多功能钙锰纳米调制器通过重塑肿瘤微环境抗肿瘤及增强免疫治疗

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种多功能钙锰纳米调制器通过重塑肿瘤微环境抗肿瘤及增强免疫治疗。


背景技术：

2.肿瘤是一种严重危害生命健康的疾病，并被认为是人类社会不断发展的重要阻碍。据估计，到2040年，全球将会有两千八百万的肿瘤患者。目前，传统的治疗方法(手术、药物和放疗)以及新兴的治疗方法(免疫治疗、光热治疗、光动力治疗、基因治疗、声动力治疗等等)已被开发和广泛地应用。然而，这些治疗方法的治疗效果仍不能让人满意。在这些方法中，通过训练机体免疫系统达到抗肿瘤目的的免疫治疗方法拥有巨大的优势和良好的应用前景而备受关注，特别是，单克隆抗体药物针对免疫检查点的治疗方法已展现出了巨大的潜力。同样地，免疫治疗也同样具有明显的缺点，如较低治疗响应性和伴随一系列严重的副反应等。深入研究发现，肿瘤微环境是不良治疗效果的主要原因。其中，肿瘤微环境具有低ph、乏氧、较高活性氧和异常的代谢活动等特点。这主要是由于肿瘤组织具有较高的异质性，包括肿瘤干细胞、基质细胞、肿瘤相关纤维细胞、肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞等多种细胞组成，肿瘤组织的高异质性导致重塑与正常细胞不同的微环境和功能，促进肿瘤的发展。因此，肿瘤微环境中的代谢已经成为有效的肿瘤治疗靶点。
3.在正常的生理条件下，细胞代谢稳态受到复杂多变的信号调控网络进行调控。这些信号通路中的关键蛋白的功能收到生物离子的调控，如ca2+,mn2+,fe2+/3+,cu+/2+,zn2+,mg2+,等等，这些离子既具有各自的生物学功能，也具有营养学的功能，调控细胞的生长和生存，当这些离子含量失衡时，通常导致致命的后果，甚至是细胞死亡。更为重要的是，有一部分离子已被证实参与调控机体免疫系统阻滞疾病的进展。因此，诱导细胞内离子过载已被探索成为一种有效的肿瘤治疗方法。在众多离子中，ca2+作为一种机体必需的大量元素，已被证实在机体中具有多种不同的生物学功能，例如，调节细胞内信号通路，细胞稳态和细胞死亡等。基于这些考虑，细胞内ca2+浓度震荡将会导致系列生物学过程产生变化，包括改变磷脂双分子层的电荷，进而促进t细胞激活和免疫反应。当树突细胞内的钙离子含量过多时，将会导致细胞内钙库的破坏，进而形成内源性信号分子并诱导自噬产生，促进抗原呈递过程，最终诱导免疫系统产生免疫反应。因此，基于钙离子的肿瘤治疗方法已在多种肿瘤中取得了良好的治疗效果。例如，可变形核壳纳米声敏剂(tio2@cap)在酸性肿瘤微环境条件和超声处理条件下，降解其cap外壳，释放钙离子，增强ros生成效率，导致线粒体功能障碍和免疫原性细胞死亡，结合pd1抗体药物治疗，有效募集t细胞和浸润，激活系统性抗肿瘤效果，抑制远端肿瘤生长和肺转移。除了钙离子外，锰离子由于其酶活性和免疫系统激活过程中的重要作用也备受关注。锰离子能够增强cgas对损伤dna的灵敏度，促进cgamp合成以及增强去结合sting能力，导致细胞内的cgas-sting信号通路过度活化并激活免疫系统。锰离子也可以直接激活cgas，诱导固有免疫系统激活，促进巨噬细胞和树突细胞抗原呈递
过程，也能促进毒性t淋巴细胞的浸润和杀伤能力，促进免疫记忆形成增强机体免疫检测能力。因此，锰离子能够显著改善免疫治疗效果，并已经被认为是一种有效的免疫佐剂。基于此，锰离子在疾病治疗领域展现出了极大的潜力。此外，还有部分研究结果显示锰离子能够重塑肿瘤微环境而改变治疗效果。
4.然而，截止到目前为止，双离子过载调节的肿瘤治疗方法尚未见到。肿瘤的靶向递送实现肿瘤部位的离子过载也仍然是肿瘤治疗急需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种纳米颗粒，其为多功能钙锰纳米调制器。
6.第一方面，本发明提供了一种纳米颗粒，其包括细胞膜及包裹在其中的钙离子增强剂、碳酸钙和二氧化锰。
7.上文中，所述细胞膜为b16f10细胞膜。
8.上文中，所述钙离子增强剂为姜黄色素。
9.所述纳米颗粒还可以包括荧光分子，在本发明的实施例中，荧光分子具体为ce6。
10.在本发明的实施例中，纳米颗粒由细胞膜及包裹在其中的钙离子增强剂、碳酸钙和二氧化锰组成。或，纳米颗粒由细胞膜及包裹在其中的钙离子增强剂、碳酸钙、二氧化锰和荧光分子ce6组成。
11.上文中，所述细胞膜：姜黄色素：碳酸钙：二氧化锰的配比为170-230μg：0.35-0.41mg：2.7-3.3mg：3mg；
12.或，所述细胞膜：姜黄色素：碳酸钙：二氧化锰的配比为200μg：0.38mg：3mg：3mg。
13.上文中，所述纳米颗粒的粒径小于等于450nm。
14.第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述纳米颗粒的方法，包括如下步骤：
15.1)制备caco
3-cu@mno2和细胞膜；
16.所述制备caco
3-cu@mno2的方法如下：先将二氧化锰纳米片、cacl2和姜黄色素在水中混匀，再加入na2co3，再次混匀，收集沉淀，得到caco
3-cu@mno
2；
17.所述cacl2、所述姜黄色素和所述二氧化锰纳米片的加入质量比为2.7-3.3：0.7-1.3:3；
18.在本发明的实施例中，所述cacl2、所述姜黄色素和所述二氧化锰纳米片的加入质量比为3mg：1mg:3mg：
19.所述na2co3的加入量为使其在体系中的质量大于所述cacl2，在本发明的实施例中，na2co3的加入量大于等于3mg；
20.上述混匀为室温搅拌6h，上述再次混匀为快速搅拌过夜；上述收集沉淀为离心收集沉淀；
21.在本发明的实施例中，制备caco
3-cu@mno2的方法如下：先向10ml上述1制备的含有3mg二氧化锰纳米片(mno
2 nss)的二氧化锰纳米片悬浮液中加入3mg cacl2和1mg姜黄色素(curcuminoid，简称为cu)(cacl2,cu和mno
2 nss的质量比3:1:3),室温搅拌6h，再加入500μg/ml过量(大于等于6ml，此次加入的是6ml)的na2co3水溶液，快速搅拌过夜。16437g离心10min收集沉淀获得caco
3-cu@mno2；
22.所述细胞膜为裂解b16f10细胞获得；
23.在本发明的实施例中，上文的细胞膜的制备方法如下:
24.1)-1、裂解b16f10细胞，收集裂解液；
25.1)-2、将所述裂解液匀浆后，收集匀浆后的溶液；
26.1)-3、将所述匀浆后溶液3500g离心5min，收集上清；
27.1)-4、将所述1)-3得到的上清液继续20 000g离心15min，继续收集上清，
28.1)-5、将所述1)-4得到的上清100 000g离心30min，收集沉淀，得到细胞膜；
29.2)将所述caco
3-cu@mno2和所述细胞膜混匀后，过膜挤压，收集得到权利要求1-4所述纳米颗粒；
30.所述caco
3-cu@mno2和细胞膜的配比为4.7-5.3mg：200μg；
31.在本发明的实施例中，所述caco
3-cu@mno2和细胞膜的配比为5mg：200μg；
32.上文的所述caco
3-cu@mno2和细胞膜的配比为所述caco
3-cu@mno2和细胞膜的蛋白的质量比。
33.所述过膜的孔径为450nm。
