一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂及其制备与应用的制作方法

1.本发明属于美容填充剂技术领域，具体涉及一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂及其制备与应用。


背景技术：

2.再生类医美产品，无论是聚左旋乳酸(plla)可注射填充剂(俗称童颜针)还是聚ε-已内酯(pcl)填充剂(俗称少女针)通过将生物降解高分子微球注射进入体内后，引发适度的炎症反应，激发成纤维细胞聚集到微球表面，通过粘附、铺展、增殖等过程分泌细胞外基质(ecm)。由于ecm中的主要成分之一为胶原，并且ⅲ型胶原的含量高，因此可实现对注射处皱纹的填充，同时具有嫩白皮肤的效果。
3.然而无论是童颜针还是少女针，成纤维细胞的粘附都需要较长的时间，因此，产生再生效果的时间很长，一般对于年青人初显效果的时间一般为4-6周，而老年人由于新陈代谢慢，需要更长的时间(8-12周)才能看到效果。其原因是使用的辅料无论是玻尿酸还是羧甲基纤维素钠均为水溶性高分子，其对成纤维细胞的亲和性较差，只有等这两类辅料在体内降解或代谢后，成纤维细胞才能够在微球表面粘附、铺展、增殖聚集再生形成大量的ecm。
4.胶原作为对成纤维细胞亲和性良好的活性生物材料，可促进成纤维细胞的粘附、铺展与增殖。而可注射胶原医美产品仅被作为填充型可注射医美产品，不称其为再生医美产品，主要原因为体内大量的胶原蛋白酶会快速催化胶原的降解，使成纤维细胞失去附着的支架，因而难以发挥其刺激胶原再生的功能。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂及其制备与应用，解决了现有医美填充剂不仅见效慢，而且有效时间短的问题。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂的制备方法，该方法包含：
7.(1)将胶原溶于酸溶液得到胶原溶液；
8.(2)在500～2000r/min搅拌下将粒径为20～100μm的微球与步骤(1)得到的胶原溶液混合，调节ph为7.0～7.4得到混合溶液(调节ph为了使胶原沉淀出来包裹在微球表面，同时防止plla微球在酸性条件下的快速降解)；
9.(3)将步骤(2)得到的混合溶液冷冻干燥得到冻干粉，在1000～5000r/min搅拌下将冻干粉与水溶性高分子溶液混合，冻干得到所述的加速诱导胶原再生的可注射填充剂；
10.其中，所述的微球选自聚左旋乳酸(plla)微球、聚消旋乳酸(pdlla)微球、聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)微球和聚ε-己内酯(pcl)微球中的任意一种或两种以上。
11.优选地，步骤(1)的酸溶液的ph为2～5，所述的酸溶液为醋酸、苹果酸、柠檬酸、盐酸、磷酸中的任意一种或两种以上。酸溶液的作用是溶解或溶胀胶原(胶原只溶于酸溶液)，若ph值过大，溶解或溶胀效率差，若ph过小会破坏plla微球。
12.优选地，步骤(1)的胶原溶液中的胶原的浓度为10～100mg/ml。所述的胶原的浓度大小与募集到成纤维细胞的数量以及刺激再生胶原的数量和填充起效的速度呈正相关关系，若胶原量过少，再生填充效果起效慢。
13.优选地，步骤(2)的混合溶液中的微球的浓度为10～50mg/ml。所述的微球的浓度大小与微球的数量呈正相关，与粘附的成纤维细胞的数量、刺激再生胶原的数量、填充起效的速度和持久时间呈正相关关系。微球浓度大了在注射时容易堵针，微球浓度过小则再生填充效果不明显。
14.优选地，步骤(2)中的调节ph用的溶液为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、磷酸钠溶液、磷酸氢二钠溶液中的任意一种或两种以上。
15.优选地，步骤(3)中的所述的冻干粉与水溶性高分子溶液中的水溶性高分子的质量比为(1～10)∶1。所述的冻干粉量过多，后期注射使用时容易堵针；冻干粉量过少，刺激胶原再生的效果就会减弱。
16.优选地，步骤(3)中的水溶性高分子溶液为玻尿酸溶液和或羧甲基纤维素钠溶液。
17.本发明提供了一种如所述的加速诱导胶原再生的可注射填充剂的制备方法制备的加速诱导胶原再生的可注射填充剂。
18.本发明提供了一种如所述的可注射填充剂作为医美产品的应用。
19.优选地，将所述的加速诱导胶原再生的可注射填充剂与含有利多卡因的注射用水混合均匀后注射。
