一种包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料及其制备方法与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料及其制备方法。


背景技术：

2.水凝胶敷料是一种高含水量的吸水性高分子凝胶组成的新型伤口敷料，其内部带有强烈的亲水基团，对水有特殊吸附作用，通过分子间交联，形成网状结构。
3.壳聚糖（cs）是一种线性天然多糖，由几丁质的n-脱乙酰化衍生，从螃蟹和虾等甲壳类动物的外骨骼中获得。壳聚糖基的水凝胶敷料在创伤愈合过程中表现出良好的生物相容性和生物可降解性，同时还具有抑菌消炎、止血止痛、促进创面愈合、滋养修复粘膜、免疫调节活性的作用，已经在创伤和手术后伤口愈合、烧伤、痤疮治疗等领域有了广泛应用。
4.外泌体是指包含了复杂 rna 和蛋白质的小膜泡，其具有非免疫原性和废非致瘤性等优点，含有mrna、microrna、脂质和蛋白质等生物活性物质。研究显示，外泌体尤其是来自充质干细胞的外泌体有助于伤口愈合。干细胞外泌体中的表皮生长因子（egf），极微量即能强烈促进皮肤细胞的分裂和生长，此外，它还能刺激细胞外一些大分子（如透明质酸和糖蛋白等）的合成和分泌，滋润皮肤，促进皮肤新陈代谢，加快皮肤愈合；干细胞外泌体中的干细胞生长因子（hgf）可增加细胞活力，抑制络氨酸酶的活性，淡化色素、色斑；干细胞外泌体中的成纤维细胞生长因子（fgf）具有修复深层皮肤，淡化疤痕和痘印的作用；干细胞外泌体中的血管生长因子（mirna）促进血管内皮细胞生长，激活血管生长，修复血管恢复弹性，改善微循环，保障营养的运输及废弃物排除；此外，还有研究显示干细胞外泌体可应用于修复子宫内膜损伤。因此，有研究者试图将外泌体尤其是干细胞外泌体添加于水凝胶敷料。
5.作为敷料，药物的缓释控释尤为重要；然而，水凝胶材料内外溶剂交换频率高，在体液环境下药物很容易释放出去，难以很好地解决药物“突释”问题。外泌体不同于普通的分子药，其成分复杂，其缓释问题的解决也比一般药物更复杂，现有技术中还未出现理想的解决水凝胶敷料中外泌体“突释”问题的方案。此外，使用水凝胶敷料时，渗出液容易导致细菌繁殖，进而造成伤口感染，其抗菌性的改进也是一个研发的要点。


技术实现要素：

6.本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料及其制备方法，解决外泌体水凝胶敷料的缓释问题和抗菌问题。
7.具体技术方案如下：本发明的目的之一是提供一种包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料，其与现有技术的区别在于：包括敷料基质和包埋有外泌体的微球；所述的敷料基质包括壳聚糖或/和其衍生物；所述的微球基质包括醛基化海藻酸钠。
8.醛基化改性的海藻酸钠，可以通过醛基和壳聚糖的氨基形成动态希夫键，以此形成自愈合水凝胶和搭载微球，加强外泌体水凝胶敷料的缓释效果，改善其进入人体后的“突释”问题。
9.其中，醛基化海藻酸钠可通过海藻酸钠与高碘酸钠反应制备。
10.具体地，醛基化海藻酸钠的制备方法如下：将海藻酸钠充分溶解于去离子水中，加入高碘酸钠；海藻酸钠与高碘酸钠摩尔比优选为(1.5~2) :3；冰水浴的条件下，避光反应20~24h，于反应液中加入乙二醇终止反应；反应液加入nacl，混匀后醇沉，沉淀物抽滤、干燥、透析后低温真空干燥，得醛基化海藻酸钠。
11.进一步，所述的敷料基质包括壳聚糖衍生物，所述的壳聚糖衍生物为羧甲基胍基壳聚糖。
12.胍基壳聚糖是将壳聚糖的氨基进行胍基修饰，可提高其抗菌活性，并保持良好的生物相容性；壳聚糖通过羧甲基改性，可改良其水溶性和抗真菌性。
13.其中，羧甲基胍基壳聚糖可通过如下方法制备：将壳聚糖在碱性环境下和过量氯乙酸反应，修饰成羧甲基壳聚糖（cs）；将羧甲基壳聚糖溶于盐酸溶液中，壳聚糖分子中氨基在盐酸的作用下质子化制得壳聚糖盐酸盐；待壳聚糖溶解完全后，加入单氰胺，壳聚糖盐酸盐与胍基化试剂（单氰胺）在适当的反应条件下发生加成反应，即得羧甲基胍基壳聚糖（gcmc）。
