一种妇科用克霉唑组合物及其乳膏

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种妇科用克霉唑组合物及其乳膏。


背景技术：

2.克霉唑为广谱抗真菌药，对多种真菌尤其是白色念珠菌具有较好抗菌作用，其作用机制是抑制真菌细胞膜的合成，以及影响其代谢过程。对浅表真菌及某些深部真菌均有抗菌作用。临床主要供外用，治疗皮肤霉菌病，如手足癣、体癣、耳道、阴道霉菌病等。
3.近年来，枸杞子作为药食兼用的名贵资源已为国内外学者所瞩目，特别是国内的许多学者在枸杞的研究领域中如枸杞子的化学成分、结构以及功能评价等方面进行了许多卓有成效的工作，用现代医学理论和仪器方法研究了枸杞子的化学成分及功能因子，这些研究资料表明枸杞子不仅营养丰富而且确实具有多方面的功能作用。用分离得到的纯品(纯级分)枸杞多糖(lbp-1,2,3,4)进行的功能学评价实验进一步表明，枸杞多糖确实是枸杞子具有许多药理作用的重要的功能因子之一。经报道的，枸杞多糖有增强免疫和免疫调节功能、促进造血功能、降血脂、抗脂肪肝、抗肿瘤、抗衰老等作用。
4.众所周知，念珠菌性阴道炎非常容易反复复发，因此亟需提供一种能够治疗念珠菌性阴道炎的药物且能防止其复发。


技术实现要素：

5.克服现有技术的不足，本发明提供了一种克霉唑与枸杞提取物的组合物以及其乳膏制剂，解决了念珠菌性阴道炎容易复发的问题，提高了念珠菌性阴道炎临床治疗总有效率、降低了复发率。
6.具体而言，本发明的技术方案如下：
7.本发明提供了一种克霉唑组合物，所述克霉唑组合物包括克霉唑、枸杞提取物。
8.进一步的，所述枸杞提取物主要成分为枸杞多糖。
9.进一步的，所述克霉唑与枸杞多糖的重量份比为2-10：1，优选的，所述克霉唑与枸杞多糖的重量份比为4-8：1。
10.尤其的，所述克霉唑与枸杞多糖的重量份比为6：1。
11.进一步的，所述枸杞多糖的提取纯化分为粗多糖的提取和粗多糖的分级纯化。
12.其中，所述粗多糖的提取工艺为：称取已烘干粉碎的枸杞子，以石油醚：丙酮回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干后以80％乙醇脱单糖和低聚糖，将脱糖后的残渣用水在90～100℃水溶提取多糖，提取液减压浓缩后用乙醇沉淀多糖，再用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得枸杞粗多糖。
13.其中，所述粗多糖的分级纯化是将所述枸杞粗多糖通过deae纤维素柱，以不同浓度的nacl梯度洗脱，将不同盐浓度的洗脱液分别减压浓缩后，用透析法脱盐，冷冻干燥后得枸杞多糖。
14.本发明的第二个目的在于提供一种包含上述克霉唑组合物的克霉唑乳膏，其还包
含药学可接受的辅料。
15.进一步的，所述药学可接受的辅料包含但不限于水相基质、油相基质、乳化剂、防腐剂。
16.其中，所述辅料选自硬脂酸、石蜡、蜂蜡、高级脂肪醇、凡士林、植物油、丙二醇、甘油、水、苯扎溴铵、尼泊金乙酯、醋酸氯己定、苯甲酸钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硬脂酸钠、油酸钠、油酸山梨坦、十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、硫酸化蓖麻油、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、聚山梨酯-80、甲基葡萄糖苷倍半硬脂酸酯、鲸蜡醇、硬脂醇、edta-2na中的一种或多种。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.(1)通过体外抑制白色念珠菌试验显示，枸杞提取物(枸杞多糖)与克霉唑二者联用抗耐药白色念珠菌呈现出显著的协同作用；
19.(2)动物实验显示克霉唑与枸杞提取物(枸杞多糖)按照2-10：1重量比联合用药，能够显著提高对于耐药白色念珠菌感染阴道炎模型动物的治疗效果。
20.(3)经病例统计，本发明用药的观察组患者念珠菌性阴道炎临床治疗总有效率高于对照组、复发率低于对照组。
附图说明
21.图1-2：各实施例、对比实施例对于治疗新西兰兔感染白色念珠菌效果评分
具体实施方式
