Kindlin-2作为靶点在皮肤创伤修复中的应用

kindlin-2作为靶点在皮肤创伤修复中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及kindlin-2作为靶点在皮肤创伤修复中的应用。


背景技术：

2.皮肤是人体重要的物理屏障，是含有表皮、真皮及皮下等结构组成的人体重要的组织，是保护人体免受外界干扰的重要保护性结构。皮肤在维持体温、排汗、免疫等方面有着不可替代的重要作用。皮肤是人体第一道防线，易受外界各种伤害，如烧伤、机械创伤及慢性疾病所致等。通常，轻度、小范围的皮肤创伤可依靠自身修复愈合，当皮肤伤口过大时，自身再生表皮难以覆盖伤口。
3.目前，对于皮肤损伤最常见的治疗策略之一是使用表皮生长因子等生化制品，这种治疗对于一般性皮肤损伤具有一定效果，但是对于皮肤大面积缺损和烫伤、病理性损伤特别是糖尿病导致的皮肤溃疡等的治疗效果较差。以自体皮移植治疗皮肤缺损是目前临床上最有效的治疗方法之一，但由于自体来源不足，尤其是大面积皮肤缺损患者需要通过多次移植才能完全治愈，这不仅提高了移植手术的风险，也易造成新的创伤。
4.因此，提供一种对皮肤创伤修复特异性高的药物，使其能快速封闭创面，尽快恢复皮肤屏障功能，促进各类细胞再生和组织生长，降低因感染引起相关并发症发生的可能性具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出kindlin-2下调剂在制备皮肤创伤修复药物中的应用，该药物可通过靶向下调脂肪细胞中的kindlin-2来修复皮肤创伤。
6.根据本发明的一个方面，提出了kindlin-2下调剂在制备皮肤创伤修复药物中的应用。
7.在本发明的一个实施方式中，所述皮肤创伤包括急性皮肤创伤、慢性皮肤创伤、细菌感染型皮肤创伤中的任一种。
8.kindlin-2由fermt2基因编码，为黏着斑相关蛋白，属于kindlin蛋白家族，是一种新的与整合素相互作用的黏着斑分子。其在多种组织和细胞中表达，是整合素活化和细胞-细胞外基质黏附和迁移所必需的。发明人经研究发现，特异性敲除小鼠脂肪细胞中的kindlin-2蛋白，可以使小鼠的血管生成增加，进而对皮肤创伤进行修复，加速皮肤愈合。
9.在本发明的一些实施方式中，所述药物为靶向脂肪细胞中的kindlin-2基因或其编码蛋白的药物。
10.在本发明的一些实施方式中，所述药物包括针对所述kindlin-2基因的敲低药物、敲除药物或针对kindlin-2蛋白的受体阻断药物中的至少一种。
11.在本发明的一些实施方式中，针对所述kindlin-2基因的敲低药物包括靶向所述
kindlin-2基因的shrna、sirna或crispr/cas药物中的任一种。
12.在本发明的一些实施方式中，针对所述kindlin-2基因的敲除药物为包括cre/loxp系统的药物，用于特异性敲除所述脂肪细胞中的所述kindlin-2基因。
13.在本发明的一些实施方式中，所述针对kindlin-2蛋白的受体阻断药物包括小分子化合物或多肽中的任一种。
14.所述受体阻断药物通过与所述脂肪细胞中的所述kindlin-2蛋白特异性结合，以阻断所述kindlin-2蛋白发挥相应的作用。
15.在本发明的一些实施方式中，所述药物为用于促进血管内皮细胞增殖的药物。
16.具体地，所述药物通过下调所述脂肪细胞中的kindlin-2，促进所述血管内皮细胞的增殖，进而促进皮肤创伤修复。
17.若皮肤损伤至真皮层甚至是皮下组织时，伤口的愈合过程包括起初的出血、凝血和炎症反应，然后是朗格罕细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，通过主动或被动地释放细胞介质启动创面愈合。之后在肌纤维母细胞的牵拉作用下，伤口边缘的真皮和皮下组织向中心移动，逐渐缩小创面。毛细血管生成，基质内形成的肉芽组织能够填平伤口，并促进表皮再生。
18.在本发明的一些实施方式中，所述药物为用于促进血管再生的药物。
19.具体地，所述药物通过下调所述脂肪细胞中的kindlin-2，促进所述血管内皮细胞的增殖，进而促进所述血管再生，以加速对皮肤创伤的修复。
20.血管再生是在原有毛细血管或微静脉基础上通过血管内皮细胞增殖和迁移，从先前存在的血管处以出芽或非出芽(套叠)等形式生成新血管。
21.伤口愈合中，伴随组织器官的损伤和病变，相应的微血管也发生损伤和变化，为配合实质细胞的修复，首先要有毛细血管的再生和重新组合、改造原有的血管。一般毛细血管由内皮细胞、基底膜、外周细胞组成。毛细血管最具特征性的结构是数量不等、大小均匀的质膜小泡，质膜小泡互相连通，形成穿过内皮的暂时性孔道，增大内皮细胞的通透性。在创伤发生时，血浆蛋白从内皮的暂时性孔道渗出，作为内皮细胞迁移的临时基质，内皮细胞增殖迁移连成索状，最后形成新的毛细血管。因此，进行皮肤创伤修复的关键是促进血管再生，本发明中的药物通过靶向下调脂肪细胞中kindlin-2蛋白的表达，可以促进血管内皮细胞的增殖，进而促进皮肤血管再生。
