用于广谱降解细胞质蛋白的纳米降解剂及其制备和应用

本发明涉及一种用于广谱降解细胞质蛋白的纳米降解剂及其制备方法和应用，属于纳米制剂领域。

背景技术：

1、蛋白质的功能障碍、异常增多或蓄积会导致各种疾病，例如癌症、帕金森病、囊性纤维化、肌萎缩侧索硬化等。因此，开发降解相关致病蛋白的技术具有广泛的应用前景。近年来，在蛋白降解领域最主要和最热门的降解策略是protac技术。早在2001年，加州理工大学的raymond j.deshaies教授和耶鲁大学的craig m.crews教授首次提出了蛋白水解靶向嵌合体系统(proteolysis-targeting chimaeras，protac)的概念。protac系统主要有三部分组成：1)e3泛素连接酶受体，该部分主要用于招募e3泛素连接酶；2)靶标蛋白受体，该部分主要作用是与目标蛋白相结合；3)linker，该部分主要是将e3泛素连接酶受体与靶标蛋白受体相连接。protac技术的靶点通常是胞内蛋白。但是protac并不能解决所有的靶点问题，目前有很多靶点缺少可以结合的位点，难以开发相应的小分子药物，比如kras和myc等不可成药靶点。protac技术在设计和生产上有很高的技术门槛和挑战，如靶标蛋白配体设计或者发现难度较大；成药性较差，主要表现为透膜性较差，口服利用度差；另外因为其主体为三连体形式，与传统小分子药物相比分子量较大，因此其溶解度可能较差；代谢稳定性和pk/pd方面也有较大障碍；生产方面，与传统小分子药物相比生产难度更大，生产成本更高。

2、除了化学合成的药物可以用于蛋白降解，抗体作为蛋白降解领域的另一个支柱，也可以实现特异、高效的蛋白降解效果。抗体作为蛋白质家族的一种功能成员，由于其特异性高、副作用小，已被广泛探索用于疾病治疗。目前基于抗体的蛋白降解主要包括以下三种策略：lytac(lysosome-targeting chimaeras)、abtacs(antibody-based protacs)以及trim-away。其中，lytac和abtacs仅限于降解细胞膜表面蛋白。该技术主要是通过利用修饰的抗体结合靶标后将靶标蛋白带入溶酶体进行降解。该技术中首先需要对抗体进行修饰—含有甘露糖-6-磷酸化支链n糖原，修饰后的抗体通过甘露糖-6-磷酸支链与细胞膜表面的igf2r(阳离子-非依赖甘露糖-6-磷酸受体)结合，igf2r是一种细胞表面的溶酶体靶向受体，主要作用是介导蛋白质向溶酶体的转运及后续的降解。因此修饰后的抗体与靶标蛋白结合后，通过igf2r进入细胞的溶酶体内，在溶酶体内由于ph的变化，抗体与靶标蛋白分离，并导致靶标蛋白的降解，而修饰后的抗体在igr2r的作用下，通过高尔基体再次转运到细胞膜表面完成循环利用。而abtacs通过设计双特异性抗体，同时结合细胞膜上的e3泛素连接酶和细胞膜上的靶标蛋白，通过胞吞进入细胞并被溶酶体降解。研究人员首先设计了能够结合膜蛋白pd-l1和rnf43的双特异抗体ac-1。rnf43是一个单次跨膜的e3泛素连接酶，包含膜外结构域、跨膜结构域和ring细胞内结构域。ac-1能够结合rnf43的膜外结构域，相当于protac三连体中能招募e3泛素连接酶的e3泛素连接酶受体；结合靶标蛋白的fab部分为靶标蛋白的受体，fc部分为linker。当双抗ac-1结合rnf43和pd-l1后，之后通过胞吞进入细胞并被溶酶体降解。

3、值得注意的是，trim-away主要是一种用于降解细胞质蛋白的策略。其机制涉及细胞内抗体的受体trim21蛋白，该蛋白同时具备e3泛素连接酶活性和与抗体fc段结构域高亲和的双重特性，并且trim21因其不可或缺的生理作用而在各种细胞类型中普遍表达。目前该技术主要通过显微注射或电穿孔在细胞水平递送抗体。

