一种用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.退行性骨关节病又称骨关节炎、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎，是一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。本病多见于中老年人群，好发于负重关节及活动量较多的关节(如，颈椎、腰椎、膝关节、髋关节等)。过度负重或使用这些关节，均可促进退行性变化的发生。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。
3.骨关节炎的主要症状为关节疼痛，常为休息痛，表现为休息后出现疼痛，活动片刻即缓解，但活动过多后，疼痛又加剧。另一症状是关节僵硬，常出现在早晨起床时或白天关节长时间保持一定体位后。
4.透明质酸是构成关节软骨和滑液的主要成分，关节中的透明质酸主要是由滑膜细胞及单核吞噬细胞合成；滑液中的透明质酸对关节生理功能的发挥起着重要作用，透明质酸和糖蛋白使滑液具有润滑性和黏弹性，可降低软组织间及软骨间的摩擦，并能消除自由基。
5.目前，现有技术已有将透明质酸和间充质干细胞共同用于治疗骨关节炎中，例如专利申请号为201610271862.7的中国专利公开了一种使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物；该组合物能够提高干细胞的存活率，其具有一定的软骨损伤修复能力，但修复效果并不理想；因此，亟需一种具有更加优异的软骨损伤修复的组合物以满足市场需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物及其制备方法，本发明组合能够更好的促进干细胞成软骨分化并改善骨关节微环境，能够更好的修复软骨损伤，达到治疗骨关节炎/软骨损伤的目的。
7.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
8.本发明第一方面提供一种用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物，所述组合物包括脐带间充质干细胞、软骨干细胞外泌体和基质；
9.所述基质包括如下质量体积百分含量的组分：透明质酸2％～4％、白藜芦醇0.1％～0.5％、四甲基吡嗪0.01％～0.03％、麦芽糖醇0.1％～0.4％，余量为生理盐水。
10.优选地，所述脐带间充质干细胞浓度为1
×
105～1
×
107cells/ml。
11.优选地，所述软骨干细胞外泌体浓度为100～200μg/ml。
12.优选地，所述组合物包括脐带间充质干细胞、软骨干细胞外泌体和基质；
13.所述脐带间充质干细胞浓度为1
×
106cells/ml；所述软骨干细胞外泌体浓度为
150μg/ml；
14.所述基质包括如下质量体积百分含量的组分：透明质酸3％、白藜芦醇0.3％、四甲基吡嗪0.02％、麦芽糖醇0.3％，余量为生理盐水。
15.优选地，所述脐带间充质干细胞为第3代～第5代的脐带间充质干细胞。
16.优选地，所述透明质酸的分子量为20000～500000。
17.优选地，所述软骨干细胞外泌体通过如下方法制得：
18.(1)取3～5代人前软骨干细胞培养上清、离心，收集上清液置于冰上；
19.(2)向上清液中加入外泌体沉淀试剂并混匀、静置，再经离心，吸去上清，保留沉淀物；
20.(3)采用pbs重悬沉淀物，再经纯化，冷冻干燥，即得所述软骨干细胞外泌体。
21.本发明第二方面提供一种上述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
22.(a)将透明质酸、白藜芦醇和麦芽糖醇分别溶解于生理盐水中、灭菌，得到基质；
23.(b)将脐带间充质干细胞和软骨干细胞外泌体添加至基质中并混匀，即得所述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物。
24.优选地，所述步骤(b)中，基质温度为2～6℃。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
26.本发明组合物中透明质酸可以作为各物质的载体，同时能够降低软组织间的摩擦，再辅以软骨干细胞外泌体、白藜芦醇和四甲基吡嗪，有效消除自由基，改善关节内微环境、降低免疫反应，同时能够更好的促进脐带间充质干细胞的增殖和向软骨干细胞的分化，进而实现快速修复软骨损伤，因此，将本技术组合物能够有效治疗骨关节炎/软骨损伤，且效果显著。
具体实施方式
27.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
28.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
29.实施例1
30.本实施例为脐带间充质干细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
31.(1)超净工作台紫外照射30分钟，擦拭台面；
32.(2)将灭菌的实验器械放入工作台，点燃酒精灯，拿出一个肾形盘，倒入75％酒精一半，将脐带放进肾形盘中，消毒30秒；