22.在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括针剂、粉剂、片剂、胶囊剂、软膏剂、颗粒剂中的任一种。
23.在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物的剂型选择针剂，通过注射进行皮肤创伤修复。
24.在本发明的一些实施方式中，所述针剂的主要生物活性成分包括针对所述脂肪细胞中kindlin-2基因的敲低试剂或敲除试剂、针对所述脂肪细胞中kindlin-2蛋白的受体阻断试剂中的至少一种。
25.在本发明的一些实施方式中，所述敲低试剂包括靶向所述kindlin-2基因的shrna或sirna，以及载体。
26.在本发明的一些实施方式中，所述载体包括腺相关病毒载体(aav)、腺病毒载体、慢病毒载体、脂质体中的任一种。
27.在本发明的一些实施方式中，所述敲除试剂包括靶向所述kindlin-2基因的cre/loxp系统或crispr/cas系统的试剂。
28.在本发明的一些实施方式中，所述受体阻断试剂包括靶向所述kindlin-2蛋白的小分子化合物或多肽。
29.在本发明的一些实施方式中，所述针剂还包括人血白蛋白、甘油、甘露醇、水。
30.在本发明的一些实施方式中，所述人血白蛋白的质量体积比为0.01～0.1％。
31.在本发明的一些实施方式中，所述甘油的质量体积比为1～20％。
32.在本发明的一些实施方式中，所述甘露醇的质量体积比为0.1～10％。
33.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
34.本发明提出的药物可以靶向下调脂肪细胞中的kindlin-2基因或蛋白，以促进血管内皮细胞的增殖，进而促进血管的生成，血管生成的增加又可促进炎症消退、营养供应，从而可以加速皮肤愈合。适用于大面积皮肤创伤修复，无需进行皮肤移植。
附图说明
35.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
36.图1为本发明实施例1的western-blotting检测图；其中，wt代表kindlin-2
flox/flox
小鼠，ko代表adipoq
cre
；kindlin-2
flox/flox
小鼠，下同；gapdh作为内参基因；
37.图2为本发明实施例1中wt组和ko组小鼠背部皮肤创伤面的愈合情况和愈合率对比图；其中，a为在不同时间点两组小鼠的背部皮肤创伤面愈合情况照片图，b为在不同时间点两组小鼠背部皮肤创伤面的愈合率对比图；
38.图3为本发明实施例1中创伤面愈合10天时wt组和ko组小鼠创伤面周围皮肤组织的he染色图和创伤面直径统计图；其中，a为he染色图，标尺为2mm；b为皮肤创伤面直径统计图；
39.图4为本发明实施例2中创伤面愈合10天时wt组和ko组小鼠创伤面周围皮肤组织中cd31的免疫组化染色结果图。
具体实施方式
40.下面详细描述本发明的实施例，通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
41.本发明的描述中，除非另有明确的限定，培养、修复等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
42.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
43.实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
44.实施例1
45.本实施例测试了kindlin-2对小鼠皮肤创面愈合的影响，具体过程为：
46.1.利用cre-loxp靶向小鼠编辑技术，让adipoq-cre工具小鼠与kindlin-2flox小鼠杂交，得到adipoq
cre
；kindlin-2
flox/flox
小鼠，该小鼠脂肪细胞中的kindlin-2蛋白被特异性敲除。
47.将上述kindlin-2蛋白特异性敲除小鼠(简称ko小鼠)饲养到5月龄，取其脂肪干细胞，用胶原蛋白酶d(罗氏，货号1108874103，1g)和2.4u/ml的中性蛋白酶dispaseⅱ(罗氏，货号0494207801，0.980mg/ml)消化液，于37℃摇床上以150rpm的转速消化40～50min，每10～15min检查一次，以确保消化顺利并防止过度消化；消化结束后加入5ml完全培养基(dmem培养基，含10％胎牛血清(10％fbs)和1％青霉素/链霉素(1％p/s))终止消化，离心获得沉淀，即得小鼠原代脂肪干细胞。将细胞板放在胶原蛋白涂层培养皿(r&d)上，加入完全培养基(dmem+10％fbs+1％p/s)，将上述小鼠原代脂肪干细胞铺于细胞板上，1～2h后吸出培养基，用pbs洗两次，加入新鲜培养基，待细胞长满培养皿底部后，收细胞，并提取相应的总蛋白。
