具有级联反应功能的DNA水凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及生物化学纳米材料，具体涉及一种具有级联反应功能的dna水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、实体肿瘤具有严重缺氧、过氧化氢(h2o2)含量升高和过表达谷胱甘肽(gsh)的特征。特殊的肿瘤微环境促进了癌症的扩散和转移，这使得难以通过单一疗法完全治愈癌症。研究发现许多用于治疗癌症的纳米颗粒具有良好的治疗效果，且毒副作用较低，如dna纳米颗粒、硅纳米颗粒等。尽管已经进行了大量的实验研究，以纳米材料为基础的肿瘤诊疗方法仍面临着巨大的挑战。

2、由于其精准的沃森-克里克配对及简单的合成过程，dna已经被应用于许多研究领域，其中dna纳米技术是一项重要的应用。g-四链体(g-quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(g)的dna或rna折叠形成的高级结构，当g-四链体与血红素形成复合物(g4/h)后，将具有过氧化氢酶活性，催化h2o2介导的反应。

3、饥饿治疗是一种新兴的治疗方法，通过阻止营养供应，以抑制肿瘤生长。由于阻断肿瘤细胞的营养物质和能量的供给，仅仅会延迟肿瘤恶化的过程，仍然难以达到理想的治疗效果。因此，发展与饥饿治疗相结合的协同疗法在癌症的治疗中具有深远意义。光动力疗法(pdt)由于其高选择性、低副作用和良好的适应性而迅速发展。然而，缺氧诱导因子-1α(hif-1α)作为介导细胞缺氧反应的最重要的转录因子之一,可通过促进肿瘤血管的形成、提高细胞的糖酵解水平等作用，使肿瘤适应缺氧环境。大量实验结果表明，肿瘤在缺氧的微环境中，pdt治疗效果明显降低。

4、针对以上现有问题以及dna水凝胶的优点，目前亟需研究一种新兴的治疗恶性肿瘤的dna纳米水凝胶及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：克服单一治疗方式的缺陷，提供一种由dna分子自组装形成的具有高效，毒副性较低，生物相容性较好等优点的高效治疗恶性肿瘤的水凝胶的制备。

2、本发明的技术方案为：

3、具有级联反应功能的dna水凝胶的制备方法，首先设计直链dna复制模板，通过滚环复制的方式形成纯dna体系的水凝胶，直链dna中设计了as1411核酸适体互补序列和缺氧诱导因子hif-1α的反义dna的互补序列，在复制过程中产生大量hif-1α的反义dna和as1411核酸适体序列，然后将胆固醇修饰的核酸适体as1411序列，通过waston-crick碱基互补配对原则杂交，离心后自组装形成dna水凝胶纳米结构。

4、进一步地，所述直链dna复制模板的核苷酸序列如seq id no.1所示，且5’端磷酸化。

5、进一步地，所述的核酸适体为fam-as1411-chol，其为seq id no.3所示的核苷酸序列且5’端修饰有fam基团、3’端修饰有胆固醇。

6、优选的，具体步骤如下：

7、(1)取seq id no.1所示且5’端磷酸化的直链dna模板与引物以相同浓度进行退火处理；

8、(2)加入t4连接酶及t4连接酶缓冲液，室温维持6h，形成dna转录模板；

9、(3)加入phi29 dna聚合酶，dntp，phi29 dna聚合酶缓冲液以及bsa在30℃下维持8h，形成高聚物dna水凝胶载体；

10、(4)将步骤(3)得到的dna水凝胶载体与及靶向肿瘤细胞的as1411核酸适体在含有k+的缓冲溶液内95℃下维持5min，缓慢降至25℃，在4℃冰箱中放置2h，8000rpm离心，形成最终dna水凝胶载体。

11、(5)将步骤(4)得到的dna水凝胶血红素和二氢卟吩e6混合，在25℃下维持2h，缓慢降至25℃，通过10kda的超滤管，8000rpm离心5min洗涤3次后，将溶剂替换为灭菌水，形成负载ce6、hemin的dna水凝胶；

12、(6)将步骤(4)得到的dna水凝胶与血红素和二氢卟吩e6混合，在25℃下维持2h，缓慢降至25℃，通过10kda的超滤管，8000rpm离心5min洗涤3次后，将溶剂替换为灭菌水，形成负载ce6、hemin的dna水凝胶；

13、(7)将葡萄糖氧化酶溶解在5mm碳酸氢盐缓冲液(ph 8.3)中至1mg/ml，将200mg/ml丙烯酰胺(aam)添加到1ml葡萄糖氧化酶溶液中，在4℃下搅拌10min，搅拌下加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apmaam)、二甲基丙烯酸甘油酯(gda)、30μl过硫酸铵和3μl的n，n，n'，n'-四甲基乙二胺，继续反应4h，然后在超速离心装置(mwco 30kda，millipore)中用磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4)更换缓冲液以除去过量的单体和引发剂。即得到用正电荷聚电解质包裹的葡萄糖氧化酶纳米颗粒n(gox)。

14、(8)将步骤(6)得到的dna水凝胶与步骤(7)得到的n(gox)按一定比例混合，25℃摇床30min混合，用100kda的超滤管超滤，形成最终的具有级联反应功能的dna水凝胶。

15、进一步地，所述退火处理的方法为：在含有k+的缓冲液中加热至95℃维持5min，随即1℃/min冷却至25℃，使as1411核酸适体形成g四链体。

16、进一步地，所述n(gox)制备所用试剂比例为：aam/apmaam/gda的摩尔比为10/1/0.15。

17、本发明中，所述的血红素与as1411形成的g四链体结合(ah)具有过氧化物酶催化活性，能催化肿瘤内源过氧化氢生成氧气。

18、所述的gox消耗氧气与葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。

19、述ce6将氧气转化为具有细胞毒性的单线态氧，实现恶性肿瘤的光动力治疗。

20、所述的hif-1α反义dna的互补序列可通过与hif-1α反义dna序列互补配对，从而下调hif-1α，进一步促进肿瘤的光动力治疗。

21、本发明的具有级联反应功能的dna水凝胶在恶性肿瘤靶向治疗药物上的应用。

22、核酸适体，是使用的苏州大学刘庄课题组通过筛选选出来的适体。与肿瘤细胞表面核仁素特异性结合，从而实现靶向给药。在后续实验工作中作为对照组而构建的dna基因纳米探针，也具有一定的靶向治疗作用。

23、胆固醇(chol)，具有疏水性，可以促进dna的转录副本形成纳米结构，同时也增强了结构的稳定性。

24、水凝胶是一种具有三维网状结构的具有亲水性的高分子聚合物，本发明所采用的是超分子水凝胶，该类水凝胶是以dna直接构建，以dna自组装技术及高速离心作用实现水凝胶的形成。该水凝胶通过waston-crick和hoogsteen碱基互补配对原则精准组装，耗时短且生物相容性较好，对靶向性细胞肿瘤细胞的抑制生长作用及生物医药等领域具有广阔前景。

25、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

26、本发明的dna核酸水凝胶成功应用于药物缓释体系，生物相容性较好，且g4链体结构的加入使该dna水凝胶可同时递送多种治疗型基因以及治疗药物，同时对靶向性肿瘤细胞的抑制生长作用及生物医药等领域具有广阔前景。