一种免疫调节性组织修复杂化纤维支架及其制备方法

1.本发明属组织修复材料领域，涉及免疫调节性组织修复杂化纤维支架及其制备方法。


背景技术：

2.颅骨缺损是临床上常见的骨缺损之一，患者需经过去骨瓣减压和颅骨成形术来修复颅骨。然而传统的修复材料，例如自体骨和钛网，由于面临二次局部创伤以及生物不可降解性，很难达到理想的颅骨缺损修复效果。而多相骨组织工程支架则面临着成分之间不协调，界面整合较差的问题，这会导致修复效果不佳。此外，外源性干细胞和生长因子由于潜在的不可控临床风险和严格的审批程序，其进一步临床应用受到了限制。因此，开发柔性、可降解、具有良好骨诱导性，在填充到颅骨缺损部位后能够有效加速颅骨组织再生的支架材料，仍然面临着巨大的挑战。
3.无细胞/生长因子的支架启动的骨再生依赖于复杂的材料-主体相互作用，包括初始的免疫调控与修复型细胞的募集以及分化。其中，合理的早期炎症反应有利于免疫细胞迁移至受损区域来改造免疫微环境。巨噬细胞作为一种快速募集和长效起作用的免疫细胞，不仅可以发挥细菌的吞噬作用，而且可以根据创伤局部微环境来改变其m1(促炎)和m2(抗炎)细胞表型。研究表明，巨噬细胞m1向m2型转变有利于抑制早期的炎症反应，减少持续性炎症带来的组织受损。同时，在此过程中分泌的趋化因子和功能性生长因子有利于修复型细胞(例如，内皮细胞，成纤维细胞和干细胞等)的募集以及随后的成骨/成血管分化。这种天然的免疫调节行为对于骨愈合至关重要。已经有研究利用整合外源性因子(il-10，il-4等)或者功能性蛋白等物质(外泌体，募集肽)实现了巨噬细胞m2极化以及干细胞募集。然而，潜在的不可控风险包括因子风暴以及超生理剂量生长因子带来的不良的脱靶效应限制了其临床推广。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种免疫调节性组织修复杂化纤维支架及其制备方法，以赋予组织修复材料免疫调节性，通过该支架来调节植入部位的免疫微环境，引导巨噬细胞m2表型极化并分泌相关因子来促进内源性干细胞募集，提高其骨修复性能。
5.为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种免疫调节性组织修复杂化纤维支架，该支架的基体材料是由多巴胺修饰的高分子、i型胶原以及巯基化改性羟基磷灰石在ph值为7.4～7.8的条件下反应形成的杂化交联高分子，该支架具有相互贯通的多孔结构；将该支架植入体内后，该支架能调节植入部位的免疫微环境，引导巨噬细胞m2表型极化，并促进植入部位成骨因子和成血管生长因子的分泌；
7.所述巯基化改性羟基磷灰石是由氨基改性的羟基磷灰石的氨基与含羧基和巯基
的高分子的羧基通过酰胺反应形成的；所述杂化交联高分子由多巴胺修饰的高分子氧化自交联，巯基化改性羟基磷灰石氧化自交联，多巴胺修饰的高分子与i型胶原通过迈克尔加成反应，多巴胺修饰的高分子与巯基化改性羟基磷灰石通过迈克尔加成反应，以及i型胶原与巯基化改性羟基磷灰石通过迈克尔加成反应形成。
8.上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的技术方案中，将该支架植入体内后，支架能促进植入部位包括骨钙素(ocn)和血管内皮生长因子(vegf)在内的内源性生长因子的分泌，这些内源性生长因子的分泌以及分泌程度的增加，可促进内源性干细胞募集，从而加速对骨组织的修复和重塑。
9.上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的技术方案中，所述多巴胺修饰的高分子包括多巴胺修饰的透明质酸、多巴胺修饰的肝素、多巴胺修饰的壳聚糖、多巴胺修饰的海藻酸钠、多巴胺修饰的聚乙二醇和多巴胺修饰的聚乙烯醇中的任意一种。
10.进一步地，所述多巴胺修饰的高分子优选为多巴胺修饰的透明质酸，多巴胺修饰的透明质酸的结构如式(i)所示，多巴胺修饰的透明质酸中，多巴胺的接枝率为5％～60％，多巴胺的接枝率优选为5％～20％，
[0011][0012]
上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的技术方案中，所述含羧基和巯基的高分子优选为巯基化透明质酸，巯基化透明质酸的结构如式(ii)所示，巯基化透明质酸中巯基的接枝率为12％～70％，
