一种壳寡糖-姜黄素纳米复合体的制备方法

1.本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种壳寡糖-姜黄素纳米复合体的制备方法。


背景技术：

2.姜黄素是一种来自饮食香料姜黄的多酚化合物，具有多重药理功效，包括抗炎、抗氧化、抗菌、抗增殖和抗肿瘤等生物活性。一期临床试验表明，即使在高剂量(12g/d)下人对姜黄素也是安全的，由于具有不溶于水的特性，因此姜黄素在细胞内部摄入缓慢，生物利用度非常低，药代动力学性质差，需要重复口服剂量达到能够支持任何生理活动的药物浓度，而限制了其在生物医药领域的临床应用。
3.目前关于改善姜黄素生物利用度已有较多研究，包括构建纳米载药体系、乳液的制备、纳米胶束、脂质体、凝胶等。其中，纳米载药体系受到了广泛关注，包括固体脂质纳米粒，聚乳酸羟基乙酸纳米粒、壳聚糖纳米粒、甘油单脂纳米粒等。单纯的纳米载药体系中，虽然能有效改善生物利用度，但药物负载量低，一般为10％-15％，不能满足姜黄素的高效装载，而低装载量直接限制了注射类药物的用药量，并且直接影响量效关系。胶束是由两亲分子在液体中自发形成的一类自组装聚集体，聚合物形成的胶束是包封脂溶性成分的良好载体，可以改善生物利用度的同时达到较高装载率，其负载量可以达到40％以上，例如申请号为201910147182.8的发明专利申请公开了一种表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物的方法并进行了载药应用。但该方法步骤繁琐，耗时较长，且产率低。申请号为201210013139.0的发明专利使用胶束对姜黄素进行负载，其载药量较高，可以达到50％以上，但使用的材料仍为聚合物，聚合物的缺点显而易见，毒性较高、代谢能力较差，其安全性难以得到保障，生物降解能力对机体是否会产生影响还有待考察。
4.壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性，无毒性等优点，同时具备抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等多种药理功效。但由于结构和分子量，导致水溶性较差，限制了其应用。壳寡糖是壳聚糖通过解聚得到的产物，具有较低的分子量，水溶性较好，同时又能保留壳聚糖的全部生物活性。实验室前期工作制备的壳寡糖聚合度为2-6，其固体形态下就可以展现良好的自组装形貌，为建立纳米载药体系提供了可能。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决姜黄素生物利用度低、药代动力学性质差的问题，提供一种壳寡糖-姜黄素纳米复合体的制备方法。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.一种壳寡糖-姜黄素纳米复合体的制备方法，所述方法具体为：
8.步骤一：将壳寡糖溶解于蒸馏水中，浓度为5-180mg/ml；
9.步骤二：将姜黄素溶解于有机溶剂中，浓度为5-20mg/ml；
10.步骤三：室温下，磁力搅拌转速为120-800rpm条件下，将10-40μl溶有姜黄素的有机溶剂滴入1ml溶有壳寡糖的蒸馏水中，在磁力搅拌转速为120-800rpm条件下室温反应
0.5-1小时；
11.步骤四：混合溶液12000rpm离心20分钟，之后加入双蒸水重复三次离心。
12.进一步地，步骤一中，每1ml反应体系中加入20mg碳酸钠，用于解聚。
13.进一步地，步骤一中，所述壳寡糖的聚合度为2-6。
14.进一步地，步骤二中，所述有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇、丙酮等可以与水互溶的任意一种或多种。
15.本发明相对于现有技术的有益效果为：
16.(1)该方法简易、快捷、环保；构建的纳米体系稳定。其中药物的选择上，自组装功能越强，成键能力越强，形成的纳米体系越稳定。
17.(2)实现极性分子与非极性分子之间的共组装，实现了纳米载药系统中姜黄素的药物高负载量，姜黄素的生物利用度得到了显著提高。
