一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法

1.本发明属于肝再生技术领域，具体地，涉及一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法及其制备工艺。


背景技术：

2.目前肝病的发病率正逐年增长，由于酗酒、糖尿病、血脂肪过高、体重过重、不良的饮食和作息习惯等原因，肝病已成为当今世界范围内一个重要的公共卫生问题。研究表明，许多肝病患者都存在肝脏再生功能障碍的现象，但肝脏再生的发病机理涉及多个环节和复杂的信号调控网络，二氢杨梅素，也称为氨苄蛋白酶，是一种在安培中发现的二氢黄酮醇类黄酮，其在藤茶中的含量可高达30％。它也分布在肉豆蔻科，苜蓿科，大戟科，伯氏菌科，豆科，苜蓿科和桫椤科植物中，其有效成分已经被证实具有多种药理作用，对肝再生具有良好的促进作用，括抗肿瘤，抗炎，抗氧化，抗酒精，抗病原体和血脂调节活性等，具有多靶点、多途径、多层次、多系统、多时限整体动态微调早调的作用特点，满足了调控肝再生多方面和复杂多变的需要，利用脏腑组织的自然愈合能力使脏腑组织的损伤得以再生修复，重建恢复脏腑组织的结构和功能。但与此同时，肝脏再生是一个复杂的生物进程，病理状态下肝脏再生的调控机制研究的进展较为缓慢，关于二氢杨梅素调控肝脏再生，其深入的分子机制也难以阐明。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法，通过二氢杨梅素调控mirna-155-5p/sirt1/vdac1正反馈环路以促进肝再生，缓解肝细胞衰老；操作方法为：建立小鼠的肝损伤模型，随后将肝损伤小鼠使用活性二氢杨梅素处理以改变关键蛋白表达，饲养七周后，再对小鼠肝脏进行检测。解决了现有技术中存在的使用中药促进肝再生深入的分子机制难以阐明之问题。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
5.一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法，通过二氢杨梅素调控mirna-155-5p/sirt1/vdac1正反馈环路以促进肝再生，缓解肝细胞衰老，包括以下步骤：
6.(1)建立小鼠的肝损伤模型；
7.将8-10周c57bl/6j雄性小鼠称重,按体重进行配对分组,每组6只；首先,均给予对照液体饲料适应5天；于第6天,造模组更换为含有5％酒精溶液的液体饲料，培养5天后，将造模组灌胃给予5g/kg乙醇,对照组给予等热量等体积糊精；9h后,处死并收取样本；实验期间,自由饮用液体饲料。
8.(2)取肝损伤小鼠，分别饲喂含有75和150mg/kg质量的二氢杨梅素，每日给予相同剂量对小鼠进行干预，饲养7周。
9.(3)对小鼠及肝脏进行检测：
10.a1、将不同剂量二氢杨梅素处理的小鼠分别腹腔注射10％水合氯醛麻醉，打开腹
腔取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，储存于新鲜的甲醇盐水中，用单面刹刀切成约2mm厚的切片，使用70％、95％和100％梯度的乙醇溶液脱水，在组织清洁剂中每4小时更换3次，直至透明。随后浸入融化的石蜡中进行包埋，得到石蜡切片；
11.a2、从腹主动脉取血，37℃水浴，保温30min,取出4℃冰箱放置30min,离心iomin,分取血清进行测定；
12.a3、用预冷的pbs冲洗组织，称重后将组织剪碎；将剪碎的组织和pbs缓冲液一起放入玻璃匀浆器中，加入蛋白酶抑制剂，在干冰上进行研磨；对匀浆进行超声破碎后，离心20分钟，取上清液，对组织匀浆进行测定；
13.进一步地，对小鼠肝脏进行检测的检测指标为：生化及病例指标、细胞衰老指标、肝再生指标和mirna-155-5p/sirt1/vdac1正反馈环路机制指标。
14.进一步地，a3步骤中，剪碎组织与pbs缓冲液的质量体积比为1g:9-10ml。
15.进一步地，a3步骤中，蛋白酶抑制剂与剪碎组织的质量比为1μl：1g。
16.本发明的有益效果：
