一种调控缺血性脑卒中代谢微环境的纳米药物及其制备方法

本发明属于药物制剂，具体涉及一种调控缺血性脑卒中代谢微环境的纳米药物及其制备方法。

背景技术：

1、据报道，脑部疾病近些年来发病率和死亡率一直居高不下，其治疗现状呈现两大主要特点：首先是脑部疾病的治愈率低、预后差。例如神经退行性疾病和脑卒中等疾病，都缺少有效的临床治疗药物。其次脑部疾病治疗手段有限，目前疗法仅对疾病的损伤进行补偿性调节。然而疾病机制复杂，单一的治疗策略很难对疾病整体进行调控。

2、资料记载了脑部行使正常生理功能依赖于复杂的脑内微环境，其以神经血管单位为基本单位，由周皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、神经细胞以及细胞外基质等多种细胞组成[3]。细胞之间相互影响共同构成了脑部微环境的主要成分。在脑部疾病发生时，脑内微环境改变，其具体表现为细胞激活或受损，而且内在的重要表现为能量和物质代谢的异常，最终导致微环境的紊乱。因此通过调控细胞代谢状态来纠正整体微环境是一种可行的策略。

3、近些年来，脑部代谢得到了业内越来越多的关注。虽然大脑仅占生命体约2％的重量，但其能耗却高达20％，对于维持脑细胞正常功能具有重要的意义。代谢过程中的关键分子包括氧气、葡萄糖和蛋白等。当脑部疾病发生时，代谢微环境的变化十分显著。以阿尔茨海默症(ad)的慢性代谢紊乱和缺血性脑卒中(is)的急性代谢损伤最为突出。在ad疾病早期微环境中神经炎症和氧化应激发生，后期出现淀粉样蛋白(aβ)沉积/tau过度磷酸化。在is早期呈现乏氧和缺血的特点，再灌注后发生氧化应激损伤，后期代谢水平难以恢复正常。最终都会导致神经元的死亡。可见在脑部疾病的发展的每个阶段中，代谢微环境的改变对于疾病的发生发展尤为重要。因此本技术的发明人认为逆转病灶代谢微环境的变化是潜在的脑部疾病治疗策略。

4、研究表明，缺血性脑卒中再灌注后，病灶血管处会产生微血栓沉积。而creka多肽能够特异性结合纤维蛋白，这一特性可以指导专业人员如何将纳米药物特异性地递送到病灶区。本发明基于脑部疾病代谢微环境该病理特征，针对急性代谢损伤性的is设计了一种靶向纳米药物，并提出了以代谢微环境调控为核心的脑部疾病治疗新策略。

技术实现思路

1、本发明目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种调控缺血性脑卒中代谢微环境的纳米药物及其制备方法。该纳米药物包含血红蛋白、调控代谢药物吡咯喹啉醌、合成的聚合物骨架以及其他药学可接受的辅料。进一步，可为以代谢微环境调控为核心的脑部疾病治疗提供新策略

2、本发明的纳米药物，尤其是装载血红蛋白及吡咯喹啉醌的纳米药物，通过修饰靶向缺血性脑卒中病灶受损血管处沉积的微血栓的短肽creka，该纳米药物可以结合病灶区的微血栓，进而从附近破坏的血脑屏障(bbb)进入脑实质发挥药效。在缺氧阶段该纳米药物能够响应乏氧特征快速释放氧气，在再灌注阶段能够响应高浓度的ros，载体在清除ros的同时又能够响应并结合过剩的氧气从而从源头阻断ros的生成。此外，释放的模型药物能够激活病灶细胞的糖代谢能力。最后从以上几个方面重塑is病灶微环境的代谢平衡。