18.(3)通过高效、便捷且稳定的实验体系，使壳寡糖与姜黄素共组装，生成的复合纳米载药体系在水中能稳定分散且粒径均一。所获得的纳米载药体系可以显著提高姜黄素的生物利用度，并且药物负载量可以高达46.51％。将其应用在乳腺癌的治疗过程中，与游离姜黄素相比较，治疗效果有显著差异。
附图说明
19.图1为使用dmso为有机溶剂时，壳寡糖-姜黄素纳米复合体的扫描电镜图。
20.图2为壳寡糖-姜黄素纳米复合体的扫描电镜图。
21.图3为使用甲醇为有机溶剂时，壳寡糖-姜黄素纳米复合体的扫描电镜图。
22.图4为使用丙酮为有机溶剂时，壳寡糖-姜黄素纳米复合体的扫描电镜图。
23.图5为壳寡糖-姜黄素纳米粒经尿素处理破坏氢键后紫外光谱变化图。
24.图6为壳寡糖-姜黄素纳米粒添加不同含量碳酸钠的样品图。
25.图7为壳寡糖-姜黄素纳米粒与单独壳寡糖和姜黄素的红外光谱图。
26.图8为壳寡糖-姜黄素纳米粒与单独壳寡糖和姜黄素的三相接触角图。
27.图9为壳寡糖-姜黄素纳米粒添加不同含量碳酸钠的zeta电位大小图。
28.图10为壳寡糖-姜黄素纳米粒在不同ph下缓慢释放图。
29.图11为壳寡糖-姜黄素纳米粒的mtt细胞活性实验图。
30.图12为壳寡糖-姜黄素纳米粒的ic
50
值示意图。
31.图13为计算游离壳寡糖的ic
50
值示意图。
32.图14为计算游离姜黄素的ic
50
值示意图。
33.图15为壳寡糖-姜黄素纳米粒的不同组别动物实验治疗时的给药方式示意图。
34.图16为壳寡糖-姜黄素纳米粒的不同组别的小鼠肿瘤抑制率示意图。
35.图17为壳寡糖-姜黄素纳米粒的不同组别小鼠体重变化图。
36.图18为壳寡糖-姜黄素纳米粒的不同组别小鼠肿瘤治疗效果图。
37.图19为不同浓度的壳寡糖-姜黄素纳米粒在模拟胃相肠相释放结果图。
具体实施方式
38.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，
凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
39.本发明中利用生物相容性好、可生物降解的壳寡糖与生物利用度差的姜黄素相互作用发生共组装，形成的共组装体在水中分散时，亲水的壳寡糖与疏水的姜黄素共组装形成核壳结构。所得的壳寡糖-姜黄素纳米颗粒具有较小的平均粒径，且分布均一。获得的壳寡糖-姜黄素纳米复合体中，姜黄素的负载量可以达到46.51％，远远超于传统制备方法中姜黄素10％以内的装载量。并且姜黄素生物利用度显著提高，ic
50
浓度为降低至游离姜黄素的二分之一。且当所获得的复合纳米粒应用于化疗法抗肿瘤时，实验动物模型的治疗效果与传统化疗药物治疗取得显著性差异，当复合纳米复合体应用于化疗-免疫联合抗肿瘤时，由于壳寡糖本身具有显著增强机体免疫力作用，使得免疫疗法的缺陷，即根据个体差异导致的免疫药物作用不佳得到明显改善。
40.截至目前未有研究将水溶性多糖与脂溶性药物通过共组装效应相结合，多级组装通过亲-疏水作用、静电作用、氢键作用、金属-配体作用或者酸碱作用，可以促进分子间的共组装发生，并设计组装的形貌。在本发明中，建立了一种便捷、高效、稳定的纳米共组装系统，将极性分子与非极性分子发生稳定共组装。利用实验室制备的壳寡糖，与姜黄素通过氢键及静电作用发生共组装，可以获得稳定的壳寡糖-姜黄素复合纳米体。获得的复合纳米体在体内缓慢释放，药代动力学显示壳寡糖-姜黄素纳米粒在体内血药浓度血液半衰期较游离姜黄素显著增高，并且对姜黄素的装载量高达46.51％。
41.姜黄素极低的水溶性是其生物利用度差的原因之一，因此增加其水溶性有利于提高其生物利用度。本发明考察了cos包裹的姜黄素的水溶性，以评估cos-ccm nps改善水溶性的能力。游离姜黄素的水溶性非常低，为0.0923％，这是由于没有包封，即不溶性。ccm在cos-ccm nps中的水溶性显著增加，达到99.8667％，是游离姜黄素的1100倍，这是由于壳寡糖参与姜黄素共组装过程后，表面为几乎完全亲水核。截至目前，针对姜黄素的水溶性提高的研究中，226倍是现有最高水平。
42.通过水溶性、ic