14.具体地，羧甲基壳聚糖的制备方法如下：将壳聚糖加入浓度为300~400g/l的naoh溶液中，冰水浴搅拌使壳聚糖充分溶胀；将过量氯乙酸固体加入反应体系中，60℃~70℃加热搅拌，反应6~8h后,调节ph值至中性；naoh与氯乙酸的质量比优选为(0.3~0.6):1；壳聚糖与氯乙酸的质量比优选为1:(2~4)；抽滤、洗涤、真空烘干得到o-羧甲基壳聚糖。
15.具体地，羧甲基胍基壳聚糖合成方法如下：将之前获得的羧甲基壳聚糖溶于0.2~0.4 mol/l 的盐酸溶液中；待溶解完全后，加入单氰胺，80~90℃反应 2~4 h；羧甲基壳聚糖与单氰胺的质量比优选为1:(0.4~0.5)；反应产物透析后，冷冻干燥。
16.进一步，所述的敷料基质还包括交联剂，所述的交联剂为醛基化海藻酸钠。
17.再进一步，羧甲基胍基壳聚糖在敷料基质中的优选含量为15~25 mg/ml。
18.再进一步，敷料基质中，羧甲基胍基壳聚糖与醛基化海藻酸钠的质量比为1:(0.7~1.3)。
19.进一步，醛基化海藻酸钠在微球基质水溶液中的含量为0.5~2wt%。
20.进一步，水凝胶敷料中，包埋有外泌体的微球的用量为以敷料基质计0.3~0.6 mg/ml。
21.进一步，外泌体的用量优选以微球基质水溶液计不超过0.1wt%。
22.进一步，敷料基质或/和微球基质中还包括胶原蛋白。
23.胶原蛋白是肌体自然蛋白，对皮肤表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性，可降解吸收，粘着力好。由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度，又有可吸收性，在使用时既有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，又有较好的平滑性和弹性，缝合结头不易松散，操作过程中不易损伤机体组织，对创面有很好的黏附性，一般情况下只需较短时间的压迫就可达到满意的止血效果。
24.其中，胶原蛋白在敷料基质中的含量优选为2~5 mg/ml。
25.其中，胶原蛋白在微球基质水溶液中的含量优选地为0.1~0.4wt%。
26.其中，所述的胶原蛋白优选为鱼胶原蛋白。
27.其中，胶原蛋白的分子量优选为5000~10000。
28.进一步，所述的外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体。
29.本发明的目的之二是提供上述包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料的制备方法，其包括如下步骤：（1）制备外泌体微球：配置微球基质水溶液，将微球基质水溶液与外泌体混合，利用喷雾器制备外泌体微球；优选使用氯化钙溶液作为固定液；（2）配置除交联剂外的敷料基质与外泌体微球的混合液，再加入交联剂溶液，混合均匀，静置形成凝胶。
30.本发明的有益效果如下：本发明通过醛基化海藻酸钠微球与壳聚糖水凝胶基质的配合，解决了外泌体在水凝胶敷料中“突释”的问题，改进了外泌体水凝胶的缓释控释效果；同时，本发明通过对壳聚糖的修饰，改进了外泌体水凝胶敷料的抗菌效果。此外，除应用于伤口愈合、皮肤与血管生成，本发明的外泌体微球水凝胶敷料还可应用于皮肤护理和子宫内膜修复等方面。
附图说明
31.图1为本发明测试2中水凝胶敷料的外泌体释放曲线。
具体实施方式
32.以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
33.具体实施方式中：使用的壳聚糖购买厂家为麦克雷，分子量50000，脱乙酰度80%；使用的鱼胶原蛋白购买厂家为麦克雷，分子量8000。
34.实施例1一种包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料，其包括敷料基质和包埋有外泌体的微球；所述的敷料基质包括羧甲基胍基壳聚糖、鱼胶原蛋白和醛基化海藻酸钠和去离子水；所述的微球包括微球基质和人脐带间充质干细胞外泌体，所述的微球基质包括醛基化海藻酸钠、鱼胶原蛋白和去离子水。