3、本发明在光化学栓塞(pmcao)和线栓(tmcao)模型小鼠体内验证了该代谢调控策略能够显著改善模型小鼠的脑梗死面积，能为is治疗提供了新的思路。

4、本发明所述纳米药物的粒径约为80nm左右。

5、本发明中，所述包载物质为血红蛋白和化学药物吡咯喹啉醌。

6、本发明中，所述聚合物骨架为连接靶向多肽的peg、未修饰的peg和ros敏感键酮缩硫醛。

7、本发明中，所述靶向多肽为一段可以与微血栓中的纤维蛋白结合的多肽，序列为creka。

8、本发明提供了一种纳米粒表面聚合物层的合成方法，包括以下步骤：

9、(1)量取巯基丙酸和无水丙酮加入反应瓶中，将氯化钠烘干除去水分，使用恒压滴液漏斗向氯化钠中滴入浓硫酸并产生氯化氢气体。将产生的气体经浓硫酸除去水分后通入反应瓶中，室温搅拌6小时，使用尾气处理装置，将气体融入氢氧化钠溶液中进行中和，反应完成后将反应液放置于-20℃冷却结晶过夜，次日将反应液进行抽滤，使用冷的正己烷和水对结晶产物进行润洗，真空干燥得到羧基化的ros敏感键，在所述反应中，无水丙酮为巯基丙酸摩尔数的2倍，氯化钠约为500g，浓硫酸约为200ml；

10、(2)取步骤(1)中得到的羧基化ros敏感键，称取氢化铝锂，量取无水四氢呋喃(thf)，将氢化铝锂加入反应瓶中，缓慢低温滴加thf。将(1)中得到的产物溶于thf后滴加入反应液中，于70℃回流反应1h。反应结束后将反应瓶置于冰浴上，缓慢滴加15％氢氧化钠溶液进行淬灭，直至产物由灰变为白色，抽滤得到粗产物溶液，加入适量的400目硅胶粉并旋转蒸发干燥，将旋干的硅胶分装柱，以流动相石油醚和乙酸乙酯混合(1:1)进行过柱分离，得到还原后的羟基化ros敏感键，在所述反应中，氢化铝锂的质量是羧基化ros敏感键的2.5倍；

11、(3)称取步骤(2)中得到的羟基化ros敏感键，量取一定体积的甲基丙烯酰氯，向反应瓶中加入用thf稀释后的甲基丙烯酰氯溶液，用thf溶解一定量的羟基化ros敏感键和三乙胺(tea)，将其缓慢滴加入反应液中，室温搅拌反应1h，向反应液中加入适量的400目硅胶粉并旋转蒸发干燥。将旋干的硅胶分装柱，以流动相石油醚和乙酸乙酯混合(9:1)进行过柱分离，得到乙酰化的ros敏感键，在所述反应中，甲基丙烯酰氯是羟基化ros敏感键摩尔数的2.5倍，tea是羟基化ros敏感键摩尔数的2.8倍；

12、(4)称取巯基化的creka多肽、乙酰基和马来酰亚胺双功能团修饰的peg于反应瓶中，加入一定体积的pbs 7.4溶液，室温搅拌过夜，于纯水中透析24h后冻干得到靶头多肽修饰的peg分子，在所述反应中，creka多肽为peg分子摩尔数的1.5倍。

13、本发明提供了一种由多巴胺氧化法介导的一锅法制备纳米粒，包括以下步骤：

14、称取一定量的血红蛋白、多巴胺和吡咯喹啉醌，用tris 8.5溶解血红蛋白，用dmso溶解吡咯喹啉醌并充分混合，向溶液中加入用tris 8.5溶解的多巴胺，室温敞口温和搅拌3h，于纯水中透析24h后，经0.22um滤膜过滤得到纳米粒，在所述反应中，血红蛋白和多巴胺的质量比为5:6，血红蛋白和吡咯喹啉醌的摩尔数比为1:32。

15、本发明提供了一种在纳米粒表面由自由基聚合制备聚合物层的合成方法，看包括以下步骤：

16、(1)取一定量上述制备的纳米粒，向体系中加入乙酰化的ros敏感键、靶向多肽修饰的peg和未修饰的peg分子，于4℃搅拌，向体系中加入aps和temed引发剂启动自由基聚合，氩气保护反应2h，于纯水中透析24h得到最终纳米药物。

17、本发明的优点与效果：

18、1、纳米制剂制备步骤简单，稳定性高，载药量高有利于临床转化和批量生产。

19、2、该纳米药物能够在同一体系的情况下针对缺血性脑卒中疾病的不同阶段进行治疗。

20、3、该纳米药物能够靶向缺血性脑卒中特异性的病灶区，减少非靶部位的系统毒性，具有良好的生物相容性和安全性。