34.在本发明的实施例中，制备cm nps：将100μl上述制备的浓度为2mg/ml的b16f10细胞膜悬浮液与2.5ml浓度为2mg/ml的caco
3-cu@mno2溶液混合均匀(细胞膜(蛋白质体现)和caco
3-cu@mno2的质量比为200μg：5mg)，再通过450nm聚碳酸酯膜(millipore,ys-tb-gttp09030)物理挤出，重复30次，收集挤出的溶液，然后14005g离心15min，收集沉淀，得到cm nps，即为细胞膜包覆纳米材料，命名为cm nps。
35.第三方面，第一方面的纳米颗粒在制备抗肿瘤产品中的应用也是本发明保护的范围。
36.在本发明的实施例中，肿瘤具体可以为黑色素瘤等。
37.第四方面，第一方面的纳米颗粒在制备重塑肿瘤微环境瘤产品中的应用。
38.上文中，重塑肿瘤微环境具体体现在:第一方面的纳米颗粒的加入导致细胞内的酸度减弱、调节肿瘤细胞内的乏氧程度、细胞内钙离子含量显著升高、导致ros产生增加、诱导肿瘤细胞产生免疫源性细胞死亡和/或诱导免疫系统激活。
39.第五方面，第一方面的纳米颗粒在制备提高免疫治疗肿瘤效果的产品中的应用也是本发明保护的范围。
40.第六方面，第一方面的纳米颗粒和免疫治疗剂在制备免疫治疗肿瘤或提高免疫治疗肿瘤产品中的应用也是本发明保护的范围。
41.第七方面，本发明提供了一种产品，其包括第一方面的纳米颗粒和免疫治疗剂；
42.所述产品具有如下至少一种功能：
43.1)抗肿瘤；
44.2)提高免疫治疗效果；
45.3)免疫治疗。
46.上文中，免疫治疗剂为免疫检查点(pd1)抑制剂，具体为αpd1。
47.本发明合成一种新型的钙锰纳米材料，其具有较高的肿瘤靶向能力导致其能累积于肿瘤组织，自身的药物组成导致其具有较高的药物负载率和药物动力学，基于离子的肿瘤微环境重塑能力协同增强肿瘤治疗效果。基于钙离子和锰离子的生物学功能，推断将钙离子和锰离子过载有机结合能够实现有效抗肿瘤，并实现增强的免疫治疗。值得注意的是，
由于更高的代谢要求，肿瘤细胞能够积累更多的离子。因此，基于双离子的肿瘤治疗策略具有更好的肿瘤治疗效果。
48.本发明的ph响应的纳米药物(cm nps)，包载有姜黄色素(cu，一种钙离子增强剂)、碳酸钙和二氧化锰，并利用细胞膜包裹提高肿瘤靶向效率。cm nps旨在通过离子浓度震荡达到重塑肿瘤微环境和抗肿瘤效果。cm nps能够通过碳酸钙分解的方式中性化细胞内的低ph，减弱细胞内的酸度，同时释放姜黄素和钙离子，钙离子浓度震荡引起线粒体和内质网中钙库损坏和ros增加，导致细胞免疫原性细胞死亡。同时，降解生成的锰离子催化细胞内源性的过氧化氢生成氧气减轻肿瘤细胞内的乏氧程度，并提高cgas对游离核苷酸的敏感度，激活cgas-sting信号通路进而激活机体免疫反应。同时，通过重塑微环境，能够使巨噬细胞极化，增加抗原呈递细胞的作用，促进免疫系统激活与成熟，更加有效地杀灭肿瘤细胞。并且能够提升肿瘤对pd1的响应性，实现增强的免疫治疗。因此，本研究具有良好的临床应用研究基础，并能够与其他治疗方法进行联用实现多模态的肿瘤联合治疗。
49.本发明通过生物矿化的方法构建了一个双离子过载的纳米治疗体系(b16f10@caco3-cu@mno2,命名为cm nps)，cm nps由b16f10细胞膜包裹获得。在肿瘤微环境中，通过碳酸钙的分解和钙离子增强剂(姜黄色素，cu)使钙离子过载，mno2降解使锰离子过载。cm nps通过多重作用实现抗肿瘤效果：i)b16f10细胞膜包裹保证cm nps被动靶向于肿瘤组织，导致肿瘤细胞的快速摄取和积累；ii)通过h+响应和消耗生成的钙离子和cu导致细胞内的钙离子过载，ros生成增加以及免疫原性细胞死亡；iii)锰离子降低细胞内的乏氧程度和增强ros生成速率，促进免疫细胞的增殖和成熟。结合此项研究中制备得到的纳米治疗体系，双离子过载肿瘤治疗方法获得了良好的抗肿瘤效果，并且，增强了免疫治疗效果以及免疫检查点抑制剂的响应性。
50.总而言之，制备了cm nps纳米药物治疗体系，cm nps具有ph响应性药物释放能力以及通过多个步骤重塑肿瘤微环境。在肿瘤细胞中，cm nps使钙离子过载，诱发免疫原性细胞死亡，并逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态。共负载的cu沉淀在二氧化锰纳米片表面，并经肿瘤细胞膜包裹有助于nps递送，降低机体清除率和提高肿瘤靶向能力。由于碳酸钙可以有效地与质子反应，cm nps可以作为有效的质子清除剂并消耗细胞内质子，逆转肿瘤酸度并提高ph值，利于ros生成。二氧化锰产生的锰离子消耗过氧化氢并诱导ros的产生，过载的钙离子破坏线粒体和内质网中的钙库，诱导细胞内氧化压力增加，结合锰离子生物功能，诱导免疫原性细胞死亡并激活免疫反应。尾静脉注射纳米材料，cm nps在肿瘤部位的高效增强，具有良好的生物安全性，并对黑色素瘤表现出抗肿瘤作用和抗肿瘤免疫治疗效果。此外，cm nps增强了αpd1产生的抗肿瘤响应性。然而，需要检测更高浓度的所制备的纳米材料的抗肿瘤效果。总之，这项研究的结果为通过改变体内必需离子的含量并在体内实现抗肿瘤作用来重新编程肿瘤微环境提供了一种新的策略。此外，这种策略还可以作为一种补充方法的巨大潜力，增强其他疗法的效果，特别是在癌症的免疫疗法中，并在未来提供多模式临床治疗。
附图说明
51.图1为cm nps的表征检测图，a为tem成像，b为sds分析结果，c为cm nps的粒径检测，d为zeta电位检测,e为uv-vis-nir光谱检测,f为不同ph值pbs溶液中cm nps降解表观
图，g为不同ph值pbs溶液中cm nps降解率结果,h为icp-oes检测钙和锰含量。
52.图2为cm nps在体外重塑肿瘤微环境检测结果，a为cm nps体外酸弱化检测结果，b为cm nps过氧化氢分解表观图，c为cm nps过氧化氢分解含量检测，d为cm nps在过氧化氢溶液中诱导ros生成情况检测。
53.图3为cm nps的体外细胞摄取与治疗效果检测，a为ce6能够被成功负载至cm nps检测结果，b为不同时间cm nps被b16f10细胞摄取检测，c为不同时间cm nps被b16f10细胞摄取检测统计结果，d和e分别为b16f10和raw264.7细胞内的锰和钙含量摄取结果,f为cm nps的溶血比例检测，g-i分别为293t、hela和raw 264.7加入cm nps的存活率检测，j为calcein am/pi荧光染色检测cm nps的体外细胞治疗效果,k为annexin v-fitc/pi染色流式细胞术检测cm nps的体外细胞治疗效果。
54.图4为mno
2 nss的stem-eds分析结果图，a为从左至右分别为白光图,mn元素图，o元素图以及merge图片，b为元素含量统计图。
55.图5为cm nps的stem-eds分析结果图，a依次为白光图，mn,c,s，n,o,ca，n,b为元素含量统计图。
56.图6为bcecf检测细胞内的ph值变化的荧光强度定量统计结果。
57.图7为b16f10细胞培养基加入氯化钴模拟乏氧环境后乏氧探针荧光成像示意图。