35.制备上述包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料，步骤如下：s1. 制备羧甲基胍基壳聚糖（1）制备羧甲基壳聚糖：5.0g壳聚糖与26ml 浓度为400g/l的naoh溶液加入到三口烧瓶中，冰水浴搅拌2h使壳聚糖充分溶胀；将20g氯乙酸固体分5次加入反应体系中，加热搅拌65℃；反应6.5h后，用浓盐酸将反应物的ph调节至7；抽滤、洗涤、真空烘干得到o-羧甲基壳聚糖；所制备的羧甲基壳聚糖的取代度为77.56%。
36.（2）制备羧甲基胍基壳聚糖：取2g步骤（1）制备的羧甲基壳聚糖，溶于50ml浓度为0.33mol/l的盐酸溶液中；待溶解完全后，加入0.96g单氰胺，85℃水浴反应 3h；单氰胺与壳聚糖氨基摩尔比为 4:1；反应产物放入截留相对分子质量为2000的透析袋中透析两天后，用冻干机冷冻干燥，得到羧甲基胍基壳聚糖。
37.s2. 制备醛基化海藻酸钠将海藻酸钠2g充分溶解于去离子水中，加入高碘酸钠3g，冰水浴的条件下，避光反应24h，后于反应液中加入乙二醇8ml终止反应；反应液中加入nacl 0.5g，混匀后缓慢倒入体积分数96%乙醇中，析出的沉淀物经抽滤、干燥后再次溶于去离子水中，1000da透析袋透析过夜后放入-80℃冷冻，低温真空干燥后获得醛基化海藻酸钠。
38.s3. 制备壳聚糖水凝胶敷料（1）制备外泌体微球：配置终浓度为1wt%的醛基化海藻酸钠，0.2wt%鱼胶原蛋白的微球基质水溶液，混合以微球基质水溶液计0.1 wt%的人脐带间充质干细胞外泌体；利用喷雾器制备外泌体微球；使用浓度5wt%氯化钙溶液作为固定液；（2）制备壳聚糖水凝胶敷料（制备20ml敷料基质的水凝胶敷料）：取400mg羧甲基胍基壳聚糖，50mg鱼胶原蛋白，加入去离子水配置成混合溶液10ml；向混合溶液中加入10mg外泌体微球，并混合均匀；然后加入40mg/ml的醛基化海藻酸钠溶液10 ml，快速震荡，使其混合均匀，静置待其形成凝胶。
39.实施例2参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤s3（2）中，醛基化海藻酸钠溶液的浓度为30mg/ml。
40.实施例3参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤s3（2）中，醛基化海藻酸钠溶液的浓度为50mg/ml。
41.对比例1参照实施例1，与实施例1的区别在于，将微球中的醛基化海藻酸钠等质量替换为明胶。
42.对比例2 参照实施例1，与实施例1的区别在于，将步骤s3（2）中的醛基化海藻酸钠溶液等体积替换为去离子水。
43.对比例3参照实施例1，与实施例1的区别在于，将羧甲基胍基壳聚糖等摩尔量替换为壳聚糖。
44.测试1 抗菌实验1、分别制备实施例1和对比例3获得的水凝胶的浸出液。将两种水凝胶分别各取1g样品加入4ml pbs溶液，浸出24h后，用滤膜过滤。
45.2、将浸出液与制备好的浓度为1
´
10
6 cfu/ml的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共培养12h，取0.1ml混合菌液，稀释1000倍后，取0.1ml涂板，培养过夜。
46.3、观察培养基上的菌落数，实施例1未发现明显菌落。对比例3可发现明显菌落。
47.4、测od值表明抗菌效果，实施例1水凝胶浸出液的杀菌率基本可以达到100%，对比例3杀菌率为41.9%。
48.测试2 外泌体双重缓释释放曲线的测定1、将对比例1~3获得的水凝胶依次标记为水凝胶1~3，将实施例1获得的水凝胶标记为水凝胶4。将上述制备的4种水凝胶在37℃条件下在pbs溶液中孵育。在第1、2、3、5、7、9、
12、14天收集上清。
49.2、使用双茚二酮酸(bca)试剂盒（beyotime）评估累积释放和释放情况。使用bca法进行游离外泌体的检测，外泌体总量减去上清液中游离外泌体的量就是水凝胶负载的外泌体的总量。
50.3、结果如图1所示，本发明中的醛基化海藻酸钠微球与羧甲基胍基壳聚糖水凝胶结合，实现了对外泌体的双重缓释效果。
51.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。