20.本发明的一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂及其制备与应用，解决了现有医美填充剂不仅见效慢，而且有效时间短的问题，具有以下优点：
21.1、本发明通过胶原与生物降解性聚酯微球的复合，利用胶原对成纤维细胞良好的亲和性，在体内快速募集成纤维细胞，加速成纤维细胞在生物降解性聚酯微球表面的粘附(即使胶原在体内被胶原酶快速降解了，plla微球也可作为细胞附着的支架)、铺展、增殖，促进ecm的快速分泌。
22.2、与纯plla微球或可注射胶原相比，本发明的加速诱导胶原再生的可注射填充剂，不仅刺激胶原再生的起效快，最快7天见效，而且填充效果维持的时间长很多，可长达48周以上。
附图说明
23.图1为本发明实施例1中plla微球的sem图。
24.图2为本发明实施例1中plla微球与胶原溶液混合冻干后的plla微球的sem图。
25.图3为本发明实施例1制备的填充剂溶于水后的光学显微镜图。
26.图4为本发明对比例1中制备的填充剂的sem图。
27.图5为本发明对比例2中制备的填充剂的sem图。
28.图6为对比例2中制备的填充剂溶于水后的光学显微镜图。
29.图7为本发明实施例1制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果图。
30.图8为本发明对比例1制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果图。
31.图9为本发明对比例2制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果图。
具体实施方式
32.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1
34.一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂的制备方法，该方法包括：
35.(1)将非交联胶原10g溶于ph为2的柠檬酸1l溶液，配成浓度为10mg/ml的胶原溶液；
36.(2)在500r/min的高速搅拌下，将粒径为20～100μm的聚左旋乳酸(plla)微球10g与胶原溶液1l混合得到混合溶液(混合溶液中的plla的浓度为10mg/ml)，再用naoh溶液调节混合溶液的ph值至7.0～7.4；
37.(3)将ph为7.0～7.4的混合溶液冷冻、干燥得到冻干粉ⅰ，在1000r/min搅拌下将冻干粉ⅰ与玻尿酸溶液进行混合(冻干粉ⅰ与玻尿酸溶液中的玻尿酸的质量比为10∶1)、冷冻、干燥得到冻干粉ⅱ，即为一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂；使用时，将含有麻醉剂利多卡因的注射用水与冻干粉ⅱ混合均匀后即可注射使用。
38.对比例1
39.一种可注射填充剂制备方法，该方法与实施例1基本相同，区别在于：
40.在步骤(2)中，未添加聚左旋乳酸(plla)微球。
41.对比例2
42.一种可注射填充剂制备方法，该方法与实施例1基本相同，区别在于：
43.没有步骤(1)、(2)；
44.在步骤(3)中，在1000r/min搅拌下将粒径为20～100μm的聚左旋乳酸(plla)微球与玻尿酸溶液进行混合(plla微球与玻尿酸溶液中的玻尿酸的质量比为10∶1)，冷冻、干燥得到一种可注射填充剂；使用时，将含有麻醉剂利多卡因的注射用水与可注射填充剂混合均匀后即可注射使用。
45.实施例2
46.一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂的制备方法，该方法包括：
47.(1)将交联的胶原100g溶于ph为5的1l醋酸溶液，配成浓度为100mg/ml的胶原溶液；
48.(2)在2000r/min的高速搅拌下将粒径为20～100μm的聚ε-己内酯(pcl)微球50g与胶原溶液1l混合得到混合溶液(混合溶液中的pcl的浓度为50mg/ml)，用碳酸钠溶液调节混合溶液的ph值至7.0～7.4；
49.(3)将ph为7.0～7.4的混合溶液冷冻、干燥得到冻干粉ⅰ，在5000r/min搅拌下将冻干粉ⅰ与羧甲基纤维素钠(cmc)的水溶液进行混合(冻干粉ⅰ与cmc的质量比为1∶1)、冷冻、干燥得到冻干粉ⅱ，即为一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂；使用时，将含有麻醉剂利多
卡因的注射用水与冻干粉ⅱ混合均匀后即可注射使用。
50.实施例3
51.一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂的制备方法，该方法包括：