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值，胃肠相释放效率这三个方面实验结论可知，所得到的纳米复合体显著提高姜黄素的生物利用度，无论在单独的化疗疗法中还是化疗-免疫联合治疗抗肿瘤中都可以获得显著的抗肿瘤效果。
43.以下实施例所得纳米粒用扫面电镜(sem)测定，粒径大小用动态激光光散射仪(dls)测定。化疗药物载药量用高效液相色谱(hplc)测定。纳米复合体的分子结构用傅立叶变换红外光谱仪(ftir)测定，辅助证明壳寡糖与姜黄素发生分子间相互作用力采用分子动力学模拟对实际实验结果进行验证。
44.实施例1：
45.将5mg姜黄素充分溶于1ml二甲基亚砜dmso中，配制成5mg/ml浓度的姜黄素-dmso溶液。取30mg聚合度2-6的壳寡糖充分溶于1ml蒸馏水中。将1ml壳寡糖水溶液放置于转速为200rpm的磁力搅拌器上，搅拌过程中取20μl体积，5mg/ml浓度的姜黄素-dmso溶液，滴入壳寡糖水溶液中，室温下继续200rpm搅拌45分钟。将所获得混合液转移至离心管中，12000rpm离心30分钟。弃去上清液，加入1ml蒸馏水，混合均匀后，再次12000rpm离心30分钟，弃去上清液，加入1ml蒸馏水，混合均匀后，再次12000rpm离心30分钟，弃去上清液即可获得壳寡糖-姜黄素复合纳米粒。所制备的纳米粒子形貌如图1所示，所形成的纳米粒子尺寸为
200nm，表面有明显的凹凸不平类球形状堆积。其紫外光谱测定结果如图5所示，形成的cos-ccmnps的最大吸收波长从游离状态下的432nm至422nm，呈现轻微红移，当添加尿素后，又从422nm蓝移至428nm，这说明壳寡糖与姜黄素分子间存在氢键相互作用。纳米粒子样品状态如图6所示。所制备的纳米粒子红外光谱图如图7所示，对于cos而言，n-h键的i期特征峰非常宽，在ccm的光谱中，3415-3425、1698和1263cm-1
的特征吸收峰归因于o-h、c＝o和c-o的伸缩振动；cos-ccm nps红外光谱中的o-h、c＝o和c-o特征吸收峰分别位于3418-3428、1737和1245cm-1
区域。在物理混合样品中(cos+ccm)，可以看做是cos和ccm合并重叠形成相应的特征吸收峰。这表明cos分子与药物分子发生相互作用。此外，cos-ccm nps同时也出现了3340cm-1
的吸收峰，并且和两者混合物类似，进一步表明药物成功被装载，cos-ccmnps成功制备。接触角测定如图8所示，与游离原药相比较，形成纳米粒子后，化合物表面亲水性得到了实质性的改善。zeta电位如图9所示，无论cos-ccm nps都呈负的表面电荷，分别为-22.70
±
0.70mv；-13.33
±
1.55mv和-13.67
±
0.42mv。
46.实施例2：
47.将10mg姜黄素充分溶于1ml丙酮中，配制成10mg/ml浓度的姜黄素-dmso溶液。取30mg聚合度2-6的壳寡糖充分溶于1ml蒸馏水中。将1ml壳寡糖水溶液放置于转速为200rpm的磁力搅拌器上，搅拌过程中取10μl体积，10mg/ml浓度的姜黄素-丙酮溶液，滴入壳寡糖水溶液中，室温下继续200rpm搅拌45分钟。将所获得混合液转移至离心管中，12000rpm离心30分钟。弃去上清液，加入1ml蒸馏水，重复两次离心后即可获得壳寡糖-姜黄素复合纳米粒。所制备的纳米粒子形貌如图4所示，所形成的纳米粒子尺寸为200nm。
48.实施例3：
49.将5mg姜黄素充分溶于1ml甲醇溶液中，取30mg聚合度2-6的壳寡糖充分溶于1ml蒸馏水中。将1ml壳寡糖水溶液放置于转速为400rpm的磁力搅拌器上，搅拌过程中取20μl姜黄素甲醇溶液滴入壳寡糖水溶液中，室温下继续400rpm搅拌30分钟。将所获得混合液转移至离心管中，12000rpm离心30分钟。弃去上清液，加入1ml蒸馏水，混合均匀后，再次12000rpm离心30分钟，弃去上清液，加入1ml蒸馏水，混合均匀后，再次12000rpm离心30分钟，弃去上清液即可获得壳寡糖-姜黄素复合纳米粒。所制备的纳米粒子形貌如图3所示，所形成的纳米粒子尺寸为200nm。
50.实施例4：