[0013][0014]
进一步地，在制备巯基化透明质酸以及多巴胺修饰的透明质酸时，作为改性基础的透明质酸的分子量为0.1～400wda，优选为8.9～200wda。
[0015]
一种可行的多巴胺改性的透明质酸的制备方法如下：
[0016]
将透明质酸钠溶解在事先脱气完全的磷酸盐缓冲溶液中，随后将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺分别溶解在水中，将n-羟基琥珀酰亚
胺溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液先后滴加至透明质酸钠溶液中，搅拌反应2～4h，向所得混合液中加入盐酸多巴胺水溶液，搅拌反应12～24h，在两次搅拌反应过程中，控制ph值在5.0～5.5范围内，该步骤的所有操作均在氮气保护下进行。将所得反应液透析纯化，冷冻干燥，即得。
[0017]
作为可选方案，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为(5～6):(2～3):(3～4):1，盐酸多巴胺水溶液的浓度为2～5mmol/l，透明质酸钠水溶液的浓度为10～100mg/ml。
[0018]
上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的技术方案中，所述巯基化改性羟基磷灰石是由氨基改性的羟基磷灰石与含羧基和巯基的高分子按照(1～3):1的质量比通过酰胺反应形成的；其中，氨基改性的羟基磷灰石为硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷改性的羟基磷灰石，一种可行的氨基改性的羟基磷灰石的结构如式(iii)所示：
[0019][0020]
一种可行的巯基化改性羟基磷灰石为按照cn 111498822 b中的方法制备的巯基化改性羟基磷灰石，优选的巯基化改性羟基磷灰石为按照cn 111498822 b中的方法制备的巯基化透明质酸修饰的羟基磷灰石。
[0021]
上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的技术方案中，所述i型胶原可以是以动物皮、肌腱或尾腱为原料制备的i型胶原。
[0022]
上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的技术方案中，所述支架优选由多巴胺修饰的高分子、i型胶原以及巯基化改性羟基磷灰石按照(0.5～3):(0.5～3):(1～6)的质量比反应形成。
[0023]
上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的技术方案中，所述相互贯通的多孔结构的孔径在微米级范围内，其平均孔径优选在50～500μm范围内。
[0024]
本发明还提供了一种上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
[0025]
将多巴胺修饰的高分子溶解于巯基化改性羟基磷灰石分散液中，形成混合液，然后将i型胶原溶液加入所述混合液中，充分混合形成反应液，然后调节反应液的ph值至7.4～7.8，充分静置交联，得到杂化交联水凝胶，冷冻干燥，即得免疫调节性组织修复杂化纤维支架；
[0026]
控制反应液中多巴胺修饰的高分子、i型胶原以及巯基化改性羟基磷灰石的质量比为(0.5～3):(0.5～3):(1～6)。
[0027]
上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的制备方法中，巯基化改性羟基磷灰石分
散液是将巯基化改性羟基磷灰石均匀分散在水中形成的，该分散液中，巯基化改性羟基磷灰石的浓度优选为10～100mg/ml。
[0028]
上述免疫调节性组织修复杂化纤维支架的制备方法中，i型胶原溶液是将i型胶原溶解在醋酸中形成的，i型胶原的浓度优选为5～50mg/ml。所述醋酸优选为浓度为0.5～1mol/l的醋酸水溶液。
[0029]