22.为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，实施例仅用于解释本发明。本领域技术人员应该理解的是，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
23.一、枸杞提取物的制备
24.枸杞多糖的提取：
25.(1)提取：称取已烘干粉碎的枸杞子，以石油醚：丙酮回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干后以80％乙醇脱单糖和低聚糖，将脱糖后的残渣用水在90～100℃水溶提取多糖，提取液减压浓缩后用乙醇沉淀多糖，再用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得枸杞粗多糖。
26.(2)粗多糖的分级纯化：枸杞粗多糖通过deae纤维素柱，以不同浓度的nacl梯度洗脱，将不同盐浓度的洗脱液分别减压浓缩后，用透析法脱盐，冷冻干燥后得枸杞多糖。
27.二、枸杞多糖与克霉唑联合抑制白色念珠菌作用测定
28.1.材料
29.1.1实验菌株
30.实验菌株：白色念珠菌，在固体培养基上传代培养并保存，得到的白色念珠菌菌株分别编号为c.a-1、c.a-2、c.a-6、c.a-7、c.a-8，并且根据药敏试验结果，其中的c.a-6、c.a-7、c.a-8为对克霉唑耐药的白色念珠菌，而c.a-1、c.a-2为对克霉唑敏感的白色念珠菌。
31.标准质控菌株：近平滑念珠菌。
32.1.2试验药品
33.克霉唑、枸杞提取物(枸杞多糖)、pbs粉末、二甲亚砜(dmso)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、甲萘醌、琼脂粉、xtt粉末、rpmi 1640粉末。
34.1.3试验试剂
35.1.3.1枸杞多糖：
36.粗多糖的提取：称取已烘干粉碎的枸杞子，以石油醚：丙酮回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干后以80％乙醇脱单糖和低聚糖，将脱糖后的残渣用水在90～100℃水溶提取多糖，提取液减压浓缩后用乙醇沉淀多糖，再用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得枸杞粗多糖。
37.粗多糖的分级纯化：枸杞粗多糖通过deae纤维素柱，以不同浓度的nacl梯度洗脱，将不同盐浓度的洗脱液分别减压浓缩后，用透析法脱盐，冷冻干燥后得枸杞多糖。
38.1.3.2xtt-甲萘醌溶液：
39.分别称取xtt粉末0.10g和甲萘醌粉末0.35g，分别溶解于200ml已灭菌的乳酸林格氏液和20ml丙酮的混合溶液中，取10μl甲萘醌溶液与xtt溶液混合，用0.22μm微孔滤膜滤过灭菌，分装到ep管中，-20℃冰箱避光保存。
40.1.3.3磷酸盐缓冲溶液(pbs)：
41.按说明称取pbs粉末，溶于去离子水中得到ph＝7.2的pbs缓冲溶液，然后在高温121℃高压(103.4kpa)湿热灭菌20min，冷却分装备用。
42.1.3.4rpmi 1640液体培养基：
43.分别称取rpmi 1640(含l-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)8.30g、葡萄糖16.00g、mops粉末27.65g，加去离子水至800ml，混合均匀后在25℃用0.5mol/l的naoh溶液调节ph＝7.0，用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，4℃冰箱保存备用。
44.1.3.5酵母膏-蛋白胨-葡萄糖-琼脂培养基：
45.分别称取蛋白胨10.00g、琼脂粉10.00g、葡萄糖10.00g、酵母膏5.00g，用500ml纯水溶解，充分搅拌均匀后在121℃下灭菌30min，冷却后放至4℃冰箱保存备用。
46.1.3.6菌液的配制
47.受试菌株在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖-琼脂培养基上转种2次，挑取单个较大菌落用磷酸盐缓冲溶液配成菌悬液，比浊仪测定浓度为0.5麦氏浊度单位，用血细胞计数板将其浓度校正为1～5
×
105cfu/ml，然后以rpmi 1640液体培养基将其稀释使96孔平板内工作菌液浓度为2.5
×
103cfu/ml。