51.将5mg姜黄素充分溶于1ml二甲基亚砜dmso中，取90mg聚合度2-6的壳寡糖充分溶于1ml蒸馏水中。将1ml壳寡糖水溶液放置于转速为800rpm的磁力搅拌器上，搅拌过程中取10μl姜黄素dmso溶液滴入壳寡糖水溶液中，室温下继续800rpm搅拌30分钟。将所获得混合液转移至离心管中，12000rpm离心30分钟。弃去上清液，加入1ml蒸馏水，混合均匀后，再次12000rpm离心30分钟，弃去上清液，加入1ml蒸馏水，混合均匀后，再次12000rpm离心30分钟，弃去上清液即可获得壳寡糖-姜黄素复合纳米粒。制备得到的纳米粒子形貌如图2所示，所形成的纳米粒子尺寸为200nm。在不同ph下的释放情况如图10所示，ph 7.4、ph 6.7和ph 5.6释放介质中cos-ccm nps的累积ccm释放量分别约为31％，33％和45％。这表明cos-ccmnps在体外整个释放过程是相对稳定的。分析表明，ccm从cos-ccm中缓慢而持续的释放可能与ccm与cos之间存在更强的相互作用有关。在模拟顺序胃肠道条件下，cos-ccmnps中姜黄素的释放如图19所示。由于溶解性很差，在整个模拟阶段没有检测到游离姜黄素的显
著释放，而不同组别的cos-ccmnps中的姜黄素在胃和肠相均表现出良好的可持续释放。其中不同组别的cos-ccmnps中姜黄素的相对生物利用度分别为15.16倍、14.04、21.65倍、19.27倍，均显著高于游离姜黄素的生物利用度，且如图19所示，肠道期累积释放量高于胃期，这种肠期依赖性释放量有利于姜黄素的生物利用度和生物活性。
52.实施例5：
53.采用mtt法测定各种纳米粒子对不同细胞的增值抑制情况。使用4t1、mcf-7和lo2细胞系测定各种纳米颗粒的细胞毒性。将每种细胞以1
×
104个细胞/孔密度接种于96孔板中，37℃孵育24h待细胞完全贴壁，然后分别给予不同样品处理，继续孵育24h或48h。在预定的时间点，向每个孔中添加20μl 0.5mg/mlmtt，继续孵育4h。然后，移除培养基，并向每孔加入150μldmso溶液，溶解mtt甲瓒晶体。使用elisa酶标仪，测定492nm处吸光度值(od值)，od值大小与活细胞数量成正相关。所有实验均重复三次以上，计算细胞存活率。所得的细胞活性值如图11所示，根据不同药物浓度对应的细胞存活率计算ic
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浓度值，所测定得到的ic
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值趋势如图12-14所示。体外试验验证可以证明，我们制备的纳米制剂可以提高姜黄素的生物利用度，游离姜黄素的纳米颗粒在鼠源乳腺癌细胞4t1中的ic
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值为20.64μg/ml；壳寡糖在4t1的ic
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值为30.08μg/ml；共组装成纳米颗粒后，纳米颗粒在4t1中的ic
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值为10.54μg/ml。说明与壳寡糖共组装的姜黄素的生物利用度有明显改善。
54.实施例6：
55.cos-ccm纳米载药颗粒治疗：当肿瘤体积达到50-100mm3时随机分组进行治疗。根据姜黄素临床应用的剂量需求，所用制剂用量以20mg/kg ccm当量计算使用。将所有荷瘤小鼠随机分成4组，分别经尾静脉注射盐水、ccm注射液、cos-ccm nps和cos-ccm nps+pd1组。治疗频率为化疗组隔天给药，共注射7次，观察14天；化疗免疫结合组第一次给药为化疗药物，之后隔天给药pd1，pd1给药三次，连续治疗14d，每天测量肿瘤体积和小鼠体重。根据公式计算肿瘤体积(v)。纳米粒子的治疗模式及肿瘤体积、肿瘤抑制率结果如图15-18所示，从图中可以明显看出，cos-ccm nps组的老鼠平均肿瘤体积明显抑制，明显高于单独的ccm或者单独的cos。治疗12天后，cos-ccm nps的相对肿瘤抑制率是14.7％，高于单独的ccm组和单独的cos组，呈现明显的协同抗癌作用。