本发明通过多酚介导的界面整合作用将多巴胺修饰的高分子、i型胶原以及巯基化改性羟基磷灰石这三种基质成分进行融合来制备杂化纤维支架。因多巴胺修饰的高分子中具有邻苯二酚结构，一方面，该邻苯二酚基团具有高度的化学反应活性，可通过化学作用及物理作用与i型胶原和巯基化改性羟基磷灰石之间相互作用，以实现各组分在分子水平的界面整合，形成仿生骨基质成分和结构；另一方面，该多酚结构的引入赋予了支架免疫调节性能。
[0030]
该杂化纤维支架中保留了大量仿生骨基质的活性基团，例如，酚羟基、氨基等，结合其高孔隙率的多孔结构，可促进营养物质的传输及细胞的锚定和迁移，有利于细胞渗透和新生组织长入，并使得该杂化纤维支架具有良好的蛋白吸附性能。再结合其免疫调节性能，使得该杂化纤维支架可以实现对植入部位免疫微环境的调控，引导巨噬细胞m2表型极化，并促进植入部位成骨因子和成血管生长因子的分泌，从而为内源性干细胞的募集提供合适的微环境，并进一步促进其粘附、铺展、增殖以及向成骨和成血管分化，最终在不需引入外源性生长因子或外源性细胞的情况下实现组织修复，特别是骨组织的修复和重塑。
[0031]
本发明通过体外实验证实：
[0032]
(1)本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架具有适当的溶胀性能，在水中达到溶胀平衡时，溶胀率在107％左右，不容易引起填充部位发生较大的形变；同时支架具有良好的生物相容性和生物可降解性，在含透明质酸酶和i型胶原酶的混合酶降解液中降解125h后，仍然有70％左右的质量保留，具有一定的结构稳定性，该特性有利于支架在植入初期起到支撑作用，在植入后期逐渐降解，发挥有利于细胞的黏附、生长及组织再生等功能。
[0033]
(2)本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架，由于其上的邻苯二酚基团可与蛋白质上的-nh2和-sh发生迈克尔加成反应，因而具有良好的蛋白吸附能力，这也有利于该支架在体内组织修复时发挥更好的生物学功能。
[0034]
(3)本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架具有良好的生物相容性，该支架在与细胞体外共培养一段时间后，表现出明显的黏附支架生长的特征，说明该支架有利于细胞的粘附与增殖。
[0035]
本发明通过动物实验证实：
[0036]
(1)本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架可以引导巨噬细胞m2表型极化，并促进ocn和vegf的分泌，能更好地募集内源性干细胞。
[0037]
(2)本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架在植入兔子颅骨缺损模型12周后，可完成对缺损颅骨的重塑，相对于对照试验组，形成了更多的新生骨组织，并且新生骨组织具有更高的骨密度，可加速颅骨缺损的修复。基于上述实验结果，本发明还提供了免疫调节性组织修复杂化纤维支架在组织修复，特别是骨组织修复中的应用。
[0038]
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
[0039]
1.本发明提供了一种免疫调节性组织修复杂化纤维支架，通过多酚介导的界面整合作用将多巴胺修饰的高分子、i型胶原以及巯基化改性羟基磷灰石这三种基质成分进行融合来制备杂化纤维支架。一方面，本发明利用多巴胺修饰的高分子中的多酚基团具有高度的化学反应活性，与i型胶原和巯基化改性羟基磷灰石之间的化学反应及物理作用，实现了各组分在分子水平的界面整合，形成了仿生骨基质的成分和结构，另一方面，多巴胺修饰的高分子的引入赋予了支架免疫调节性能。该支架在植入体内后，可为内源性干细胞的募集提供合适的微环境，并进一步促进其粘附、铺展、增殖，以及向成骨和成血管分化，最终在不需要引入外源性生长因子或外源性细胞的情况下实现组织修复。相对于现有的通过二硫键增强功能性纤维化杂化凝胶，本发明可以为组织修复提供更好的微环境，从而实现更高效和快速的组织修复。
[0040]