48.1.3.7药液的配制
49.药物母液：克霉唑用灭菌蒸馏水配成3280μg/ml，枸杞提取物(枸杞多糖)用dmso配成785μg/ml。将各药物母液用rpmi1640液体培养基进行稀释以达到系列工作浓度。
50.2.联合药敏测定试验
51.根据美国临床实验室标准委员会(nccls)颁布的抗真菌药敏试验m27-a3方案，采用微量稀释法测定克霉唑与枸杞提取物(枸杞多糖)联用时的最低抑菌浓度(mic)值(以抑制80％以上真菌生长的最低药物浓度为mic值)。各菌株工作菌液浓度为2.5
×
103cfu/ml，对于敏感菌，克霉唑的浓度范围是0.002-2μg/ml，枸杞提取物(枸杞多糖)的浓度范围是0.045-5μg/ml；对于耐药菌，克霉唑的浓度范围是0.105-56μg/ml，枸杞提取物(枸杞多糖)的浓度范围是0.305-20μg/ml。设置对照孔和空白对照列，不足200μl的孔以rpmi1640液体培养基补齐。在35℃恒温培养24h后，加入xtt-甲萘醌溶液避光培养2h，用酶标仪测光密度
(od)值。得到od值后，按以下公式计算真菌生长百分数：
52.真菌生长百分数＝(各孔od值-空白对照孔od值)/生长对照孔od值
×
100％
53.3.评价方法与结果判定
54.采用分数抑菌浓度指数法，其计算公式如下：fici＝ca/mica+cb/micb，ca与cb分别是药物a与b联合使用时达到相同药效时各自对应的最小抑菌浓度，mica与micb分别是药物a与b单用时的最小抑菌浓度。fici≤0.5为协同作用，fici》4为拮抗作用，在0.5＞fici≤4为相加或无关。
55.4.试验结果
56.表1克霉唑、枸杞提取物(枸杞多糖)单用及联用12h的抗菌作用
[0057][0058]
表1可知，枸杞提取物(枸杞多糖)单用对白色念珠菌几乎没有抗真菌作用(mic》512μg/ml)，而枸杞提取物(枸杞多糖)和克霉唑联合使用时，二者联用抗耐药白色念珠菌呈现出显著的协同作用，fici值远小于0.5。并且克霉唑的mic降为1.5-4μg/ml，枸杞提取物(枸杞多糖)的mic为0.1-1μg/ml。
[0059]
三、克霉唑乳膏与质量评价
[0060]
1.克霉唑乳膏
[0061]
实施例1克霉唑乳膏
[0062]
克霉唑0.1g、枸杞提取物(枸杞多糖)0.05g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0063]
实施例2克霉唑乳膏
[0064]
克霉唑0.1g、枸杞提取物(枸杞多糖)0.01g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0065]
实施例3克霉唑乳膏
[0066]
克霉唑0.1g、枸杞提取物(枸杞多糖)0.025g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、
十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0067]
实施例4克霉唑乳膏
[0068]
克霉唑0.1g、枸杞提取物(枸杞多糖)0.0125g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0069]
实施例5克霉唑乳膏
[0070]
克霉唑0.1g、枸杞提取物(枸杞多糖)0.0167g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0071]
对比实施例1克霉唑乳膏
[0072]
克霉唑0.1g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0073]
对比实施例2克霉唑乳膏
[0074]
克霉唑0.1g、枸杞提取物(枸杞多糖)0.005g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0075]
对比实施例3克霉唑乳膏
[0076]
克霉唑0.1g、枸杞提取物(枸杞多糖)0.1g、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十八醇、白凡士林、甘油、edta-2na、纯化水、尼泊金乙酯
[0077]
对比实施例4：市售克霉唑乳膏(国药准字h35021091)