58.图8为cm nps的细胞内肿瘤微环境检测结果，a和b分别为cm nps处理的细胞内质网和线粒体内钙离子含量的表型，c为cm nps处理的细胞和培养基中钙离子含量；d为cm nps诱导细胞内产生ros；e为cm nps诱导细胞内的过氧化氢降解检测，f为western blotting检测cm nps免疫原性细胞死亡的markers，g为cm nps诱导atp释放检测，h为cm nps处理导致b16f10细胞内的ifnγ含量增加，i为cm nps处理导致raw264.7细胞内的ifnγ含量增加。
59.图9为不同的纳米材料处理巨噬细胞极化检测结果，a为巨噬细胞极化cd80和cd206的免疫荧光成像示意图，b为m1巨噬细胞过氧化氢产量。
60.图10为cm nps的体内靶向性检测，a为cm nps注射小鼠后荧光成像系统检测肿瘤部位，b为cm nps注射小鼠后肿瘤部位的荧光强度，c为cm nps注射小鼠后器官离体荧光成像，其中lv表示肝脏，lu表示肺，he表示心脏，sp表示脾脏，ki表示肾脏，tu表示肿瘤，d为cm nps注射小鼠后器官离体荧光强度检测，e为cm nps注射小鼠后血液中的mn元素浓度,f为不同时间不同组织中锰元素浓度。
61.图11为cm nps在balb/c nude mice体内抗肿瘤效果检测，a为cm nps注射小鼠后肿瘤大小，b为cm nps注射小鼠后肿瘤体积，c为cm nps注射小鼠后肿瘤重量，d为cm nps注射小鼠后肿瘤组织中ros检测，e为cm nps注射小鼠肿瘤组织he、ki67和caspase-3染色。
62.图12为cm nps在balb/c nude mice.体内的生物安全性检测中体重和生存率显示结果，a为小鼠体重变化统计结果；b为小鼠生存率统计结果。
63.图13为balb/c nude mice.体内安全性评估血常规结果。(a)血常规指标wbc,rbc,hgb,mcv,mchc,plt,hct；(b)血生化指标。alt,ast,tp,glb,tbil,urea,crea,alb；组1:对照组,组2:mno2,组3:caco3@cu,组4:cm。
64.图14为不同治疗处理balb/c nude mice.后he染色检测主要器官心、肝、脾、肺和肾组织结构变化表征体内毒性。
65.图15为cm nps注射c57bl/6j小鼠后小鼠体重检测。
66.图16为cm nps注射c57bl/6j小鼠后血常规和血生化检测，(a)血常规指标wbc,rbc,hgb,mcv,mchc,plt,hct；(b)血生化指标。alt,ast,tp,glb,tbil,urea,crea,alb；组1:对照组,组2:mno2,组3:caco3@cu,组4:cm，组5为αpd1和组6:cm+αpd1。
67.图17为不同治疗处理c57bl/6j后he染色检测主要器官心、肝、脾、肺和肾组织结构变化表征体内毒性。
68.图18为cm nps对c57bl/6j小鼠免疫激活效果检测，a为cm nps注射小鼠后肿瘤大小，b为cm nps注射小鼠后肿瘤体积，c为cm nps注射小鼠后肿瘤重量，d为肿瘤进行切片检测ros含量和he染色检测细胞死亡情况,e为cm nps的抗肿瘤免疫反应组织切片染色。
69.图19为cm nps合成及抗肿瘤示意图。。
具体实施方式
70.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
71.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
72.下述实施例中部分方法如下：
73.下述实施例中的细胞培养：293t,hela和raw 264.7细胞培养基均为dmem+10％ fbs+1％青链霉素，培养于37℃，5％ co2细胞培养箱中。
74.下述实施例中的pbs为浓度为0.01m、ph值为7.4，购自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品目录号g4202。
75.下述实施例中的tunel分析：tunel检测采用tunel检测试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司，gdp1042)进行检测，凋亡细胞核标记为红色，荧光显微镜成像。
76.下述实施例中的数据分析：本研究中所有数据为平均价
±
sem。通过gpaphpad prime 8.0单因素方差分析和hsd差异分析检测分析差异的显着性，显著性差异表示为：*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001and****p《0.0001.
77.实施例1、双离子过载的纳米颗粒cm nps的制备
78.一、cm nps的制备
79.cm nps的合成路径示意图详见图19所示，其中，tmah：四甲基氢氧化铵；cu:姜黄色素；icd：免疫原性细胞死亡；cdn：环状二核苷酸；apc：抗原呈递细胞；fl：荧光成像。图中的i、ii和iii分别为如下：
80.i)ph值增加提高树突细胞的存活率；
81.ii)钙离子累积，ph值增加，乏氧减少促进巨噬细胞极化生存m1就是细胞；
82.iii)(i)和(ii)协同增强抗原呈递过程。
83.1、二氧化锰纳米片(mno
2 nss)合成方法
84.二氧化锰纳米片可以商购，也可以按照如下方法合成：参照前期的文献[q.ouyang,l.wang,w.ahmad,y.rong,h.li,y.hu,q.chen,food chemistry 2021,349,129157]，具体为：18ml 0.5mm的四甲基氢氧化铵溶液加入至10ml 0.2mm mncl2水溶液中，混合均匀，然后，快速滴加2ml过氧化氢至上述混合液中直至溶液变为棕色。棕色溶液继续室温旋转24h，13000rpm离心10min收集沉淀，再用无水乙醇和ddh2o分别依次洗涤三次，13000rpm离心10min收集沉淀获得的二氧化锰纳米片(mno
2 nss，粒径为191.33nm)；
[0085]
将3mg二氧化锰纳米片悬浮于10ml ddh2o，得到二氧化锰纳米片悬浮液(记作mno2nss溶液，浓度为3mg/ml)，放置于4℃备用。
[0086]
2、制备caco
3-cu@mno2[0087]
caco
3-cu@mno2：先向10ml上述1制备的含有3mg二氧化锰纳米片(mno
2 nss)的二氧化锰纳米片悬浮液中加入3mg cacl2和1mg姜黄色素(curcuminoid，简称为cu)(cacl2,cu和mno
2 nss的质量比3:1:3),室温搅拌6h，再加入500μg/ml过量(大于等于6ml，此次加入的是6ml)的na2co3水溶液，快速搅拌过夜。16437g离心10min收集沉淀获得caco
3-cu@mno2；
[0088]
ddh2o洗涤3次后，caco
3-cu@mno2重悬于ddh2o中，得到caco
3-cu@mno2溶液(浓度为2mg/ml)。
[0089]
cu@caco3纳米材料：按照caco
3-cu@mno2的制备方法，不同的是将10ml上述2制备的含有3mg二氧化锰纳米片(mno
2 nss)的二氧化锰纳米片悬浮液替换为10ml水；得到cu@caco3纳米材料。将cu@caco3纳米材料溶于水，得到3mg/ml的cu@caco3溶液。
[0090]
3、制备cm nps
[0091]
