一种抑制维氏气单胞菌的中药组合物及其应用

1.本发明涉及水产动物疾病防治领域，具体涉及一种抑制维氏气单胞菌的中药组合物及其应用。


背景技术：

2.随着人类需求的增加，水产养殖业得到迅猛发展，但随之而来的病害问题也日益严峻。其中细菌性疾病是制约水产养殖业持续健康发展的主要疾病之一，同时也给养殖业造成了巨大的经济损失。常见的水产病原菌有维氏气单胞菌、弧菌、链球菌、爱德华氏菌、诺卡氏菌等。
3.目前，主要采用抗生素治疗由维氏气单胞菌引起的水产动物疾病，导致许多细菌已经产生了耐药性，甚至产生了多重耐药菌株，不仅给鱼病的治疗带来困难，还容易引起环境污染和药物残留等问题。中草药含有众多天然活性成分，即可以抑菌杀菌，也能增强机体的免疫力和抗应激能力，又能从多靶点、多途径作用于病原体进行抑制和杀灭作用，并易于有机体分解转化利用。同时中草药自然来源广、安全性高、残留低、不易引起药源性疾病和产生耐药性，对环境污染也少。因此，中草药在水产养殖中对抗感染性疾病具有很大的优势和应用前景，也是抗生素类药物的理想替代品。
4.以往在中草药对维氏气单胞菌的抑制活性研究中，主要局限在中草药的粉未或粗提物进行抑菌试验，其存在着很多的缺点，如有效成分含量低，原料用量大，疗效慢以及应用不方便等。针对此现象，研究与开发活性高的中草药有效部位的新组方用于预防和治疗水产疾病药物尤为重要。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种抑制维氏气单胞菌的中药组合物，该中药组合物各组分协同增效，对感染维氏气单胞菌的大口黑鲈具有很好保护作用。
6.本发明是通过以下技术方案实现：一种抑制维氏气单胞菌的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的组分组成：五倍子提取物2-5份石榴皮有效部位1-3份山竹壳提取物2-4份黄芩有效部位1-3份。
7.五倍子为漆树科植物盐肤木属植物叶上的虫瘿，产自广西桂林，属于“肚倍”。经研究，五倍子50%乙醇提取物中总鞣质含量较高，因此，优选的，所述五倍子提取物为50%乙醇提取物，五倍子提取物中总鞣质含量大于60%。
8.山竹壳是将新鲜山竹果实，除去果肉，烘箱60℃烘干得到。山竹壳提取物中主要的有成分类型为xanthones，经研究，山竹壳70%乙醇提取物中xanthones含量较高，因此，优选的，所述山竹壳提取物为70%乙醇提取物，山竹壳提取物中α-mangostin含量大于15%.。
9.本发明的五倍子提取物和山竹壳提取物可以通过将原料经醇提取后过滤、浓缩、干燥即得。
10.优选的，所述石榴皮有效部位的制备方法，具体包括如下步骤：（1）取干燥石榴皮，粉碎，加入10-16倍量的体积浓度为50-60%的乙醇浸泡1-2小时，再加热回流提取1-2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，减压浓缩干燥，得石榴皮提取物；（2）将石榴皮提取物用水超声溶解，缓慢吸附于大孔树脂，静置过夜，分别用水、50%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱部位，即得石榴皮有效部位。
11.优选的，步骤（2）中，所述大孔树脂为dm301大孔树脂。
12.石榴皮中含有丰富的鞣质类成分，对其生物活性起着重要作用。通过dm301大孔树脂对其提取物进行分离纯化，得到了抗菌活性明显增强的有效部位，即50%醇洗部位；其中的鞣质含量从提取物中的22.6%增加到有效部位的49.2%，其重量为提取物的37.1%。而水洗以及95%醇洗部位的鞣质含量都低于10%，没有表现出明显的抑菌活性。因此，我们选择石榴皮的的50%醇洗部位作为其抑菌活性的有效部位。
13.优选的，所述黄芩有效部位的制备方法，具体包括如下步骤：（1）取干燥黄芩，粉碎，加入12-16倍量的体积浓度为60-70%的乙醇浸泡1-2小时，再加热回流提取1-2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，减压浓缩干燥，得黄芩提取物；（2）将黄芩提取物用水超声溶解，缓慢吸附于大孔树脂，静置过夜，分别用水、70%乙醇、95%醇进行梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱部位，即得黄芩有效部位。
14.优选的，步骤（2）中，所述大孔树脂为hpd100大孔树脂。