2.本发明提供的杂化纤维支架具有免疫调节性能，在不加外源细胞及生长因子条件下，能够通过调节植入部位的免疫微环境，引导巨噬细胞m2表型极化，促进骨钙素(ocn)以及血管内皮生长因子(vegf)的分泌，进而驱动内源性干细胞的募集，相比于含有外源性生长因子或外源性细胞的支架材料，本发明的支架可以降低外源性生长因子和细胞潜在的不可控临床风险。
[0041]
3.本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架具有相互贯通的多孔结构，其中含有的邻苯二酚基团可与蛋白质表面的氨基、巯基等官能团反应，这两方面的作用可赋予了该支架优异的蛋白吸附能力，因而，该支架可通过吸附更多的蛋白来促进细胞黏附生长和增殖以及向成骨和成血管分化，进而加速骨组织的修复和再生。
[0042]
4.本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架具有相互贯通的多孔结构，可以快速吸收植入部位周围的体液，具有一定止血功能。由于骨组织表面含有大量的氨基，在生理条件下，该支架中的邻苯二酚基团可与骨组织表面发生席夫碱反应及迈克尔加成反应，这有利于该支架在植入后在植入部位的粘附和保留，持续发挥功能性修复作用，从而改善现有骨组织修复材料存在的与宿主骨之间结合不紧密，界限分明的问题。
[0043]
6.本发明通过动物实验证实，将本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架在植入兔子颅骨缺损模型12周后，可完成对缺损颅骨的重塑，相对于以通过二硫键增强功能性纤维化杂化凝胶作为修复材料的对照试验组，本发明的支架在植入后体内后，在相同的时间内形成了更多的新生骨组织，并且新生骨组织具有更高的骨密度，可加速颅骨缺损的修复。
附图说明
[0044]
图1是ha及其衍生物的核磁氢谱图。
[0045]
图2是实施例2制备的hdsh和对比例1制备的hssh的sem图。
[0046]
图3的ab两图分别是hdsh的高分辨x射线光电子能谱s 2p扫描图和ha-dopa/col i复合物的n1s扫描图。
[0047]
图4是hdsh和hssh的体外溶胀性能测试结果。
[0048]
图5是hdsh和hssh的体外降解性能测试结果。
[0049]
图6是hdsh和hssh的体外蛋白吸附性能测试结果。
[0050]
图7是hdsh和hssh的体外细胞迁移实验transwell模型以及定性和定量结果。
[0051]
图8是hdsh和hssh与干细胞体外共培养1、3、7天后的cck-8细胞增殖测试结果。
[0052]
图9是hdsh和hssh与干细胞体外共培养14天后的细胞死活染色测试结果、f-actin/dapi染色测试结果以及细胞在支架上的铺展情况(sem图)。
[0053]
图10是hdsh和hssh植入小鼠肌肉内4周后的流式细胞术分析结果。
[0054]
图11是hdsh和hssh植入小鼠肌肉内4周后的切片染色分析结果。
[0055]
图12是hdsh和hssh植入兔子颅骨缺损模型1周后的cd73、cd105以及cd34免疫荧光染色分析结果。
[0056]
图13是hdsh和hssh是植入兔子颅骨缺损模型4周和12周后取出的材料的micro-ct测试结果(第一行)、x光射线图(第二行)和ct三维重建结果(第三行)。
[0057]
图14是hdsh和hssh植入兔子颅骨缺损模型4周和12周后的新生骨参数定量分析结果。
具体实施方式
[0058]
以下通过实施例对本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明保护的范围。
[0059]
下述实施例中，动物实验操作均在无菌环境下进行，且已通过四川大学伦理委员会批准。兔子临界颅骨缺损模型构建及手术植入方法如下：用戊巴比妥钠通过耳静脉注射方法对兔子进行麻醉。用手持牙科电钻在颅骨两侧钻取直径约10mm孔洞，钻取过程不断用生理盐水冲洗以去除渣滓和渗出血液同时降温，切忌钻孔过程伤及硬脑膜。用医用纱布初步止血，滴加生理盐水使其处于湿润状态。用一次性无菌弯镊将杂化纤维支架植入颅骨缺损处，手术线缝合，伤口擦拭碘伏，注射硫酸庆大霉素，放回笼内观察。
[0060]
实施例1
[0061]