将长满的1*107b16f10细胞(上海富衡生物科技有限公司,fh0361)用pbs洗涤，加入含有2mm edta的pbs，收集细胞，pbs洗涤三次，重悬于10ml细胞裂解液中(10mm tris-hcl(ph 7.5),10mm kcl,2mm mgcl2和protease inhibitor(碧云天，蛋白酶抑制剂混合物(通用型,100x)，货号：p1005)，余量为水)，加入dounce匀浆器中进行匀浆，匀浆后的溶液在4℃，3500g离心5min，收集上清，继续20 000g离心15min，继续收集上清，100 000g离心30min，收集沉淀，10mm tris-hcl buffer重悬洗涤一次，重悬于pbs溶液中，得到b16f10细胞膜的溶液，保存于-80℃备用。b16f10细胞膜的溶液中细胞膜含量采用bca试剂盒测定的蛋白质含量体现，浓度为2mg/ml。
[0092]
后续实验时b16f10细胞膜的溶液100 000g离心30min，收集沉淀，重悬于水中得到b16f10细胞膜悬浮液进行实验。
[0093]
制备cm nps：将100μl上述制备的浓度为2mg/ml的b16f10细胞膜悬浮液与2.5ml浓度为2mg/ml的caco
3-cu@mno2溶液混合均匀(细胞膜(蛋白质体现)和caco
3-cu@mno2的质量比为200μg：5mg)，再通过450nm聚碳酸酯膜(millipore,ys-tb-gttp09030)物理挤出，重复30次，收集挤出的溶液，然后14005g离心15min，收集沉淀，得到cm nps，即为细胞膜包覆纳米材料，命名为cm nps。将cm nps悬浮于水后得到cm nps悬浮液，浓度为2mg/ml。
[0094]
上述制备得到的cm nps中，各物质的配比为细胞膜：姜黄色素：碳酸钙：二氧化锰为200μg：0.38mg：3mg：3mg。
[0095]
制备b@mno2：100μl上述制备的浓度为2mg/ml的b16f10细胞膜悬浮液与2.5μl体积浓度为2mg/ml的mno
2 nss溶液混合均匀(细胞膜和二氧化锰纳米片的质量比为200μg：5mg)，通过450nm聚碳酸酯膜物理挤出，重复30次，收集挤出的溶液，然后14005g离心15min，收集沉淀，得到b@mno2。
[0096]
制备b@caco
3-cu：将100μl上述制备的浓度为2mg/ml的b16f10细胞膜悬浮液与2.5μl体积浓度为2mg/ml的cu@caco3溶液混合均匀(细胞膜和cu@caco3的质量比为200μg：5mg)，通过450nm聚碳酸酯膜物理挤出，重复30次，收集挤出的溶液，然后14005g离心15min，收集沉淀，得到b@mno2。
[0097]
二、cm nps的检测
[0098]
1、tem成像
[0099]
将上述一制备的mno
2 nss、caco3@cu和cm nps进行tem成像(jem-3200fs transmission electron microscope)。
[0100]
结果如图1a所示，tem成像显示获得的mno
2 nss(图1a，左边),caco3@cu(图1a，中间)和cm nps(图1a,右边)均具有均一的结构。
[0101]
2、eds分析
[0102]
将mno
2 nss和cm nps进行eds分析(d8 advance(bruker,germany,voltage≤40kv,10
°
≤2theta≤80
°
))。
[0103]
eds分析显示二氧化锰纳米片仅具有锰和氧元素(图4a为从左至右分别为白光图,mn元素图，o元素图以及merge图片，图4b为元素含量统计图)。
[0104]
eds分析显示cm nps的表面存在mn,c,o,ca,n和s元素信号(图5a依次为白光图，mn,c,s，n,o,ca，n,图5b为元素含量统计图)。
[0105]
3、sds分析
[0106]
sds分析：将上述一的3中制备的b16f10细胞膜悬浮液，上述一的1制备的mno2nss和上述一的2制备的caco
3-cu@mno2以及上述一的3制备的cm nps利用bca试剂盒定量后重悬于1x sds上样缓冲液中，100℃沸腾10min，10％ sds-page进行蛋白电泳分离(120v，1.5h)，考马斯亮蓝染色2h，ddh2o洗涤并成像。
[0107]
结果如图1b所示，1和6为marker，2为b16f10细胞膜、3为mno
2 nss、4为caco
3-cu@mno2、5为cm nps，可以看出，泳道2和泳道5有相同蛋白，表明b16f10细胞膜成功包裹至caco3-cu@mno2表面，成功制备cm nps。
[0108]
4、dls分析
[0109]
将mno
2 nss(图中记作mno2)、caco
3-cu@mno2和cm nps(图中记作cm)进行dls分析(malven,zetasizer)
[0110]
dls分析结果显示mno2,caco3-cu@mno2和cm nps的粒径大小分别为191.33nm,345.66nm,and 392.70nm(图1c)，zeta电位分别为+0.38mv,-4.46mv和-17.43mv(图1d)。说明cm nps具有良好的分散性。
[0111]
5、uv-vis-nir光谱检测
[0112]
将mno
2 nss(图中记作mno2)、caco
3-cu@mno2和cm nps(图中记作cm)进行uv-vis-nir光谱(spark 10m)检测。
[0113]
uv-vis-nir光谱结果显示，制备得到的纳米材料除了cu在434nm出有一个明显的特征峰外，其他材料均没有明显的特征峰(图1e)。
[0114]
依据434nm处的特征吸收峰，cu在cm中的负载率为38.91％，远比caco3@cu中的负载率高(7.08％)。
[0115]
上述结果证明了成功制备得到cm nps。
[0116]
7、不同ph值pbs溶液中cm nps降解
[0117]
将上述一制备的cm nps按照100μg/ml均匀分散于pbs溶液中(ph7.4和5.4)，室温静置八天，观察静置第0天和静置8天后的溶液颜色。
[0118]
结果如图1f所示，可以看出，静置8天后变透明，表明cm nps降解。
[0119]
在上述放置8天内，uv-vis-nir光谱检测吸光度变化表征材料稳定性。吸光值计算
降解率。
[0120]
uv-vis-nir光谱显示cm nps能在pbs中降解(图1g)。
[0121]
8、钙离子和锰离子释放速率检测
[0122]
将上述一制备的cm nps按照100μg/ml均匀分散于pbs溶液中(ph7.4和5.4)，在预设时间点，溶液13000rpm离心15min，收集上清液，通过icp-oes检测钙和锰含量。
[0123]
上述icp-oes为将纳米材料经浓硝酸消解后，加热蒸发硝酸，ddh2o溶解后，用inductively coupled plasma mass spectrometer(jy2000-2，horiba jobinyvon,usa)仪器检测。
[0124]
结果如图1h所示，可以看出，通过icp-oes检测降解上清中的元素浓度进一步证实其降解速率，钙离子和锰离子在ph5.4和ph7.4的溶液中的降解率分别为91.20％,65.88％,33.67％和32.95％。
[0125]
这些结果证明了成功制备得到cm nps且其具有低ph响应和分解的特点。
[0126]
实施例2、cm nps在体外重塑肿瘤微环境中的应用
[0127]
肿瘤微环境已被证实是免疫抑制小微环境，具有低ph值、乏氧以及高过氧化氢含量等。
[0128]
在体外检测cm nps重塑肿瘤微环境的能力，具体如下：