17.本发明技术方案中，采用酒精液体饲料制作小鼠肝损伤模型，测量生化及病例指标、细胞衰老指标、肝再生指标和mirna-155-5p/sirt1/vdac1正反馈环路机制指标，通过血清学、组织病理学和分子生物学，并结合体外细胞实验和双荧光素报告基因等方法系统阐明二氢杨梅素阻断mir-155-5p/sirt1/vdac1正反馈环路促进肝细胞修复再生在分子、细胞和动物水平中作用机理和分子机制，为促进肝再生药物研究提供新的治疗靶标与策略。
具体实施方式
18.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1
20.一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法，包括以下步骤：
21.(1)建立小鼠的肝损伤模型：
22.将8-10周c57bl/6j雄性小鼠称重,按体重进行配对分组,每组6只；首先,均给予对照液体饲料适应5天；于第6天,造模组更换为含有5％酒精溶液的液体饲料，培养5天后，将造模组灌胃给予5g/kg乙醇,对照组给予等热量等体积糊精；9h后,处死并收取样本；实验期间,自由饮用液体饲料。
23.(2)取肝损伤小鼠，分别饲喂含有75和150mg/kg质量的二氢杨梅素，每日给予相同剂量对小鼠进行干预，饲养7周。
24.(3)对小鼠及肝脏进行检测，包括以下步骤：
25.a1、将不同剂量二氢杨梅素处理的小鼠分别腹腔注射10％水合氯醛麻醉，打开腹腔取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，储存于新鲜的甲醇盐水中，用单面刹刀切成约2mm厚的切片，使用70％、95％和100％梯度的乙醇溶液脱水，在组织清洁剂中每4小时更换3次，直至透明。随后浸入融化的石蜡中进行包埋，得到石蜡切片；
26.a2、从腹主动脉取血，37℃水浴，保温30min,取出4℃冰箱放置30min,离心iomin,
分取血清进行测定；
27.a3、用预冷的pbs冲洗组织，称重后将组织剪碎；将2g剪碎的组织和20mlpbs缓冲液一起放入玻璃匀浆器中，加入2μl蛋白酶抑制剂，在干冰上进行研磨；对匀浆进行超声破碎后，离心20分钟，取上清液，对组织匀浆进行测定；
28.实施例2
29.一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法，包括以下步骤：
30.(1)建立小鼠的肝损伤模型：
31.将8-10周c57bl/6j雄性小鼠称重,按体重进行配对分组,每组6只；首先,均给予对照液体饲料适应5天；于第6天,造模组更换为含有5％酒精溶液的液体饲料，培养5天后，将造模组灌胃给予5g/kg乙醇,对照组给予等热量等体积糊精；9h后,处死并收取样本；实验期间,自由饮用液体饲料。
32.(2)取肝损伤小鼠，分别饲喂含有150mg/kg质量的二氢杨梅素，每日给予相同剂量对小鼠进行干预，饲养7周。
33.(3)对小鼠及肝脏进行检测，包括以下步骤：
34.a1、将不同剂量二氢杨梅素处理的小鼠分别腹腔注射10％水合氯醛麻醉，打开腹腔取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，储存于新鲜的甲醇盐水中，用单面刹刀切成约2mm厚的切片，使用70％、95％和100％梯度的乙醇溶液脱水，在组织清洁剂中每4小时更换3次，直至透明。随后浸入融化的石蜡中进行包埋，得到石蜡切片；
35.a2、从腹主动脉取血，37℃水浴，保温30min,取出4℃冰箱放置30min,离心iomin,分取血清进行测定；
36.a3、用预冷的pbs冲洗组织，称重后将组织剪碎；将2g剪碎的组织和20mlpbs缓冲液一起放入玻璃匀浆器中，加入2μl蛋白酶抑制剂，在干冰上进行研磨；对匀浆进行超声破碎后，离心20分钟，取上清液，对组织匀浆进行测定；
37.对比例1
38.一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法，包括以下步骤：
39.(1)建立小鼠的肝损伤模型：
40.将8-10周c57bl/6j雄性小鼠称重,按体重进行配对分组,每组6只；首先,均给予对照液体饲料适应5天；于第6天,造模组更换为含有5％酒精溶液的液体饲料，培养5天后，将造模组灌胃给予5g/kg乙醇,对照组给予等热量等体积糊精；9h后,处死并收取样本；实验期间,自由饮用液体饲料。