本实施例中，制备多巴胺修饰的透明质酸(ha-dopa)，以及巯基修饰的透明质酸(ha-sh)，步骤如下：
[0062]
1.制备多巴胺修饰的透明质酸(ha-dopa)
[0063]
(1)向浓度为11.5mg/ml的透明质酸钠(mw＝340kda)水溶液中滴加浓度为46mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，滴加完毕后，再滴加浓度为150mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)溶液，搅拌反应2h，滴加浓度为2mmol/l的盐酸多巴胺水溶液，搅拌反应12h，两次搅拌反应过程中均控制ph值在5.0，该步骤的操作均在氮气保护下进行，edci、nhs、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为5:2:3:1；
[0064]
(2)将步骤(1)所得反应液用透析膜(mw＝3.5-8kda)在ph值为3.5的超纯水中透析48h，真空冷冻干燥，即得ha-dopa，保存于干燥器中备用。
[0065]
通过调整edci、nhs、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比、透明质酸钠的分子量，可以改变多巴胺的接枝率。
[0066]
2.制备巯基修饰的透明质酸(ha-sh)
[0067]
将制备ha-dopa时采用的原料盐酸多巴胺替换为半胱胺盐酸盐，参照ha-dopa的制备方法，可以制备得到ha-sh。通过调整edci、nhs、半胱胺盐酸盐与透明质酸钠上的羧基的
摩尔比、透明质酸钠的分子量，可以改变巯基的接枝率。
[0068]
通过核磁氢谱(图1)来确定ha-dopa中多巴胺官能团的接枝率，以及ha-sh中巯基官能团的接枝率，巯基和多巴胺的特征峰出现在2.82,6.71,6.78ppm,通过计算得到ha-dopa中多巴胺的接枝率为16％，ha-sh中巯基的接枝率为31.5％。
[0069]
实施例2
[0070]
本实施例中，制备免疫调节性组织修复杂化纤维支架，步骤如下：
[0071]
(1)以实施例1制备的ha-sh为基础，按照cn 111498822 b实施例3的方法制备巯基化透明质酸修饰的羟基磷灰石(hap-ha-sh)，将hap-ha-sh均匀分散在去离子水中，得到浓度为60mg/ml的hap-ha-sh分散液。将i型胶原(col i)溶解在0.5mol/l的醋酸溶液中，得到浓度为30mg/ml的col i溶液。
[0072]
(2)将实施例1制备的ha-dopa加入hap-ha-sh分散液中，充分涡旋振荡使ha-dopa溶解形成混合液，然后将col i溶液在搅拌下缓慢滴加至所述混合液中形成反应液，该反应液中，ha-dopa、col i与hap-ha-sh的质量比为1:1:2；然后用1mol/l的naoh溶液调节所述反应液的ph值至7.5，迅速转移至硅胶模具中(直径8mm、高度2mm)，静置24h，使反应液中的各组分之间充分交联，得到杂化交联水凝胶，冷冻干燥并脱模，即得免疫调节性组织修复杂化纤维支架(记作hdsh)。
[0073]
通过扫描电镜观察本实施例制备的hdsh的微观形貌，结果如图2的(b)图所示，hdsh具有相互贯通的多孔结构，平均孔隙尺寸约为100μm，并且具有高的孔隙率，该结构有利于营养物质的输送以及细胞的生长。同时，通过x射线光电子能谱来确认其内部杂化交联方式，结果如图3的a图所示，hdsh中检测到*s-s(163.06ev)and*c-s(164.61ev)信号，说明hap-ha-sh与ha-dopa之间通过迈克尔加成反应相互键合。
[0074]
另外图3的b图显示，*nh2(399.84ev),*nh
3+
(401.49ev),*c＝n(398.37ev),*co-nh(399.56ev),*c-nh-c(401.09ev)五种信号在ha-dopa/col i复合支架(与hdsh的制备方法基本相同，只是制备是不添加hap-ha-sh)中被检测到，说明col i与ha-dopa之间是通过迈克尔加成反应和席夫碱反应进行交联的。
[0075]
对比例1
[0076]