52.(1)将非交联胶原50g溶于ph为3.5的1l苹果酸溶液，配成浓度为50mg/ml的胶原溶液；
53.(2)在1000r/min的高速搅拌下，将粒径为20～100μm的聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)微球30g与胶原溶液1l混合得到混合溶液(混合溶液中的plga的浓度为30mg/ml)，用碳酸氢钠溶液调节混合溶液的ph值至7.0～7.4；
54.(3)将ph为7.0～7.4的混合溶液冷冻、干燥得到冻干粉ⅰ，在2000r/min搅拌下将冻干粉ⅰ与玻尿酸溶液进行混合(冻干粉ⅰ与玻尿酸溶液中的玻尿酸的质量比为5∶1)、冷冻、干燥得到冻干粉ⅱ，即为一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂；使用时，将含有麻醉剂利多卡因的注射用水与冻干粉ⅱ混合均匀后即可注射使用。
55.实施例4
56.一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂的制备方法，该方法包括：
57.(1)将非交联胶原35g溶于ph为3的1l稀盐酸溶液，配成浓度为35mg/ml的溶液；
58.(2)在1500r/min的高速搅拌下将粒径为20～100μm的聚消旋乳酸(pdlla)微球40g与胶原溶液1l混合得到混合溶液(混合溶液中的pdlla的浓度为40mg/ml)，用磷酸氢二钠溶液调节混合溶液的ph值至7.0～7.4；
59.(3)将ph为7.0～7.4的混合溶液冷冻、干燥得到冻干粉ⅰ，在3000r/min搅拌下将冻干粉ⅰ与羧甲基纤维素钠的水溶液进行混合(冻干粉ⅰ与羧甲基纤维素的质量比为7∶1)、冷冻、干燥得到冻干粉ⅱ，即为一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂；使用时，将含有麻醉剂利多卡因的注射用水与冻干粉ⅱ混合均匀后即可注射使用。
60.实施例5
61.一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂的制备方法，该方法包括：
62.(1)将交联胶原75g溶于ph为4的1l磷酸溶液，配成浓度为75mg/ml的溶液；
63.(2)在750r/min的高速搅拌下将粒径为20～100μm的聚左旋乳酸微球40g与胶原溶液1l混合得到混合溶液(混合溶液中的聚左旋乳酸微球的浓度为40mg/ml)，用磷酸钠溶液调节混合溶液的ph值至7.0～7.4；
64.(3)将ph为7.0～7.4的混合溶液冷冻、干燥得到冻干粉ⅰ，在3500r/min搅拌下将冻干粉ⅰ与玻尿酸水溶液进行混合(冻干粉ⅰ与玻尿酸溶液中的玻尿酸的质量比为3∶1)、冷冻、干燥得到冻干粉ⅱ，即为一种加速诱导胶原再生的可注射填充剂；使用时，将含有麻醉剂利多卡因的注射用水与冻干粉ⅱ混合均匀后即可注射使用。
65.实验例1实施例1～5的plla微球与及其制备的填充剂的电镜扫描及观察
66.对实施例1～5制备的plla微球和plla微球与胶原溶液混合冻干后得到的填充剂进行电镜扫描，以及在光学显微镜下观察实施例1～5制备的填充剂溶于水后的状态。结果显示，实施例2～5的plla微球与及其制备的填充剂的电镜扫描及观察结果分别与实施例1的相同。
67.如图1所示，本发明实施例1中plla微球的扫描电镜(sem)图。由图1可见，plla微球球形规整，表面光滑，分散性良好。
68.如图2所示，本发明实施例1中plla微球与胶原溶液混合冻干后的plla微球的扫描电镜(sem)图。由图1～2可以清晰看到plla微球与胶原溶液混合冻干后，微球表面不再光滑，因涂覆了一层胶原而使微球表面呈波纹状，以及图中呈不规则颗粒和片状的为未涂覆到微球表面的胶原。
69.如图3所示，本发明实施例1制备的填充剂复溶于水后的光学显微镜图。由图3可以看到微球分散性良好，表面由于有涂覆的胶原和玻尿酸使微球表面不再光滑。
70.实验例2对比例1～2制备的填充剂的电镜扫描及观察
71.对对比例1～2制备的填充剂进行电镜扫描，以及在光学显微镜下观察对比例2制备的填充剂溶于水后的状态。
72.如图4所示，本发明对比例1中制备的填充剂的扫描电镜(sem)图。由图4可见看到，纯的胶原干燥后呈片状不规则颗粒形貌。
73.如图5所示，本发明对比例2中制备的填充剂的扫描电镜(sem)图。由图5可见，plla微球表面呈波纹状的玻尿酸涂层。