41.(2)取肝损伤小鼠，使用去离子水处理，饲养7周。
42.(3)对小鼠及肝脏进行检测，包括以下步骤：
43.a1、将不同剂量二氢杨梅素处理的小鼠分别腹腔注射10％水合氯醛麻醉，打开腹腔取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，储存于新鲜的甲醇盐水中，用单面刹刀切成约2mm厚的切片，使用70％、95％和100％梯度的乙醇溶液脱水，在组织清洁剂中每4小时更换3次，直至透明。随后浸入融化的石蜡中进行包埋，得到石蜡切片；
44.a2、从腹主动脉取血，37℃水浴，保温30min,取出4℃冰箱放置30min,离心iomin,分取血清进行测定；
45.a3、用预冷的pbs冲洗组织，称重后将组织剪碎；将2g剪碎的组织和20mlpbs缓冲液
一起放入玻璃匀浆器中，加入2μl蛋白酶抑制剂，在干冰上进行研磨；对匀浆进行超声破碎后，离心20分钟，取上清液，对组织匀浆进行测定；
46.对比例2
47.一种抑制肝细胞衰老和促进肝再生的方法，包括以下步骤：
48.(1)建立小鼠的肝损伤模型：
49.将8-10周c57bl/6j雄性小鼠称重,按体重进行配对分组,每组6只；首先,均给予对照液体饲料适应5天；于第6天,造模组更换为含有5％酒精溶液的液体饲料，培养5天后，将造模组灌胃给予5g/kg乙醇,对照组给予等热量等体积糊精；9h后,处死并收取样本；实验期间,自由饮用液体饲料。
50.(2)取肝损伤小鼠，用30％浓度酒精处理，饲养7周。
51.(3)对小鼠及肝脏进行检测，包括以下步骤：
52.a1、将不同剂量二氢杨梅素处理的小鼠分别腹腔注射10％水合氯醛麻醉，打开腹腔取肝脏，称重，计算肝脏指数，取一部分肝脏，储存于新鲜的甲醇盐水中，用单面刹刀切成约2mm厚的切片，使用70％、95％和100％梯度的乙醇溶液脱水，在组织清洁剂中每4小时更换3次，直至透明。随后浸入融化的石蜡中进行包埋，得到石蜡切片；
53.a2、从腹主动脉取血，37℃水浴，保温30min,取出4℃冰箱放置30min,离心iomin,分取血清进行测定；
54.a3、用预冷的pbs冲洗组织，称重后将组织剪碎；将2g剪碎的组织和20mlpbs缓冲液一起放入玻璃匀浆器中，加入2μl蛋白酶抑制剂，在干冰上进行研磨；对匀浆进行超声破碎后，离心20分钟，取上清液，对组织匀浆进行测定；
55.现在对实施例1-2与对比例1-2中小鼠肝脏的血清、组织和匀浆进行检测。
56.采用全自动生化分析仪测定小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)水平和总胆固醇(tg)水平。检测结果如表1所示：
[0057][0058]
从表1的结果来看，二氢杨梅素可以显著降低肝损伤小鼠血清中atl、ast和tg的含量，保持肝脏的健康状态。
[0059]
对现在对实施例1-2与对比例1-2中肝脏细胞的衰老程度进行测试。将新鲜肝脏组织在4％的多聚甲醛中固定4h，然后放置在染色盒中，加入β-半乳糖苷酶染色液，37℃摇床，慢速摇晃24h，然后将组织进行石蜡包埋，切片机切片，烤片后二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，用含有0.2％冰醋酸的伊红染液染色2分钟，脱水，透明，封片，显微镜下观察肝细胞中β-半乳糖苷酶活性。
[0060]
检测结果如表2所示：
[0061]
组别衰老细胞占比(％)实施例10.28实施例20.32对比例10.21对比例20.22
[0062]
从表2的结果来看，衰老的细胞可以表达β-半乳糖苷酶，酒精会导致肝细胞分裂能力减弱，通过与二氢杨梅素处理后的对比来看，二氢杨梅素可以抑制肝细胞的衰老。通过细胞计数板发现，使用二氢杨梅素处理后的样本中，细胞增值量较多，可以促进肝细胞的生长，从而促进肝再生。
[0063]
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0064]
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。