本实施例中，以实施例1制备的ha-sh为基础，按照cn 111498822 b中实施例1步骤(3)(4)的操作制备氨基改性的羟基磷灰石，按照cn 111498822 b中实施例2的方法制备巯基化透明质酸，按照cn 111498822 b中实施例7的方法制备尺寸与hdsh一致的支架材料(需要冷冻干燥)，将制备的支架材料记作hssh。
[0077]
通过扫描电镜观察本对比例制备的hssh的微观形貌，结果如图2的(a)图所示，hssh也具有相互贯通的多孔结构。
[0078]
实施例3
[0079]
本实施例中，测试实施例2制备的hdsh以及hssh的溶胀行为及降解行为。
[0080]
(1)将实施例2制备的hdsh干燥，并测量其直径，记作d0。然后将hdsh浸没于2ml up水(超纯水)中，在转速为90rpm、温度为37℃的恒温振荡器中摇动，使其溶胀。每间隔一定时间测量一次溶胀后的hdsh的直径，记作ds，直到hdsh达到溶胀平衡。每个样品均设置三组平行试验。
[0081]
hdsh的溶胀率通过下式计算：溶胀率＝(ds-d0)/d0×
100％，结果如图4所示。
[0082]
(2)参照步骤(1)的操作测试hssh的溶胀率，结果如图4所示。
[0083]
(3)使用混合酶降解液检测hdsh的酶促降解行为。称量hdsh初始重量，记作wo，将支架浸没于2ml含1000u透明质酸酶、500u i型胶原酶的pbs缓冲液中，在转速为90rpm、温度为37℃的恒温振荡器中摇动。每间隔一定时间取出干燥称重，记作wk，直到hdsh完全降解。每个样品均设置三组平行试验。
[0084]
hdsh的降解率通过下式计算：降解率＝(w
o-wk)/wo×
100％，结果如图5所示。
[0085]
(4)参照步骤(3)的操作测试hssh的溶胀率，结果如图5所示。
[0086]
从图4可以看出，hdsh的溶胀程度较hssh略大，hdsh的最大溶胀率在107％左右，溶胀性能适中，不会引起填充部位较大的形变。从图5可以看出，在混合酶降解液中，hdsh的降解速率较hssh略快，hdsh在降解125h后仍有70％左右的质量保留，表明hdsh具有一定的结构稳定性，这对于其在植入体内之后发挥功能至关重要。
[0087]
实施例4
[0088]
本实施例中，在体外探究实施例2制备的hdsh和对比例1制备的hssh的蛋白吸附性能。
[0089]
(1)将hdsh称重，浸没于2ml的dmem培养基(含有10％胎牛血清)中进行蛋白吸附，3h后取出，用pbs缓冲液清洗3次，然后浸没在吐温-20洗涤剂中进行蛋白的脱吸附，最后用bca试剂盒测定蛋白吸附量，结果如图6所示。
[0090]
(2)参照步骤(1)的操作测试hssh的蛋白吸附量，结果如图6所示。
[0091]
从图6可以看出，相对于hssh，hdsh的蛋白吸附量更大，这是由于多巴胺上的邻苯二酚基团可与蛋白质上的-nh2和-sh发生迈克尔加成反应，因此hdsh可以更好地在体内外吸附蛋白，从而使其具有更好的生物学功能。
[0092]
实施例5
[0093]
本实施例中，以实施例2制备的hdsh和对比例1制备的hssh为基础，考察两组支架在体外诱导干细胞迁移的情况。
[0094]
(1)将干细胞按照1
×
104个/孔的浓度配置细胞悬浮液，并将其加在transwell小室的上方。同时，将两组支架放置于transwell小室的下方(如图7的a图所示)。以未放置任何支架的情况作为空白组(blank)。24小时后，用棉棒擦除小室上方未迁移的细胞，并用结晶紫染液对细胞进行染色来观察两组支架在体外诱导干细胞迁移的情况。结果如图7的c图所示。
[0095]
图7的b图是blank组和两组支架体外诱导干细胞迁移的定量测试结果。由图7可知，hdsh相对于hssh能更好地促进了干细胞的迁移，说明hdsh能够更好的募集干细胞。
[0096]
实施例6
[0097]
本实施例中，以实施例2制备的hdsh和对比例1制备的hssh为基础，构建细胞-支架的二维共培养模型，考察细胞在其中的增殖情况。
[0098]
(1)将实施例2制备的hdsh置于超低粘附24孔板中，吸取20μl 2.5
×
105/ml的兔子骨髓间充质干细胞(mscs)悬浮液滴加到hdsh表面，在细胞培养箱中孵育30min后，往hdsh的另外一面滴加20μl 2.5