33.(3)取一个50ml烧杯，倒入一半灭菌的pbs，将脐带放入烧杯中，反复洗3次；
34.(4)拿出另一个肾形盘，将脐带放入其中，倒入适量pbs，右手拿剪刀，左手拿普通镊子，将脐带剪成2cm左右的小段；
35.(5)左手拿止血钳，右手拿组织镊，慢慢的将脐带外皮和血管去掉；
36.(6)将剩余组织放入一个干净的烧杯中，用剪刀剪成大概3mm左右；
37.(7)用药勺将组织块铺在t75的瓶子里，每瓶100左右组织块，将所有组织块铺完；
38.(8)在t75瓶子一侧慢慢加入培养基15ml；放入co2培养箱孵育；
39.(9)48h换液一次，待一星期后观察干细胞爬出情况，若爬出情况较好，将组织块拍掉弃之，加入培养基；
40.(10)48h后消化细胞，加入1ml胰蛋白酶消化，收集离心(1200转，5分钟)，弃上清，加入培养基重悬细胞，根据细胞数量(1
×
106)接种细胞，即为p1代；
41.(11)48h后消化离心，计数，传代，得到p2～p5代细胞。
42.实施例2
43.本实施例为软骨干细胞外泌体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
44.(1)取3代人前软骨干细胞培养上清40ml，4000
×
g、4℃离心20min，去除细胞或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中，收集样本至于冰上；
45.(2)取10.0ml处理后的细胞培养上清放入15ml离心管中，加入1.25ml外泌体沉淀试剂，颠倒充分混匀后4℃静置30min；静置后的样品12,000
×
g，4℃离心30min，管底可见白色沉淀，吸去上清，注意不要破坏外泌体沉淀；
46.(3)外泌体重悬
47.加入100ul 1
×
pbs，用移液器反复吹打或漩涡混合均匀，彻底溶解沉淀，此重悬液中含有完整的外泌体；
48.(4)外泌体纯化
49.将重悬的外泌体转移至纯化柱，放入1.5ml收集管中3,000
×
g，4℃离心10min，弃掉纯化柱，收集管中为提取的外泌体，再经冷冻干燥，得到所述软骨外细胞泌体。
50.实施例3
51.本实施例为一种用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物，该组合物包括脐带间充质干细胞、软骨干细胞外泌体和基质；
52.其中，脐带间充质干细胞(第3代)浓度为1
×
107cells/ml；
53.软骨干细胞外泌体浓度为200μg/ml；
54.基质包括如下质量体积百分含量的组分：透明质酸4％、白藜芦醇0.1％、四甲基吡嗪0.01％、麦芽糖醇0.4％，余量为生理盐水。
55.上述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
56.(a)将透明质酸、白藜芦醇和麦芽糖醇分别溶解于生理盐水中、灭菌，得到基质；
57.(b)在4℃下，将脐带间充质干细胞和软骨干细胞外泌体添加至基质中并混匀，即得上述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物。
58.实施例4
59.本实施例为一种用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物，该组合物包括脐带间充质干细胞、软骨干细胞外泌体和基质；
60.其中，脐带间充质干细胞(第3代)浓度为1
×
105cells/ml；
61.软骨干细胞外泌体浓度为100μg/ml；
62.基质包括如下质量体积百分含量的组分：透明质酸2％、白藜芦醇0.5％、四甲基吡嗪0.03％、麦芽糖醇0.1％，余量为生理盐水。
63.上述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
64.(a)将透明质酸、白藜芦醇和麦芽糖醇分别溶解于生理盐水中、灭菌，得到基质；
65.(b)在4℃下，将脐带间充质干细胞和软骨干细胞外泌体添加至基质中并混匀，即得上述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物。
66.实施例5
67.本实施例为一种用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物，该组合物包括脐带间充质干细胞、软骨干细胞外泌体和基质；
68.其中，脐带间充质干细胞(第4代)浓度为1
×
106cells/ml；
69.软骨干细胞外泌体浓度为150μg/ml；
70.基质包括如下质量体积百分含量的组分：透明质酸3％、白藜芦醇0.3％、四甲基吡嗪0.02％、麦芽糖醇0.3％，余量为生理盐水。
71.上述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
72.(a)将透明质酸、白藜芦醇和麦芽糖醇分别溶解于生理盐水中、灭菌，得到基质；
73.(b)在4℃下，将脐带间充质干细胞和软骨干细胞外泌体添加至基质中并混匀，即得上述用于治疗骨关节炎/软骨损伤的组合物。
74.实验例1
75.本实验例为软骨干细胞外泌体、白藜芦醇和四甲基吡嗪对脐带间充质干细胞增殖的研究：
76.获得实施例1中的第3代脐带间充质干细胞和基础培养基的混悬液，脐带间充质干细胞浓度为1
×