48.将上述总蛋白配制成样品，并取kindlin-2
flox/flox
小鼠总蛋白配制成样品作为对照，进行western-blotting检测，检测结果如图1所示。图1中，wt代表kindlin-2
flox/flox
小鼠，ko代表adipoq
cre
；kindlin-2
flox/flox
小鼠，以下出现的wt和ko都代表这两种小鼠；以gapdh作为内参基因，与wt组小鼠的脂肪干细胞中kindlin-2蛋白的表达相比，ko组小鼠的脂肪干细胞中kindlin-2蛋白的表达量显著降低，表明ko小鼠脂肪细胞中的kindlin-2蛋白敲除成功。
49.2.构建小鼠皮肤急性创伤模型：将wt组小鼠和ko组小鼠进行麻醉诱导后，将小鼠背侧的皮肤剃光，用75％的乙醇消毒，用皮肤打孔器和剪刀在小鼠背侧打孔，形成直径为8mm大小的圆形皮肤创伤面(这里的皮肤损伤为急性皮肤损伤)，分别在不同时间点(0、2、4、6和8天)观察两组小鼠皮肤创伤面的愈合情况，并拍照记录，对不同时间点的创伤面的愈合率进行统计，结果如图2所示。图2中，a为在不同时间点wt组小鼠和ko组小鼠的背部皮肤创伤面愈合情况照片图，可以看出随着时间的推移，两组小鼠的皮肤创伤面均在愈合，但是wt组小鼠的皮肤创伤面愈合速度显著慢于ko组小鼠皮肤创伤面的愈合速度；b为在不同时间点两组小鼠背部皮肤创伤面的愈合率对比图，可以看出随着时间的推移，两组小鼠皮肤创伤面的愈合率都是升高的，但是ko组小鼠的愈合率显著高于wt组小鼠的愈合率，与上述两组小鼠皮肤创伤面愈合情况一致。表明特异性敲除脂肪细胞中的kindlin-2蛋白，可以显著促进小鼠皮肤创伤面的愈合。
50.3.为进一步确认上述两组小鼠背部皮肤创伤面的愈合情况和愈合速度，分别取愈合10天时wt组小鼠和ko组小鼠背部皮肤创伤面周围的皮肤组织，经包埋、切片后进行组织学分析，组织切片通过苏木素-伊红(he)染色观察创伤面修复情况。方法是将组织切片用pbs洗三次，切片入苏木素染液中染色5min，pbs洗三次，1％的盐酸酒精分化2s，pbs洗三次，0.6％氨水返蓝，pbs洗三次，切片入伊红染液中染色1min，将切片依次放入90％酒精1min，95％酒精5min，无水乙醇1min，二甲苯1min中脱水透明，将切片从二甲苯中拿出晾干，中性树胶封片，光学显微镜观察，结果如图3所示。图3中，a为愈合10天时两组小鼠背部皮肤创伤面周围皮肤组织的he染色图，可以看出，与wt组小鼠相比，ko组小鼠皮肤创伤面缩小明显，存在明显的肉芽组织，且皮肤结构更完整；b为a中两组皮肤组织的创伤面的直径对比图，可以看出ko组小鼠背部皮肤创伤面的直径明显小于wt组的。表明特异性敲除脂肪细胞中的
kindlin-2蛋白后，显著提高了皮肤创伤面的修复速度，使皮肤结构更完整。进一步证实了上述敲除脂肪细胞中的kindlin-2蛋白对皮肤创伤面愈合情况和愈合速度的影响。
51.实施例2
52.本实施例测试了kindlin-2对皮肤血管再生的影响，具体过程为：
53.取实施例1中愈合10天的wt组和ko组雄性小鼠创伤面周围的皮肤组织，经石蜡包埋，切片，用dapi对细胞核进行染色，用兔抗cd31(血小板-内皮细胞粘附分子)的抗体孵育，再用辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔的igg)进行染色，以检测cd31的表达情况，结果如图4所示。图4显示，ko组小鼠创伤面周围的皮肤组织中的染色细胞显著多于wt组小鼠的，即ko组小鼠创伤面周围的皮肤组织中的cd31阳性细胞(血管内皮细胞)显著多于wt组小鼠的，表明特异性敲除脂肪细胞中的kindlin-2蛋白可促进小鼠血管内皮细胞的增殖，进而促进皮肤血管再生，而血管再生增加对于炎症消退和营养供应有促进作用，进而可加速皮肤愈合。
54.因此，以上表明敲除脂肪细胞中的kindlin-2蛋白，可以促进血管内皮细胞的增殖，以促进皮肤血管再生，进而促进皮肤愈合。
55.综上，以脂肪细胞中的kindlin-2作为靶点制备的药物或注射针剂对皮肤创伤修复会有显著的效果。
56.实施例3
57.本实施例制备了一种用于皮肤创伤修复的针剂：
58.其主要生物活性成分为受体阻断试剂，具体为靶向脂肪细胞中kindlin-2蛋白的多肽；
59.用于皮肤创伤修复的针剂还包括人血白蛋白、甘油、甘露醇和注射用水。
60.取1g甘油、100mg甘露醇溶于10ml灭菌注射用水中，混匀。取2mg人血白蛋白，适量受体阻断试剂，溶于上述溶液中。震荡混匀，0.22μm过滤器过滤，制成针剂，通过注射进行皮肤创伤修复。
61.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。