×
105/ml的mscs细胞悬浮液，随后转移至细胞培养箱中孵育3h，得到细胞-hdsh支架二维共培养模型。
[0099]
向24孔板中加入培养基，然后将细胞-hdsh支架二维共培养模型置于培养基中，放
置在细胞培养箱中进行培养，每2天更换一次新的培养基。此处使用的培养基为补充有10％血清和1％双抗的α-mem或高糖dmem培养基。在培养1d、3d、7d、14d后，分别将细胞-hdsh支架二维共培养模型取出，用pbs缓冲液清洗去表明未粘附的细胞，对培养1、3、7天的二维共培养模型进行cck-8细胞增殖测试，对共培养14天的二维共培养模型进行细胞死活染色测试、f-actin/dapi染色测试并用sem观察细胞在支架上的铺展情况，结果如图8～9所示。
[0100]
(2)参照步骤(1)的操作，构建细胞-hssh支架二维共培养模型，并考察其中的增殖情况，结果如图8～9所示。
[0101]
图8是细胞-hdsh支架二维共培养模型和细胞-hssh支架二维共培养模型在体外共培养1、3、7天后的cck-8细胞增殖测试结果。由图7可知，hdsh和hssh均无细胞毒性并促进了细胞增殖，并且，细胞在hdsh上的增殖更加明显。
[0102]
图9中从左至右的三组图分别为共培养14天后的细胞死活染色测试结果、f-actin/dapi染色测试结果以及细胞在支架上的铺展情况。由图9可知，对于细胞-hdsh支架二维共培养模型和细胞-hssh支架二维共培养模型，在共培养14天后，没有观察到死细胞的存在，表现出良好的生物相容性；细胞骨架染色及sem图像表明，相对于hssh，hdsh上具有更多的细胞，并且表现出更明显的粘附支架生长的形貌特征。说明相比于hssh，hdsh可更好地促进干细胞的粘附与增殖。
[0103]
实施例7
[0104]
本实施例中，将实施例2制备的hdsh和对比例1制备的hssh分别植入小鼠体肌肉中，植入后培养4周，随后取出材料进行流式细胞术分析及切片染色分析，结果如图10和图11所示。
[0105]
从图10中的流式细胞术分析结果可以看出，相对于hssh，hdsh中巨噬细胞m1比例显著降低。从图11中的切片染色结果可以看出，hdsh中存在更多的巨噬细胞m2(cd206
+
)阳性着色，以及骨钙素(ocn)和血管内皮生长因子(vegf)的分泌。这些结果表明hdsh可以引导巨噬细胞m2表型极化，并分泌ocn以及vegf。
[0106]
实施例8
[0107]
将实施例2制备的hdsh和对比例1制备的hssh分别植入兔子临界颅骨缺损模型(直径为10mm)。植入1周后取出支架，进行cd73、cd105以及cd34免疫荧光染色分析，结果如图12所示。
[0108]
从图12可以看出，clsm图片显示粘附在hdsh上的大多数细胞对cd73以及cd105呈阳性，对cd34呈阴性，相对而言，粘附在hssh上的细胞对cd73呈阳性的更少，对cd105和cd34呈阴性，这表明hdsh能更好地募集内源性干细胞，且细胞有明显的粘附生长。
[0109]
实施例9
[0110]
将实施例2制备的hdsh和对比例1制备的hssh分别植入兔子临界颅骨缺损模型(直径为10mm)，将植入hdsh的实验组记作hdsh组，将植入hssh的实验组记作hssh组。以未植入任何材料的兔子临界颅骨缺损模型作为空白对照组，记作blank组。分别在植入4周和12周后取出材料，进行x光射线检测以及micro-ct测试。。
[0111]
图13的(a)(b)两图分别是植入4周和12周后取出的材料的中x光射线图(第一行)、micro-ct测试结果(第二行)和ct三维重建结果(第三行)。由图13可知，在植入体内12周时，hdsh组和hssh组中的颅骨缺损处均有新生骨组织填充，且新生骨组织与缺损边界骨整合效
果较好，无明显的缝隙，由ct三维重建结果可知，hdsh组在植入体内4周和12周后，缺损处有更多的新骨形成。
[0112]