[0129]
1、cm nps体外具有良好的酸弱化能力
[0130]
上述实施例1的一制备的cm nps按照20μg/ml分散于ph 5.4,6.5和7.4的pbs溶液中，室温搅拌，在预设时间点(0,0.5,1,2,6,12,24和48h)利用ph检测溶液ph值。
[0131]
结果如图2a所示，cm nps能够显著通过以下反应过程提升溶液ph值：(i)nps能够显著通过以下反应过程提升溶液ph值：(i)(ii)and(iii)48h后，溶液的ph值分别上升至6.49,6.88和7.57，意味着cm nps在体外具有良好的酸弱化能力，酸弱化过程有助于cu释放。
[0132]
2、cm nps过氧化氢分解能力
[0133]
将实施例1的一制备的cm nps(图中记作cm)或者实施例1的一制备的mno
2 nss(50μm mn，图中记作mno2)重悬于含有100μm h2o2的pbs溶液中,在预设时间点，通过过氧化氢分析试剂盒(碧云天，s0038)检测溶液中剩余的h2o2含量。在细胞中，按照过氧化氢分析试剂盒检测说明书检测h2o2含量。
[0134]
结果如图2b和2c所示，成像显示加入cm nps形成明显的气泡，说明发生过氧化氢分解生成氧气(图2b)，定量分析结果显示二氧化锰和cm nps均能快速分解过氧化氢(图2c)，在细胞内，过氧化氢分解能够降低细胞的乏氧程度。
[0135]
3、ros生成
[0136]
在过氧化氢存在条件下，二氧化锰通过mno2+2h
+
＝mn
2+
2h2o+
1/2
o2诱导产生ros。在肿瘤细胞中，乏氧阻碍肿瘤治疗效果。因此，在此检测cm nps在过氧化氢溶液中诱导ros生成情况。
[0137]
将5μm ros探针dcfh-da(碧云天，s0033m)与50μm h2o2混合，加入cm nps使其浓度为20μg/ml，荧光分光光度计检测荧光强度变化。
[0138]
结果在60min内，随着之间延长，荧光强度逐渐增加，之后，荧光强度逐步降低(图2d，从上到下依次为30min、60min、10min、120min、240min)，荧光强度上升是由于ros生成增
加，荧光强度降低是由于时间延长使溶液中的过氧化氢含量被催化分解。
[0139]
这些结果证实了cm nps能够重塑肿瘤微环境，诱导细胞内氧化压力增加，实现化疗动力治疗，并且有利于肿瘤免疫治疗。
[0140]
实施例3、cm nps的体外细胞摄取与治疗效果检测
[0141]
为探究cm nps治疗效果，检测ce6标记cm nps被细胞摄取情况。
[0142]
1、ce6标记的cm nps的制备
[0143]
按照实施例1中的一的cm nps制备方法制备，唯一不同的是在步骤2的caco
3-cu@mno2制备中向10ml上述1制备的含有3mg二氧化锰纳米片(mno
2 nss)的二氧化锰纳米片悬浮液中加入3mg cacl2、1mg姜黄色素和1mg ce6(curcuminoid，简称为cu)(cacl2,cu、mno
2 nss和ce6的质量比3:1:3：1)，其余均相同，得到ce6标记的cm nps。
[0144]
上述制备得到的ce6标记的cm nps中，各物质的配比为细胞膜：姜黄色素：碳酸钙：二氧化锰：ce6为200μg：0.38mg：3mg；3mg；
[0145]
采用荧光分光光度计检测实施例1制备b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu)、b@mno2(图中记作mno2)、cu、ce6和ce6标记的cm nps(图中记作cm-ce6)。
[0146]
结果如图3a所示，ce6能够被成功负载至cm nps中，并具有较高的负载率(15.71％)。
[0147]
2、细胞摄取检测
[0148]
将1
×
105b16f10细胞接种于35mm激光共聚焦小皿中培养过夜，去除培养基，加入2mg/ml的cm nps悬浮液(cm nps在体系中的终浓度为50μg/ml)继续培养不同时间，去除培养基，pbs洗涤，荧光显微镜成像，同时收集细胞，测量细胞荧光强度表征细胞摄取情况。
[0149]
结果如图3b和3c所示，可以看出，cm nps能够被b16f10细胞快速摄取。
[0150]
同时，采用上述方法将b16f10和raw264.7细胞分别与50μg/ml cm nps孵育不同时间后，摄取的钙和锰含量通过icp-oes进行检测。
[0151]
分析结果显示cm nps能够被两种细胞摄取，检测显示b16f10和raw264.7细胞内的钙和锰含量分别为37.38，41.29，8.90，11.68μm/5x 105cells(图3d，3e)，且随着时间延长，细胞摄取含量增加。
[0152]
3、血液相容性检测
[0153]
由于生物相容性和安全性是纳米材料应该不可避免的问题，紧接着检测cm nps的生物相容性和安全性。基于肿瘤细胞膜能够避免机体清除和提高肿瘤靶向性。
[0154]
血液相容性检测利用溶血比例进行检测：通过c57bl/6j小鼠眼球取血收集1ml c57bl/6j血液，利用pbs稀释至5ml，2000rpm离心10min，重复6次分离红细胞。在含有红细胞的pbs溶液中加入不同浓度(5,10,20,50和100μg/ml)的cm nps(图中记作cm)，37℃摇床保持3h，10 000rpm离心10min收集上清，利用酶标仪测量570nm处吸光值。将红细胞分散于ddh2o作为阳性对照。
[0155]
结果如图3f所示，尽管cm nps浓度增加，上清中并没有明显的红色出现，说明cm nps并不能导致明显的溶血现象。
[0156]
4、安全性检测
[0157]
细胞毒性分析：293t(中国科学院细胞库gnhu17),hela(中国科学院细胞库tchu187)和raw 264.7(中国科学院细胞库tcm13)细胞按照2х104cells/well接种于96孔
板中培养过夜，细胞汇合度达到60-65％时，替换加入200μl含有不同浓度(0,5,10,20,50和100μg/ml)的cm nps(图中记作cm)的新鲜培养基继续培养24h，每组六个重复，去除培养基，加入cck-8检测试剂(10μl cck-8+90μl无血清的dmem培养基)，37℃培养箱中静置1h，酶标仪测量450nm吸光值，计算细胞活率表征材料毒性。
[0158]
结果如图3g所示，可以看出，cm nps不影响细胞的生长。
[0159]
5、cm nps的体外细胞治疗效果
[0160]
体外的肿瘤治疗通过cck-8，calcein am/pi荧光染色和annexin v-fitc/pi染色流式细胞术检测，具体如下：
[0161]
将不用的细胞293t、hela和b16f10细胞种植于6孔板中，替换加入200μl含有不同浓度(0,5,10,20,50和100μg/ml)的cm nps(图中记作cm)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu)和b@mno2(图中记作mno2)的新鲜培养基继续培养24h，通过cck-8检测细胞活率，calcein-am/pi荧光染色检测抗肿瘤效果。
[0162]
结果如图3g-3h所示(3g为293细胞，3h为hela细胞，3i为raw264.7细胞)，可以看出，与b@caco