74.如图6所示，对比例2中制备的填充剂溶于水后的光学显微镜图。由图6、图3得知，由于玻尿酸良好的亲水性和水溶性，在光学显微镜下面，有玻尿酸涂层的plla微球(图6)表面光滑性比表面有胶原和玻尿酸的plla微球(图3)的好。
75.实验例3观察实施例1、对比例1～2制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果
76.具体的实验方法如下：
77.(1)各取实施例1、对比例1～2制备的冻干粉(填充剂)220mg依次装入西林瓶中，以25kgy的剂量辐照灭菌后密封保存待用；用注射器依次向西林瓶内加入5ml生理盐水，使混合后溶液中的冻干粉的浓度均为44mg/ml，静置1小时冻干粉充分润湿、水合，摇晃、涡旋均匀依次得到实施例1、对比例1～2的注射液。
78.(2)雌性新西兰大白兔约重2kg，单笼饲养，背部去毛消毒后，使用2ml注射器在不同兔子背部同一部位分别皮下注射实施例1、对比例1和对比例2的注射液0.2ml，并做好标记，记为实验组；将实施例1、对比例1和对比例2的三种注射液，各取三份0.2ml依次皮下注射至不同兔子背部的同一位置，并做好标记，记为平行组。
79.(3)注射后6个月，经耳缘静脉注射空气栓塞处死实验组和平行组的兔子，揭开背部皮肤，在相应位置取皮肤和肌肉组织，立刻用组织固定液固定，进行后续组织学观察。
80.如图7所示，本发明实施例1制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果图，由图7可以看到大量新生的胶原(连续的条形絮状部分)，说明实施例1制备的填充剂在体内可长时间维持刺激胶原再生。
81.如图8所示，本发明对比例1制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果图，由图8完全看不到新生胶原，说明对比例1不具有长效填充功能。
82.如图9所示，本发明对比例2制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果图，由图9可以看到新生胶原量较多，但远低于实施例1(连续的条形絮状部分)，说明对比例2也能够长效刺激胶原再生。
83.本发明也将实施例2～5制备的填充剂注射在兔子真皮下层6个月后的masson染色效果，其具体实验过程与实验例3的相同。实验结果显示，实施例2～5制备的填充剂刺激胶
原再生的量与实施例1的结果类似，效果均比对比例1～2的好。
84.实验例4观察实施例1、对比例1～2制备的填充剂注射后兔子皮下胶原增加的厚度变化
85.具体的实验方法如下：
86.(1)与实验例3的步骤(1)相同。
87.(2)与实验例3的步骤(2)相同。
88.(3)注射后，在本实验设置的11个时间点(1、2、4、8、12、18、24、30、36、40、48周)，用超声回声仪测定实验兔皮下再生胶原增加的厚度。结果如表1所示。
89.表1、注射不同时间后兔子皮下增加胶原的厚度
[0090][0091]
由表1结果可以得出，实施例1在注射后前两周内，其皮下胶原增加的厚度比对比例1和2的明显多很多，说明其刺激胶原再生起效快，效果好；随着时间延长，实施例1胶原增加的厚度远高于对比例1和2，说明其填充效果原比对比例1和2都好。这是因为第四周以前注射的外源性胶原起到了临时填充作用，同时胶原对成纤维细胞具有良好的亲和性，能快速大量募集体内成纤维细胞，产生大量细胞外基质(胶原为其主要成份)，提高再生胶原的量。四周后随着外源性胶原的降解，再生胶原的量逐渐增加，仍可在长时间内维持再生胶原的厚度。而对于对比例1的纯胶原填充剂，前两周胶原厚度增加的原因是胶原本身的填充效果叠加成纤维细胞粘附分泌的细胞外基质，使第一～四周胶原厚度增加，然而随着胶原的降解，其不仅外源性注射的胶原减少，而且再生的胶原由于成纤维细胞缺乏粘附的支架，导致第四周之后再生胶原的量也逐渐减少，第十二周之后外源性注射的胶原在体内蛋白酶的人作用下被完全降解，胶原增加的厚度彻底归零，恢复原状。而对于对比例2为无胶原的plla微球，其对成纤维细胞的亲和性差，导致募集体内成纤维细胞数量少，在微球表面粘附、铺展、增殖慢，导致其作为填充剂起效慢，尽管维持时间较长，但效果(再生胶原厚度)比实施例1差很多。
[0092]
本发明也将实施例2～5制备的填充剂注射后兔子皮下胶原增加的厚度变化，其具体实验过程与实验例4的相同。实验结果显示，实施例2～5制备的填充剂刺激下，胶原增加的厚度变化情况与实施例1的结果类似，均好于对比例1和2。
[0093]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。