15.黄芩为唇行科植物黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)的根，黄芩中含有丰富的黄酮类成分，是其发挥药理作用的主要成分。通过hpd100大孔树脂对其提取物进行分离纯化，得到了抗菌活性明显增强的有效部位，即70%醇洗部位；其中总黄酮的含量从提取物中的43.8%提高到有效部位的78.3%，其重量为提取物的50%。而其它水洗部位和95%醇洗部位的总黄酮含量分别为7.9%和7.0%，没有表现出明显的抑菌活性。因此，我们选择黄芩的70%醇洗部位作为其抑菌活性的有效部位。
16.本发明另一方面还提供了上述中药组合物在制备预防或治疗由维氏气单胞菌引起的水产动物疾病的药物中应用。
17.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：本发明通过组方及有效部位的筛选，以五倍子提取物、石榴皮有效部位、山竹壳提取物和黄芩有效部位配伍组方，经体内抗维氏气单胞菌药效实验，结果表明，各组分协同增效，对感染维氏气单胞菌的大口黑鲈具有很好保护作用，为预防和治疗由维氏气单胞菌引起的水产动物疾病提供了新的药物。
具体实施方式
18.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
19.【五倍子提取物的制备】称取干燥五倍子10kg，粉碎，加入15倍量的体积浓度为50%乙醇浸泡2小时，再加热回流2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得五倍子提取物干样品6.5kg，提取率65%。采用中国药典通则2202的鞣质含量测定法测定了五倍子提取物中总鞣质含量,结果表明其鞣质含量高达72%。
20.【山竹壳提取物的制备】称取干燥山竹壳10kg，粉碎，加入15倍量的体积浓度70%乙醇浸泡2小时，再加热回流提取2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得山竹壳提取物干样品1.7kg，提取率为17%,通过hplc法测得在山竹壳提取物中α-mangostin的含量为20.5%。
21.【石榴皮有效部位的制备】称取干燥石榴皮10kg，粉碎，加入15倍量的体积浓度50%乙醇浸泡2小时，再加热回流提取2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得石榴皮提取物干样品4.1kg，提取率为41%,采用中国药典通则2202的鞣质含量测定法测定其鞣质含量为22.6%；将石榴皮提取物用水超声溶解，缓慢吸附于dm301大孔树脂，静置过夜，分别用水、50%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱部位作为石榴皮有效部位，采用中国药典通则2202的鞣质含量测定法测定其鞣质含量为49.2%。
22.【黄芩有效部位的制备】称取干燥黄芩10kg,粉碎，加入15倍量的体积浓度70%乙醇浸泡2小时，再加热回流提取2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得黄芩提取物干样品3.3kg，提取率为33%，通过紫外分光光度法测得总黄酮含量为43.8%；将黄芩提取物用水超声溶解，缓慢吸附于hpd100大孔树脂，静置过夜，分别用水、70%乙醇、95%醇进行梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱部位作为黄芩有效部位，通过紫外分光光度法测得总黄酮含量为78.3%。
[0023] 【中药组合物的制备】将各有效部位按表1组方进行混合，即得。
[0024]
表1实施例和对比例的组合物组成（重量份）
实施例4：体外抑菌活性
‑‑‑
最小抑菌浓度（mic）测定4.1供试菌株维氏气单胞菌（aeromonas veronii）th0426由浙江省淡水水产研究所提供，从患病黄颡鱼中分离得到。已对菌种进行了形态、染色、生理生化反应和16s rrna基因序列分析等鉴定（参见：黄颡鱼“溃疡综合征”病原的分离鉴定及药敏试验，淡水渔业，2015，45(5)：100-104）。
[0025]
药液：实施例1制备得到的中药组合物用dmso配成160 mg/ml，作为母液待用。
[0026]