3-cu和b@mno2相比，cm nps与不同细胞孵育24h后，在较高浓度条件下，正常细胞(293t)检测结果显示呈现轻微的活率抑制，然而，在hela和b16f10细胞中，cm nps呈现出明显的抑制效果。例如，在浓度为50μg/ml时，约有50％的细胞死亡，证实了钙离子和锰离子过载能够有效诱导肿瘤抑制。
[0163]
同样的，calcein am/pi荧光染色(图3j)和annexin v-fitc/pi染色流式细胞术(图3k)检测结果同样显示cm nps与b@caco
3-cu和b@mno2相比，具有良好的治疗效果。
[0164]
综上所述，cm nps能够有效杀灭肿瘤细胞，并具有良好的生物相容性。
[0165]
实施例4、细胞内肿瘤微环境重塑检测
[0166]
受到细胞内碳酸钙告知的质子中性化和二氧化锰纳米酶特性，在细胞水平检测其重塑肿瘤微环境的能力，包括细胞内酸度、乏氧、钙离子含量、ros含量、过氧化氢和gsh含量。
[0167]
1、细胞内ph检测
[0168]
细胞内的ph值变化通过bcecf am作为指示探针进行检测，具体如下：
[0169]1×
104b16f10细胞接种于48孔板中，培养过夜，加入不同的纳米材料cm nps(图中记作cm)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu)和b@mno2(图中记作mno2)，孵育6h，加入1μm ph探针bcecf-am(碧云天，s1006)，细胞培养箱继续培养15min，pbs洗涤3次，荧光显微镜成像和荧光分光光度计检测荧光强度。
[0170]
结果如图6所示，与b@caco
3-cu和b@mno2相比，当cm nps与b1f10细胞共孵育12h后，细胞内的荧光强度显著增加,说明caco3@cu和cm nps能够有效导致细胞内的酸度减弱。
[0171]
2、乏氧程度
[0172]
细胞内的ph变化能够导致细胞内离子流动速度变化和含量变化，进而导致细胞膜的伸缩性，也会导致细胞器结构和功能变化以及细胞器之间的通讯以及细胞内的自由基含量和细胞存活。
[0173]
处于乏氧条件下的b16f10细胞在200μl含有不同浓度(0,5,10,20,50和100μg/ml)的cm nps(图中记作cm)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu)和b@mno2(图中记作mno2)以及乏氧探针的培养基(培养基中加入100um的氯化钴模拟乏氧环境)中培养1,2,6h时间。
[0174]
乏氧程度利用乏氧探针image-it green hypoxia reagent作为指示剂。
[0175]
检测结果如图7所示，normoxia为添加cocl2，control对照是指没有加cocl2正常氧含量，可以看出，与b@caco
3-cu相比，b@mno2和cm nps处理后肿瘤细胞内的乏氧程度得到显著减弱。
[0176]
这些结果说明二氧化锰和cm nps能够有效调节肿瘤细胞内的乏氧程度，而caco3@cu对细胞内的乏氧程度无明显影响。
[0177]
3、细胞内的钙离子含量
[0178]
线粒体和内质网是细胞内的钙库和ros生成部位，对细胞内的生物学过程的信号分子和氧化还原状态有着至关重要的作用，而钙离子对线粒体和内质网的结构和功能也具有至关重要的作用。因此，紧接着利用钙离子探针(fluo-4 am，碧云天，s1060)检测不同处理后细胞内的钙离子含量，钙离子含量定量利用calcium colorimetric assay kit(碧云天，s1063s)获得。
[0179]
5*104个量b16f12细胞接种于12孔板中，继续培养18-20h，加入50μg/ml浓度cm nps(图中记作cm)孵育12h，加入3μm fluo-4 am，激光共聚焦成像和荧光分光光度计检测探针荧光强度。收集细胞，按照calcium colorimetric assay kit说明书检测细胞内钙离子含量。
[0180]
结果如图8a(内质网)和8b(线粒体)所示，cm nps导致细胞内钙离子含量显著升高，破坏细胞内的钙离子稳态。
[0181]
定量结果显示cm nps处理的细胞和培养基中钙离子含量显著增加(图8c)。
[0182]
4、ros检测
[0183]
肿瘤细胞建立一个适合其增殖和转移的肿瘤微环境，伴随着异常的细胞代谢，例如，肿瘤细胞中的过氧化氢产生速率增加，进而导致ros产生增加。
[0184]
检测细胞内的过氧化氢和ros含量变化通过过氧化氢试剂盒(碧云天，s0038)和ros探针(碧云天，s0033m)，具体如下：
[0185]
将不同纳米材料cm nps(图中记作cm)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu)和b@mno2按照50μg/ml加入b16f10细胞培养基中，在培养基中孵育b16f10细胞12h，去除培养基，加入含有5μm dcfh-da的新鲜培养基，细胞培养箱培养30min，激光共聚焦成像检测ros。
[0186]
检测结果显示二氧化锰和cm nps能够显著诱导细胞内的过氧化氢分解(图8e)，以及ros含量显著增加(图8d)，ros含量增加导致细胞内的氧化压力增加导致细胞死亡，尤其是ros容易导致线粒体结构破坏而释放损伤的dna或者环状二核苷酸(cdn)以及其他受损的细胞组份，并释放至细胞质基质内诱导级联的免疫原性细胞死亡。
[0187]
5、蛋白免疫印迹
[0188]
将不同纳米材料cm nps(图中记作cm)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu)和b@mno2按照50μg/ml加入b16f10细胞培养基中，在培养基中孵育b16f10细胞12h，收集细胞。
[0189]
利用1x sds上样缓冲液提取细胞总蛋白，并点样与8-15％浓度的sds-page胶中，转印纸pvdf膜中，利用封闭液进行封闭(beyotime biotechnology,cat.no.p0023b)，室温保持1h，加入特异性一抗，β-actin用作上样内参，将膜利用pbst洗涤3次，5min/次，加入二抗anti-rabbit igg,hrp-linked second antibody secondary antibodies(cat.no.7074；cst)，室温孵育2h，将膜利用pbst洗涤3次，5min/次，加入化学发光液后进行
成像检测。
[0190]
通过western blotting检测免疫原性细胞死亡的markers，包括hmgb1、cgas、sting和crt。
[0191]
结果如图8f所示，b16f10细胞经过不同纳米材料处理后，hmgb1、cgas、sting和crt显著上升，说明诱导免疫原性细胞死亡发生，激活cgas-sting信号通路，进而出发免疫反应，导致树突细胞增殖和成熟和t细胞激活。
[0192]
6、atp含量检测
[0193]
紧接着检测免疫原性细胞死亡的其他指标，释放的atp。
[0194]
将b16f10细胞按照5
×
104cells/well接种于24孔板中，培养16h，细胞汇合度达到80-85％，去除旧培养架，加入含有50μg/ml的不同纳米材料cm nps(图中记作cm)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu)和b@mno2孵育24h，分别收集细胞培养基和细胞，按照atp检测试剂盒(碧云天，s0026)说明书通过化学发光法检测atp含量。