4、本发明主要基于trim-away策略降解细胞质的蛋白。然而，该策略用于蛋白降解方面主要存在以下问题：1)抗体属于大分子蛋白，无法自主进入细胞质内；2)虽然通过显微注射或者电穿孔的方法可以将抗体导入细胞质中，但是需要昂贵的仪器设备、专业的技术人员以及复杂的实验操作，并且需要多次摸索合适的条件，不适合大规模的细胞或体内应用；3)上述技术也可能会对细胞造成严重损伤，特别是电穿孔技术。

技术实现思路

1、针对大分子抗体在用于胞内蛋白降解领域时存在的难以入胞，以及现有降解策略难以推广应用等问题，本发明拟构建一种基于生物矿化方法的纳米降解剂(biomineralized nano-degraders,ban)，主要是在抗体表面覆盖大量的钙磷离子等而形成保护外壳，最终形成纳米颗粒。抗体属于大分子蛋白，其表面的酸性氨基酸残基可螯合钙离子等金属离子，从而提供成核位点，通过与阴离子如磷酸盐等反应并产生微小晶粒来促进原位生物矿化。随着反应时间的延长，晶粒逐渐长大并变得更致密均匀。细胞对纳米颗粒具有天然的易摄取倾向，本研究证明ban主要通过细胞膜表面的网格蛋白入胞途径。此外，细胞将ban主动内吞并运输到溶酶体，然后由于溶酶体内偏酸的环境，离子外壳逐渐溶解。释放的金属离子(钙离子等)通过破坏溶酶体，将抗体从溶酶体中释放出来，并参与泛素-蛋白酶体降解途径从而发挥蛋白降解作用。

2、本发明提供的基于生物矿化方法的纳米降解剂(biomineralized nano-degraders,ban)包含一种生物可降解的矿化纳米粒，以抗体作为蛋白模板在其外层逐渐覆盖钙磷离子等沉淀作为外壳。其中，该沉淀外壳带有正电荷，体内生物相容性较好，易于被细胞摄取和内吞；在偏酸性的环境中，纳米粒外层的钙磷离子等沉淀缓慢降解并释放抗体。抗体一方面识别细胞内的目标蛋白，一方面同时结合胞内的e 3泛素连接酶(trim21蛋白)，最终通过泛素-蛋白酶体途径降解目标蛋白。所述矿化纳米粒的内核是抗体，所述抗体可以是商业化购买或者自制的抗体，抗体均需含有fc段以结合胞内e3泛素连接酶(trim21蛋白)，从而通过后续泛素-蛋白酶体途径进行降解，抗体靶标主要针对细胞质内蛋白质。所述矿化纳米粒的外壳是由金属阳离子和阴离子组成的沉淀物，所述金属阳离子包括大部分过渡金属元素及其他金属的二价、三价阳离子，例如选自下列金属阳离子中的一种或多种：ca2+、co2+、cr3+、fe3+、mn2+、zn2+、ni2+、mg2+、cu2+等水溶性的金属离子；阴离子包括但不限于磷酸根离子、磷酸氢根离子、碳酸根离子、草酸根离子、柠檬酸根离子等水溶性的酸根离子。

3、本发明的纳米降解剂可通过生物矿化的方法制备得到，包括以下步骤：

4、1)配制金属阳离子溶液：将含金属阳离子的化合物配制成水溶液；

5、2)配制阴离子溶液：将含所述阴离子的化合物配制成水溶液；

6、3)将上述金属阳离子溶液和阴离子溶液按适当比例与含有抗体的溶液充分混匀，然后于37℃静置30min～24h，使金属阳离子与相应阴离子逐渐在抗体表面反应形成微沉淀；

7、4)离心去除上清，得到矿化纳米粒。

8、上述步骤1)中，所述含金属阳离子的化合物可溶于水，可选自下列化合物中的一种或多种：氯化钙、氯化钴、氯化铬、氯化锌、氯化铁等。优选的，将含金属阳离子的化合物配制成浓度为10～5000mmol/l的水溶液。

9、上述步骤2)中所述阴离子能与金属阳离子形成沉淀，如磷酸根离子、磷酸氢根离子、草酸根离子和碳酸根离子等。含所述阴离子的化合物能溶于水，通常是碱金属盐，包括但不限于：磷酸氢钠、磷酸钠、草酸钠和碳酸钠。优选的，将含所述阴离子的化合物配制成浓度为10～5000mmol/l的水溶液。