最小抑菌浓度(mic)测定参照clsi标准，采用平皿二倍稀释法进行抗菌mic测定。准备6根15 ml的离心管，在第一根离心管中加入0.126 ml的实施例1的中药组合物母液，再加入1.937 ml无菌纯净水混匀。随后，从第1根离心管中吸取1 ml 稀释药液加入到已装有1 ml无菌水的第2根离心管中，振荡使其混合均匀；再从第2根离心管中吸取1 ml稀释药液加入到已装有1 ml无菌水的第3根离心管中，振荡使其混合均匀；依次类推，最后从第6根离心管中吸出1ml药液弃去，使每根离心管中保留1 ml药液。然后，在每根离心管中加入45 ~ 50 ℃的mh琼脂培养基13 ml。将药液与培养基充分混匀后倒入培养皿中，放置于水平超净台上，待琼脂自然凝固后备用。
[0027]
将菌株接种于在mh液体培养基中，于35℃恒温摇床160 r/min中培养16h，菌液用无菌生理盐水稀释至1
×
10
8 cfu/ml（标准平板计数法）。将2.5
ꢀµ
l/点的细菌悬浮液接种至含有不同浓度药液（0.023~0.72 mg/ml）的mh琼脂培养基上，每个接种点均设3个重复。随后，将平板倒置于35 ℃培养箱培养24 h后观察结果。以盐酸恩诺沙星为阳性对照，dmso为阴性对照。肉眼观察若无细菌生长即记为中药组合物对该病原菌的mic。
[0028]
结果表明，该中药组合物对维氏气单胞菌th0426表现出较强的抑制作用，其mic值为0.18mg/ml。
[0029]
实施例5 体内抗维氏气单胞菌药效实验5.1维氏气单胞菌(th0426)：由浙江省淡水水产研究所从患病的黄颡鱼中分离、鉴定。
[0030]
实验鱼试验用健康大口黑鲈由浙江省淡水水产研究所八里店基地提供，试验用鲈鱼为该场自繁自育，平均规格为25g/尾左右，鲈鱼的规格整齐，鳞片和鳍条完整、体色正常、无畸无伤，体表无出血，游动和摄食正常，购入前随机从池塘中捕出5尾，对鳃和鳍条镜检无寄生虫；肝、肾用tsa平皿细菌分离培养结果无细菌感染。
[0031]
饲料基础饲料购自天邦饲料有限公司宁波分公司。饲料的粗蛋白含量≥28.5%,粗脂肪≥3.0%,粗纤维≤10.0%,粗灰分≤18.0%,总磷≥0.5%,水分≤120.0%,赖氨酸≥1.5%。
[0032]
试验饲料为在基础饲料的基础上再分别添加0%、0.1%、0.3%和0.6%的中药组合物(实施例1)，分别为空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。以添加0.05%盐酸恩诺沙星的基础饲料作为阳性对照组，以添加0.1%对比例1制备得到的中药组合物的基础饲料作为药物对照组。简单地说，在基础日粮中加入不同含量的药物水溶液，混合均匀，干燥，即得不同的试验饲料。临时配制使用，所有试验饲料均储存在4℃冰箱中，备用。
[0033]
饲养管理试验用健康大口黑鲈在实验室条件下暂养2周，随后将初始体重约为28.0
±
2g的大口黑鲈随机分为空白对照组、低中、高剂量组、和阳性对照组、药物对照组6个试验组，每组设3个重复，每个平行10尾鱼。分别饲喂含0%、0.1%、0.3%、0.6%的实施例1制备得到的中药组合物、0.05%恩诺沙星、0.1%的对比例1制备得到的中药组合物的试验饲料。每天9点和17点饲喂试验饲料，每次饲喂量约为鱼体重的2-3%。为保持饲养条件，每天吸污换水（换水量不超过水体1/3）以确保水质，24h连续充气增氧，期间保持水温28
±
1℃，ph=8.5，溶解氧不低于6mg/l。
[0034]
攻毒试验将分好组的健康大口黑鲈分别采用相应的饲料喂养5d，随后进行攻毒试验。将维氏气单胞菌(th0426)菌株，接种于mh液体培养基中，于28℃恒温摇床160 rpm培养16h。于离心机中5000rpm离心10min，弃去培养基，用pbs缓冲溶液重新配成悬浮液，通过紫外分光光度计测量菌液的od
600
，使其浓度达到攻毒菌液浓度1.45
×
108cfu/ml。将饲喂5天后的所有大口黑鲈进行攻毒，每尾鱼腹腔注射100μl维氏气单胞菌菌液。攻毒后连续观察7天，记录鱼的情况，统计死亡率，计算保护率。
[0035]
攻毒结果如表2所示：表2喂食中药组合物5天并感染维氏气单胞菌大口黑鲈的死亡率和保护率
从表1结果可见，本发明制备得到的中药组合物对感染维氏气单胞菌的大口黑鲈具有很好保护作用。通过饲喂含中药组合物0.1%、0.3%、0.6%的饲料，对攻毒维氏气单胞菌后，其低、中、高剂量组的保护率分别达到13.3%、40%、56.7%，而空白对照组则全部死亡。
[0036]
通过饲喂含0.1%的对比例1制备得到的中药组合物的饲料，虽然对感染维氏气单胞菌的大口黑鲈具有一定的保护作用，但其保护作用较小。由此表明，本发明的中药组合物各组分之间具有协同增效作用。