[0195]
结果如图8g所示，cm nps能够显著诱导atp释放至细胞培养基中。
[0196]
同时，由于ifnγ在cgas-sting信号通路中的重要作用。通过elisa方法检测(biolegend,430807)上述孵育后b16f10细胞内ifnγ含量。
[0197]
结果显示，cm nps处理导致b16f10细胞内的ifnγ含量增加(图8h)。
[0198]
7、免疫系统激活检测
[0199]
免疫系统激活从抗原呈递细胞，包括巨噬细胞和树突细胞，识别与呈递抗原开始。因此，raw264.7细胞被选做用来探究免疫系统激活情况。
[0200]
b16f10细胞与高浓度cm nps(200μg/ml)共孵育完全杀灭肿瘤细胞，将死亡的细胞收集，与raw264.7细胞共孵育，死亡细胞内的组成成分，包括损伤的dna等，激活sting信号通路，并诱导ifnγ产生。具体如下：
[0201]
按照2
×
105cells/well密度将b16f10细胞接种于6孔板中，细胞汇合度达到70％时，加入不同纳米材料：cm nps(图中记作cm,10μg/ml)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu,10μg/ml)和b@mno2(图中记作mno2,10μg/ml)培养12h，收集细胞培养基检测ifnγ浓度。
[0202]
同时，这些细胞利用uv照射处理(1500j cm-2
)，杀灭肿瘤细胞，收集处理后的b16f10，加入至raw264.7细胞中，收集raw264.7细胞检测ifnγ浓度。
[0203]
检测结果如图8h和8i所示，显示纳米材料处理的细胞中ifnγ含量远高于对照组，尤其是cm nps组。
[0204]
在肿瘤细胞微环境中，巨噬细胞通常极化成为m1和m2型，并且这两种类型巨噬细胞具有相反的生物学功能。
[0205]
在raw264.7细胞培养基中加入25ng/ml的il-4或者脂多糖(1μg/ml诱导极化过程转变成为m2和m1巨噬细胞)，将raw264.7在此培养基中培养24h，得到m2和m1巨噬细胞，并继续加入cm nps(图中记作cm,10μg/ml)、b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu,10μg/ml)和b@mno2(图中记作mno2,10μg/ml)培养12h。
[0206]
极化的巨噬鉴定通过细胞膜表面的标志蛋白进行鉴定。
[0207]
免疫荧光染色方法鉴定结果如图9a所示，m2巨噬细胞与不同纳米材料共孵育12h，诱导其向m1转化，证实了钙和锰能够诱导巨噬细胞极化。
[0208]
同时，m1巨噬细胞伴随着大量的过氧化氢生成，结果如图9b所示，可以看出，m2巨
噬细胞同样被不同的纳米材料处理12h，在mno2,caco3@cu和cm nps组中过氧化氢含量显著上升。
[0209]
虽然单独的caco3@cu nps对过氧化氢产生没有显着影响，但与短期处理(1小时)相比，二氧化锰和cm nps在长期处理后对过氧化氢产生的影响更明显。活化的巨噬细胞产生过氧化氢可以在二氧化锰催化下释放氧气以减轻缺氧程度。此外，重塑tme与增加的ph值和低缺氧的结合以及钙和锰的生物学功能导致m1巨噬细胞的有效极化可以唤起免疫系统的激活。并且，钙离子积累可以增强树突细胞的活力并改善抗原呈递。树突细胞和巨噬细胞在抗原交叉呈递中的协同作用可以诱导免疫反应的激活，将效应t细胞募集到肿瘤部位杀死癌细胞。
[0210]
总之，这些结果表明cm nps可以诱发icd并激活免疫系统。
[0211]
实施例5、cm nps的体内靶向性检测
[0212]
纳米治疗药物在体内的生物分布和清除速率对其潜在的生物医学应用至关重要。因此，进一步评估cm nps是否可以靶向和累积于肿瘤部位。
[0213]
1、动物和肿瘤模型建立
[0214]
雌性balb/c和c57bl/6j小鼠均购买自集萃药康，所有小鼠均饲养于spf动物房，温度：22
±
1℃，湿度：40-50％，12-12h白天与黑夜循环，保持足够的饲料与饮用水。按照1x 105cells/mouse的b16f10小鼠接种于小鼠后腿背侧右侧建立肿瘤模型。肿瘤体积约为150mm3时将小鼠随机分为4组，每组6只小鼠。
[0215]
2、体内肿瘤靶向与分布检测
[0216]
当肿瘤提交大小约为150mm3时，小鼠尾静脉注射100μl ce6标记的caco
3-cu@mno2(方法参考ce6标记的cm nps，仅将姜黄素替换为ce6标记的姜黄素)和ce6标记的cm nps，注射剂量15mg/kg，在预设时间点(0和24h)，通过小动物活体成像系统检测纳米材料靶向性。
[0217]
小动物活体成像仪ivis spectrum体内荧光成像系统用于检测c57bl/6j小鼠模型在静脉注射ce6标记的纳米材料后的靶向和分布情况(caco
3-cu@mno2，(1)组和cm nps，(2)组，15mg/kg)。
[0218]
注射24h后，肿瘤部位显示出增强的ce6荧光信号(图10a)。注射cm nps小鼠的肿瘤部位的荧光强度显著高于注射caco
3-cu@mno2小鼠肿瘤部位的荧光强度，表明b16f10细胞膜包裹提升了nps的靶向能力(图10b)。
[0219]
24h成像后，将小鼠麻醉，分离肿瘤和主要器官，成像检测纳米材料在体内分布情况。同时，在0,12和24h，取肿瘤和主要器官，硝酸消解后，icp-oes检测锰元素含量表征材料体内分布与代谢情况。在预设的时间点，通过尾静脉取30μl全血，消解后通过icp-oes检测锰元素含量表征体内代谢情况。
[0220]
将小鼠麻醉处死，进行器官离体荧光成像以检查主要器官体内分布。肿瘤组织中的荧光强度最高，也明显高于肝组织的荧光强度(图10c和10d)。且注射cm nps的小鼠的肿瘤组织的荧光强度也远高于注射caco
3-cu@mno2小鼠肿瘤组织的荧光强度。
[0221]
2、免疫荧光染色
[0222]
将上述麻醉后的肿瘤组织染色：
[0223]
细胞或组织切片利用4％多聚甲醛室温固定15min，0.1％ triton x-100pbs通透10min，加入5％bsa溶液，室温封闭1h，加入特异性一抗，4℃孵育过夜，pbs洗涤3次，加入荧
光标记二抗，室温孵育2h，激光共聚焦成像。
[0224]
免疫荧光染色证实了cm nps的靶向能力提高。
[0225]
3、mn
2+
浓度
[0226]
再用icp-oes分析注射nps的小鼠血液中循环过程以及血液中的mn
2+
浓度。
[0227]
caco
3-cu@mno2和cm nps在c57bl/6j小鼠中的循环和消除半衰期分别为1.09和15.22h,1.63和16.19h(图10e)。其半衰期检测结果显示，肿瘤细胞膜包被的nps可以降低身体的清除率。
[0228]
通过使用icp-oes测量主要器官和肿瘤中mn
2+
浓度表征cm nps体内生物分布(1,12和24h)。
[0229]
研究结果表明，cm nps可以在肿瘤部位逐渐积累(图10f)，可能的原因在于癌细胞膜和epr效应提供的靶向能力，而脾脏和肝脏中的累积是由于网状内皮系统捕获纳米材料的结果。
[0230]
因此，这些结果表明cm nps具有良好的肿瘤靶向能力和药代动力学特征，具有更长的血液循环和高肿瘤积累效率。