[0078]
2.克霉唑乳膏质量评价
[0079]
按市售包装，加速试验在温度40℃
±
2℃，相对湿度75％
±
5％的条件下进行，分别于0、6个月取样分析，检查性状、含量、有关物质、微生物限度等。
[0080]
2.1外观形状
[0081]
要求色泽均匀一致，质地细腻，应无酸败、异臭、变色、变硬，不得有油水分离、分层及胀气现象。
[0082]
2.2有关物质
[0083]
二苯基-(2氯苯基)甲醇(杂质i)，照中国药典2020版高效液相色谱法(通则0512)测定。
[0084]
溶剂：70％甲醇溶液。
[0085]
供试品溶液：取本品适量(相当于克霉唑10mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇28ml，置50℃水浴中加热约5分钟，时时振摇，取出后强烈振摇约5分钟，加水12ml，摇匀，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中放置2小时，滤膜滤过，取续滤液放至室温。
[0086]
对照品溶液：取杂质i对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含2μg的溶液。
[0087]
系统适用性溶液：取克霉唑对照品与杂质i对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含0.04mg与0.03mg的溶液。
[0088]
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(70：30)(用10％磷酸调节ph值至5.7～5.8)为流动相；检测波长为215nm；进样体积10μl。
[0089]
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，理论板数按克霉唑峰计算不低于4000，克霉唑峰与杂质i峰之间的分离度应大于2.0。
[0090]
测定法：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0091]
限度：供试品溶液色谱图中如有与杂质i峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过标示量的1.0％。
[0092]
2.3含量
[0093]
照中国药典2020版高效液相色谱法(通则0512)测定。
[0094]
供试品溶液：本品5支内容物混匀，精密称取适量(约相当于克霉唑4mg)，置100ml量瓶中，加甲醇56ml，置50℃水浴中加热5分钟，时时振摇，取出后强烈振摇约5分钟，加水24ml，摇匀，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2小时，滤膜滤过，取续滤液放至室温。
[0095]
对照品溶液：克霉唑对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.04mg的溶液。
[0096]
溶剂、系统适用性溶液、色谱条件与系统适用性要求见2.2项下。
[0097]
测定法：密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算。
[0098]
2.4微生物限度：
[0099]
照中国药典2020版微生物计数法(通则1105)和控制菌检查法(通则1106)及非无菌药品微生物限度标准(通则1107)检查，应符合规定。
[0100]
表2实施例与对比实施例克霉唑乳膏质量评价
[0101][0102]
表2可知，本发明实施例克霉唑乳膏性状稳定、有关物质含量较低、符合药典标准。
[0103]
四、药效学实验
[0104]
1.实验动物
[0105]
普通级雌性新西兰兔，2.5～3.0kg，实验动物许可证号：syxk(鲁)2018 0008，实验前适应性饲养一周。
[0106]
2.实验用药
[0107]
实施例1-5克霉唑乳膏、对比实施例1-4克霉唑乳膏。
[0108]
3.造模与分组
[0109]
3.1造模
[0110]
雌性新西兰兔70只，在接种菌液前6d开始，均皮下注射苯甲酸雌二醇油剂0.05ml，以后每两天注射一次直至模型建立成功，造成新西兰兔的假发情状态，增大感染的几率，将上述白色念珠菌耐药菌株用无菌生理盐水将其密度调为2.5
