食品中可以接受的剂型，以发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖能够显著改善腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病所带来的生长抑制、精神萎靡、肾脏损伤、肾间质纤维化以及炎症反应和肠道黏膜通透性，为应用益生菌胞外多糖干预治疗慢性肾脏疾病的临床研究提供了理论依据。

27、3、本发明将发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖用于制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病药物或功能性食品中，提供一种用于预防或改善慢性肾脏疾病的药物或功能性食品，该药物或功能性食品无副作用，可以作为常规治疗慢性肾脏疾病的安全替代药物。

28、4、本发明对研究发酵乳杆菌cect 5716胞外多糖辅助治疗肾损伤，恢复肾脏功能具有重要意义。