[0231]
实施例6、cm nps在体内抗肿瘤效果检测
[0232]
cm nps能够有效重塑肿瘤内环境，钙离子过载具有良好的治疗效果，并且锰离子能够逆转免疫抑制，并且cm nps具有良好的肿瘤靶向能力和大量累积于肿瘤组织。
[0233]
1、在体内检测cm nps抗肿瘤效果。
[0234]
将b16f10移植于balb/c裸鼠(balb/c nude mice.)右后肢背侧皮下，当肿瘤体积大小为180mm3，将小鼠随机分为如下四组：(1)control；(2)b@mno2(图中记作mno2)；(3)b@caco3@cu(图中记作cu)；和(4)cm nps(图中记作cm)，每组6只小鼠.在第0,3和7天分别：(1)组注射pbs,(2)-(4)组分别注射b@caco
3-cu(15mg/kg)，b@mno2(15mg/kg)以及cm nps。
[0235]
纳米材料抗肿瘤的持续治疗效果通过每两天测量肿瘤大小、体重和生成变化。
[0236]
每两天测量一次小鼠体积与体重，统计小鼠生存情况，肿瘤体积计算公式：0.5*length*width2,14天后，将小鼠麻醉，分离肿瘤组织，称重。肿瘤抑制率计算公式：tgi＝(v
c-v
t
)/vc×
100％，v
t
为治疗终端肿瘤体积大小，vc为治疗开始时肿瘤体积大小。
[0237]
治疗终端时，收集全血和血清以及主要器官，通过血常规、血生化以及he染色检测生物安全性。
[0238]
结果显示mno2和caco3@cu具有一定程度的肿瘤抑制作用(图11a,b),cm nps显示强有力的抗肿瘤效果，(1)-(4)组的抑瘤率分别为-655.40％,-469.79％,-385.09％和+6.15％。当实验终点时，将小鼠麻醉处死，分离肿瘤组织进行称重，图11a和11c所示，cm nps显著抑制肿瘤生长。
[0239]
与前期的研究相比，本实验未能有更强的肿瘤抑制效果可能的原因是注射的纳米材料剂量太小。
[0240]
将分离得到的肿瘤进行切片检测ros含量(方法同前)和细胞死亡情况。如图11d所示，在(2)-(4)组中，相比于对照组，能够观察到明显的ros生成和细胞凋亡情况。he染色(图11e)结果显示(4)组中的细胞松散分布，细胞核碎片增多，说明cm nps诱导肿瘤细胞死亡，并明显多余(2)和(3)组。类似的，ihc结果显示，相比于对照组，(2)-(4)诱导更强的肿瘤抑制。例如，ki67表达减少，caspase-3表达增加。以上的结果说明cm nps具有良好的抗肿瘤效
果。
[0241]
体内的生物安全性是纳米治疗体系考察的重要方面。
[0242]
在整个治疗过程中，在(1)-(4)组的小鼠体重并未有明显的变化(图12(a)小鼠体重变化统计结果；(b)小鼠生存率统计结果)，仅在对照组中有一只小鼠自然死亡，说明mno2、caco3@cu和cm并未导致明显的毒性。同样的，通过血常规(图13a)、血生化(图13b)以及器官he染色(图14)进一步证书mno2、caco3@cu和cm并未导致明显的毒性。
[0243]
因此，制备得到的ph响应的cm nps使肿瘤细胞内钙离子过载和锰离子的产生重塑tme，抑制肿瘤进展。此外，cm nps具有良好的生物安全性。
[0244]
2、cm nps免疫激活效果
[0245]
在前面已证实cm nps具有良好的抗肿瘤效果以及能够诱导免疫原性细胞死亡，免疫原性细胞死亡能够诱导免疫系统从“冷”向“热”转变，从而实现抗肿瘤效果。因此，在c57bl/6j小鼠中探究其免疫治疗抗肿瘤效果。
[0246]
小鼠被随机分为(1)control(对照组)；(2)mno2；(3)caco3@cu；(4)cm，共4个组，每组6只小鼠.在第0,3和7天分别：(1)组注射pbs,(2)-(4)组分别注射b@mno2(图中记作mno2)(15mg/kg)，b@caco
3-cu(图中记作caco3@cu,15mg/kg)，以及cm nps(图中记作cm)。
[0247]
体内的生物安全性通过是纳米治疗体系考察的重要方面。
[0248]
在整个治疗过程中，在(1)-(4)组的小鼠体重并未有明显的变化(图15)。血常规(图16a)、血生化(图16b，组1:对照组,组2:mno2,组3:caco3@cu,组4:cm.组5为αpd1和组6:cm+αpd1)以及器官he染色(图17)进一步证书mno2、caco3@cu和cm具有良好的生物安全性。
[0249]
纳米材料抗肿瘤的持续治疗效果通过每两天测量肿瘤大小、体重和生成变化。结果显示mno2和caco3@cu具有一定程度的肿瘤抑制作用(图18a,b),cm nps显示强有力的抗肿瘤效果，(1)-(4)组的抑瘤率分别为-403.89％,-203.78％,-238.15％和+20.09％。当实验终点时，将小鼠麻醉处死，分离肿瘤组织进行称重，如图18a和18c所示，cm nps显著抑制肿瘤生长。将分离得到的肿瘤进行切片检测ros含量和细胞死亡情况。如图18d所示，在(2)-(4)组中，相比于对照组，能够观察到明显的ros生成和细胞凋亡情况。he染色结果显示(4)组中的细胞松散分布，细胞核碎片增多，说明cm nps诱导肿瘤细胞死亡，并明显多余(2)和(3)组。类似的，ihc结果显示(figure s16)，相比于对照组，(2)-(4)诱导更强的肿瘤抑制。例如，ki67表达减少，caspase-3表达增加。
[0250]
以上的结果说明cm nps具有良好的抗肿瘤效果。
[0251]
更详细地，检测cm nps的抗肿瘤免疫反应。分离肿瘤组织并进行切片，免疫荧光染色标记不同免疫细胞：m1 macrophages(cd11b
+
/f4/80
+
/cd80
+
),m2 macrophages(cd11b
+
/f4/80
+
/cd206
+
),tregs(cd3
+
/cd4
+
/foxp3
+
),mdscs(cd45
+
/cd11b
+
/gr-1
+
),total t cells(cd3
+
),cd4
+
t cells,and cytotoxic t cells(cd3
+
cd8
+
)。在此研究中，钙离子过载导致增强淋巴细胞脱粒、细胞因子产生和靶细胞裂解，以及锰离子使免疫系统激活和成熟。组织切片染色如图18e所示，cm nps导致肿瘤组织内的m1增加，免疫抑制的免疫细胞，包括m2巨噬细胞，treg和mdscs，均显著减少。同时，检测结果也显示成熟t细胞、效应t细胞和细胞毒性t细胞含量显著增加，并且，(4)组含量远高于(2)和(3)组。这些结果说明cm nps能够激活抗肿瘤免疫治疗。同时，同时也检测了免疫检查点(pd1)抑制剂的治疗响应性。12只小鼠被随机分为两组，(5)αpd1(bioxcell,be0089，100μg/mouse)和(6)cm+αpd1，αpd1通过腹腔注射
给药在第1,4和8天给药(αpd1在注射纳米材料后一天注射，注射剂量为100μg/mouse)。
[0252]
如图18a-c所示，αpd1能够抑制肿瘤的增长，但由于缺乏靶向特异性，其肿瘤抑制效果不佳。而cm+αpd1能够显著抑制肿瘤增长，说明cm nps能够提升αpd1抗肿瘤响应性。
[0253]
同样的，ros和tunel染色，以及he与ihc染色均证实cm nps能够提升αpd1抗肿瘤响应性。这些结果说明cm nps能够提升αpd1抗肿瘤响应性，实现协同治疗。