106cells/ml，将200μl混悬液接种至96孔板中进行培养；
77.1、软骨干细胞外泌体添加量对脐带间充质干细胞增殖的影响；
78.对照组采用基础培养基，实验组，分别向基础培养基中添加至软骨干细胞外泌体浓度至50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml；分别设3个重复；
79.继续培养24h后，胰蛋白酶消化、离心，再采用基础培养基进行重悬，然后，使用细胞技术仪进行细胞计数，计数结果如表1所示：
80.表1
[0081][0082]
由表1结果可知：
[0083]
软骨干细胞外泌体的添加能够促进脐带间充质干细胞的增殖，并且随着浓度的增加能够更好的促进细胞增殖，当浓度达到200μg/ml相比150μg/ml增殖差别不大。
[0084]
2、白藜芦醇添加量对脐带间充质干细胞增殖的影响；
[0085]
对照组采用基础培养基，实验组，分别向基础培养基中添加至白藜芦醇质量浓度至0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％和0.7％；分别设3个重复；
[0086]
继续培养24h后，胰蛋白酶消化、离心，再采用基础培养基进行重悬，然后，使用细胞技术仪进行细胞计数，计数结果如表2所示：
[0087]
表2
[0088][0089][0090]
由表1结果可知：
[0091]
白藜芦醇添加能够促进脐带间充质干细胞的增殖，但随着浓度的增加，当浓度为0.3％时增殖效果达到最大，浓度继续增加则增殖效果减少。
[0092]
3、四甲基吡嗪添加量对脐带间充质干细胞增殖的影响；
[0093]
对照组采用基础培养基，实验组分别向基础培养基中添加四甲基吡嗪质量浓度至0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％；分别设3个重复；
[0094]
继续培养24h后，胰蛋白酶消化、离心，再采用基础培养基进行重悬，然后，使用细胞技术仪进行细胞计数，计数结果如表3所示：
[0095]
表3
[0096]
组别123对照组5.89*10^55.94*10^56.02*10^5实验组(0.01％)6.18*10^56.22*10^56.20*10^5实验组(0.02％)6.38*10^56.41*10^56.34*10^5实验组(0.03％)6.28*10^56.38*10^56.32*10^5实验组(0.04％)6.18*10^56.22*10^56.21*10^5实验组(0.05％)6.05*10^56.08*10^55.95*10^5
[0097]
由表1结果可知：
[0098]
四甲基吡嗪添加能够促进脐带间充质干细胞的增殖，当浓度为0.02％时增殖效果达到最大，虽浓度继续增加则增殖效果减少。
[0099]
4、分别按照上述软骨干细胞外泌体(150μg/ml)、白藜芦醇(0.3％)和四甲基吡嗪(0.02％)的最佳浓度向添加到基础培养基中进行培养，设3个重复；
[0100]
继续培养24h后，胰蛋白酶消化、离心，再采用基础培养基进行重悬，然后，使用细胞技术仪进行细胞计数，计数结果如表4所示：
[0101]
表4
[0102]
组别123实验组9.68*10^59.75*10^59.74*10^5
[0103]
由表4可知，本技术将上述软骨干细胞外泌体、白藜芦醇和四甲基吡嗪共同使用，能够显著促进细胞增殖，显著由于各组分单独使用。
[0104]
实验例2
[0105]
本实验例为软骨干细胞外泌体、白藜芦醇和四甲基吡嗪对脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究：
[0106]
获得实施例1中的第3代脐带间充质干细胞和基础培养基的混悬液，脐带间充质干细胞浓度为1
×
105cells/ml，将200μl混悬液接种至96孔板中进行培养；
[0107]
分组：对照组和实验组，实验组包括软骨干细胞外泌体组、白藜芦醇组、四甲基吡嗪组，以及软骨干细胞外泌体、白藜芦醇和四甲基吡嗪混合组；
[0108]
其中，对照组采用含有地塞米松、tgf-β3、抗坏血酸的基础培养进行培养；
[0109]
软骨干细胞外泌体组：
[0110]
具体实验方法：对照组和实验组细胞均为每2天换液1次，在连续培养的第16天用trigol收集两组细胞，采用rt-qpcr检测两组细胞acan、col2a1和sox-9基因表达；
[0111]
检测结果如表5所示：
[0112]
表5
[0113]
组别acancol2a1sox-9对照组1.02
±
0.121.08
±
0.151.04
±
0.11外泌体组1.89
±
0.181.96
±
0.222.32
±
0.11白藜芦醇组1.93
±
0.112.21
±
0.142.52
±
0.14四甲基吡嗪组1.72
±
0.211.95
±
0.242.35
±
0.18混合组2.89
±
0.242.74
±
0.202.95
±
0.25
[0114]
由表5可知：
[0115]
本技术外泌体组、白藜芦醇组以及四甲基吡嗪组相比对照组能够更好的促进细胞向软骨细胞分化，此外，混合物的促进效果更好，显著高于各单独组。
[0116]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。