×
107cfu/ml，每只新西兰兔均用灭过菌的无菌硅胶管吸取菌液0.2ml注入阴道内，原位停留1-2min，防止菌液流出。连续3天，每天1次，并于末次接种之后的第5天取阴道分泌物进行涂片检查，经镜检白色念珠菌呈阳性，并且将阴道分泌物用沙氏培养基进行培养，培养后见假菌丝和芽生孢子以便进一步确认感染了白色念珠菌，结合肉眼观察阴道分泌物是否增多、阴道黏膜有无发生阴道充血、
水肿、糜烂等炎症变化，确定造模成功。最终68只新西兰兔造模成功。
[0111]
3.2分组
[0112]
将造模成功的雌性新西兰兔分为模型组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、对比实施例1组、对比实施例2组、对比实施例3组、对比实施例4组，每组6只。令取6只未造模的雌性新西兰兔为空白组。
[0113]
4.给药
[0114]
按照分组给予对应药物，每次给药1g，连续给予药物7d，空白组与模型组给予实施例1基质涂抹，在给药前和给药后分别进行评分。
[0115]
5.评分标准
[0116]
通过肉眼观察对各组动物变化指标进行分级评分，评分标准如下：
[0117]
表3指标评分标准
[0118][0119]
6.实验结果
[0120]
如图1-2所示，采用本发明实施例1-5克霉唑乳膏模型动物的治疗效果既明显优于采用对比实施例4实验组，也优于对比实施例1-3实验组，说明本发明选择将克霉唑与枸杞提取物(枸杞多糖)按照一定比例联合用药，能够显著提高对于耐药白色念珠菌感染阴道炎模型动物的治疗效果。
[0121]
五、病例分析
[0122]
1.一般资料
[0123]
研究对象为2021年5月-2020年5月我院收治的64例复发性念珠菌性阴道炎患者，32例患者为对照组，年龄28-52岁，平均(40.04
±
6.91)岁；病程最短8周，最长5年，平均(24.56
±
3.77)个月。32例患者为观察组年龄30-54岁，平均(41.22
±
6.47)岁；病程最短9周，最长5年,平均(25.16
±
3.64)个月。两组一般资料对比，差异无统计学意义(p》0.05)，具有可比性。
[0124]
2.纳入标准与排除标准
[0125]
2.1纳入标准
[0126]
患者临床症状表现为白带异常、外阴瘙痒、外阴疼痛及烧灼，利用真菌学检查与临床检查确诊为复发性念珠菌性阴道炎，与《外阴阴道念珠菌病诊治规范》中的相关诊断标准具有一致性；研究内容经医院伦理委员会批准，且患者自愿入组，并签署研究参与协议书。
[0127]
2.2排除标准
[0128]
患者肝肾功能存在严重障碍者；对研究中涉及药物存在过敏史者；前半年内应用过其他对研究结果有影响的药物者；免疫功能存在障碍者。
[0129]
3.治疗方法
[0130]
对照组：单纯对患者进行克霉唑乳膏治疗，具体治疗方法为：对患者进行健康宣
教，告知患者将涂于洗净患处，将克霉唑乳膏(国药准字h35021091)挤出2-3cm长度，用医用棉签涂于外阴，每晚一次，连续7日。
[0131]
观察组：采用本发明实施例5克霉唑乳膏对患者进行治疗，具体治疗方法为：对患者进行健康宣教，告知患者将涂于洗净患处，将本发明实施例5克霉唑乳膏挤出2-3cm长度，用医用棉签涂于外阴，每晚一次，连续7日。
[0132]
对照组与观察组患者在治疗期间严格按照医嘱操作，禁止性生活，禁止吸烟饮酒，定时对阴道进行清洗，并每日更换内裤。
[0133]
4.观察指标
[0134]
对两组患者的临床治疗效果进行对比，临床治疗效果分为显效、有效、无效3种结果。
[0135]
显效：患者阴道瘙痒、灼痛及白带异常等临床症状基本消失，经阴道分泌物涂片检查显示结果呈现阴性。
[0136]
有效：患者阴道瘙痒、灼痛及白带异常等临床症状明显好转，经阴道分泌物涂片检查显示结果呈现阴性。
[0137]
无效：患者阴道瘙痒、灼痛及白带异常等临床症状无明显改善状态，经阴道分泌物涂片检查显示结果呈现阳性。
[0138]
临床治疗总有效率＝(显效例数+有效例数)/总例数
×
100.0％。
[0139]
同时，对两组患者病症复发情况进行调查，对比患者复发率。
[0140]
5.两组患者临床治疗效果
[0141]
表4两组患者临床治疗效果比较
[0142][0143]
表4显示，经统计观察组患者临床治疗总有效率高于对照组、复发率低于对照组。