图14是植入体内4周和12周后的新生骨参数定量分析结果，其中的ab两图是植入4周后新生骨占总体积的百分比(av/tv)和骨密度，cd两图是植入12周后新生骨占总体积的百分比(av/tv)和骨密度。由图14的ac两图可知，hdsh组在植入4周和12周后都具有更高的新生骨占比，由图14的bd两图可知，在植入4周后，hssh组的骨密度与blank组的骨密度基本一致，而hdsh组具有更高的骨密度，在植入12周后，虽然hssh组的骨密度与blank组的骨密度出现了差异，但仍然低于hdsh组。也就是说，相比hssh组和blank组，hdsh组在植入体内后，缺损处再生出的骨组织具有更高的密度，并且再生速度更快。以上这些实验结果表明hdsh可以加速颅骨缺损再生重塑。
[0113]
实施例10
[0114]
本实施例中，制备免疫调节性组织修复杂化纤维支架，步骤如下：
[0115]
(1)以实施例1制备的ha-sh为基础，按照cn 111498822 b实施例3的方法制备巯基化透明质酸修饰的羟基磷灰石(hap-ha-sh)，将hap-ha-sh均匀分散在去离子水中，得到浓度为10mg/ml的hap-ha-sh分散液。将i型胶原(col i)溶解在0.5mol/l的醋酸溶液中，得到浓度为50mg/ml的col i溶液。
[0116]
(2)将实施例1制备的ha-dopa加入hap-ha-sh分散液中，充分涡旋振荡使ha-dopa溶解形成混合液，然后将col i溶液在搅拌下缓慢滴加至所述混合液中形成反应液，该反应液中，ha-dopa、col i与hap-ha-sh的质量比为3:3:5；然后用1mol/l的naoh溶液调节所述反应液的ph值至7.4，迅速转移至硅胶模具中，静置24h，使反应液中的各组分之间充分交联，得到杂化交联水凝胶，冷冻干燥并脱模，即得免疫调节性组织修复杂化纤维支架。
[0117]
实施例11
[0118]
本实施例中，制备免疫调节性组织修复杂化纤维支架，步骤如下：
[0119]
(1)以实施例1制备的ha-sh为基础，按照cn 111498822 b实施例3的方法制备巯基化透明质酸修饰的羟基磷灰石(hap-ha-sh)，将hap-ha-sh均匀分散在去离子水中，得到浓度为100mg/ml的hap-ha-sh分散液。将i型胶原(col i)溶解在0.5mol/l的醋酸溶液中，得到浓度为5mg/ml的col i溶液。
[0120]
(2)将多巴胺修饰的壳聚糖加入hap-ha-sh分散液中，充分涡旋振荡使多巴胺修饰的壳聚糖溶解形成混合液，然后将col i溶液在搅拌下缓慢滴加至所述混合液中形成反应液，该反应液中，多巴胺修饰的壳聚糖、col i与hap-ha-sh的质量比为0.5:0.5:1.5；然后用1mol/l的naoh溶液调节所述反应液的ph值至7.8，迅速转移至硅胶模具中，静置24h，使反应液中的各组分之间充分交联，得到杂化交联水凝胶，冷冻干燥并脱模，即得免疫调节性组织修复杂化纤维支架。
[0121]
实施例12
[0122]
本实施例中，制备免疫调节性组织修复杂化纤维支架，本实施例的操作与实施例11基本相同，不同之处仅在于将其中的多巴胺修饰的壳聚糖替换为多巴胺修饰的肝素，多巴胺修饰的肝素、col i与hap-ha-sh的质量比为0.5:0.8:1。
[0123]
实施例13
[0124]
本实施例中，制备免疫调节性组织修复杂化纤维支架，本实施例的操作与实施例
11基本相同，不同之处仅在于将其中的多巴胺修饰的壳聚糖替换为多巴胺修饰的海藻酸钠，多巴胺修饰的海藻酸钠、col i与hap-ha-sh的质量比为4:4:6。
[0125]
实施例14
[0126]
本实施例中，制备免疫调节性组织修复杂化纤维支架，本实施例的操作与实施例10基本相同，不同之处仅在于将其中的ha-dopa替换为多巴胺修饰的聚乙二醇，多巴胺修饰的聚乙二醇、col i与hap-ha-sh的质量比为2:3:4。
[0127]
实施例15
[0128]
本实施例中，制备免疫调节性组织修复杂化纤维支架，本实施例的操作与实施例2基本相同，不同之处仅在于将其中的ha-dopa替换为多巴胺修饰的聚乙烯醇，多巴胺修饰的聚乙烯醇、col i与hap-ha-sh的质量比为1:1:2.5。
[0129]
综上所述，本发明提供的免疫调节性组织修复杂化纤维支架有良好的生物相容性，可通过调节缺损部位免疫微环境引导巨噬细胞m2极化并分泌相关因子来促进内源性干细胞募集，能加速兔子颅骨缺损的组织重塑，是一种理想的骨组织修复支架。