10、也可以采用dmem无血清培养基(中科迈晨，货号cm10013)作为阴离子溶液，该培养基含有浓度为3.27mm的磷酸根离子，在步骤3)将金属阳离子溶液加入含有抗体的dmem无血清培养基中，充分混匀后在37℃进行孵育静置。

11、上述步骤3)的混合液中，所述金属阳离子盐溶液的浓度优选为1mm～2m，所述阴离子盐溶液的浓度优选为1mm～100mm。

12、在本发明的一些实施例中，所述金属阳离子为ca2+，所述阴离子为磷酸根离子或磷酸氢根离子，在步骤3)的混合液中，钙离子的终浓度为10μmol/l～5mmol/l，磷酸根离子和/或磷酸氢根离子的浓度为0.375mmol/l–5mmol/l。优选的，钙离子的终浓度为10μmol/l，磷酸根离子和/或磷酸氢根离子的浓度为3.27mmol/l。

13、上述步骤3)混合液中还可以加入叶酸、透明质酸等可以对纳米粒进行靶向修饰的物质，以促进纳米粒的特异性分布、高效的细胞摄取。

14、上述步骤4)中，一般在12000rpm离心10min，去除上清后的沉淀可以用dmem无血清培养基进行重悬，然后直接进行实验或者在4℃进行短期保存，长期保存则需要真空干燥，冻干后保存于-20℃。

15、优选的，本发明所述含有抗体的纳米降解剂(biomineralized nano-degraders,ban)是粒径为200-500nm的纳米颗粒。该纳米降解剂中抗体外层所覆盖的金属离子微沉淀为生物可降解外壳，可在ph值低于相应阴离子所对应的pka的环境中被溶解。该纳米降解剂易经内吞方式进入细胞，在进入细胞后，离子外壳由于胞质的酸性环境而被降解，释放出的抗体在胞质中通过泛素-蛋白酶体途径降解目标蛋白。

16、与蛋白降解密切相关疾病的治疗包括癌症、神经系统疾病和免疫系统疾病等蛋白异常相关疾病的治疗。在相关研究中，用于蛋白降解相关的细胞系可以是表达trim21蛋白的人源或鼠源细胞系，例如：a549、asc diff、a-431、asc tert1、bj、b16-f10、daudi、fhdf/tert166、gamg、hl-60、hela、hskmc、hbec3-kt、htert-hme1、hsc-t6、hacat、hap1、htcepi、hhstec、hepg2、hdlm-2、hmc-1、hek 293、ht29、hbf tert88、jurkat、karpas-707、lovo、lhcn-m2、molt-4、nci-h1299、nb-4、oe19、pc-12、rptec tert1、siha、susa、sw620、sk-br-3、sk-mel-30、thp-1、u266/84、u87-mg、u-138mg、u-937、u-937、u-251mg等细胞系。所述细胞系还可以是实验室自构建的过表达某蛋白的人源或鼠源细胞系，例如：过表达gfp蛋白的293t细胞系等。

17、与蛋白降解密切相关的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾癌、结直肠癌、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫癌和白血病。与蛋白降解密切相关的神经系统疾病包括但不限于亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病。与蛋白降解密切相关的免疫系统疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征等。

18、本发明所提供的基于生物矿化方法制备的纳米降解剂具有以下优点：

19、1、该纳米降解剂可以作为一个抗体的储库，在组织或细胞内偏酸性的环境中降解并释放出游离的抗体，仅通过简单的替换抗体便可以广谱降解细胞质内蛋白；

20、2、该纳米降解剂所用抗体具有特异性，可以专一降解目标蛋白而无脱靶效应；

21、3、该纳米降解剂可经表面靶向修饰后特异性地分布至靶组织或靶细胞，用于特殊的疾病和肿瘤治疗等；

22、4、该纳米降解剂可以作为一个金属离子的纳米储库，在组织或细胞内偏酸性的环境中降解并释放出游离的金属离子，通过筛选可以协同促进目标蛋白的降解；

23、5、该纳米降解剂可作为胞内递送蛋白质的一种通用工具。

24、综上，本发明的基于生物矿化方法制备的纳米降解剂可以特异、广谱的降解细胞质内目标蛋白，同时具有良好的生物相容性，可用于细胞内特殊蛋白的功能研究(在细胞水平敲低相关蛋白)，以及肿瘤和蛋白异常相关疾病的治疗和预防。