一种具有结肠靶向传输功能的虾青素Pickering乳液及其制备方法和应用

一种具有结肠靶向传输功能的虾青素pickering乳液及其制备方法和应用


背景技术：

1.虾青素是一种天然类胡萝卜素，存在于虾、蟹和鲑鱼等水生动物中，具有卓越的抗氧化能力，被广泛用于化妆品、保健品和制药行业。此外，有报道称虾青素可以预防或治疗某些疾病，包括白内障、炎症和心血管疾病等。虽然虾青素具有较多功能特性，但由于其易降解、水溶性差和生物利用度低等性质，导致在应用上受到较大限制。
2.为了改善虾青素的应用，有关虾青素的封装技术受到越来越多的关注。许多递送系统(如乳液、纳米颗粒、纳米凝胶等)已被应用以提高其水溶性和稳定性，并且具有结肠靶向传输特性递送系统可以较好提升虾青素的生物利用度。乳液是目前应用较广的传输体系，而 pickering乳液是由固体纳米颗粒代替传统乳化剂而稳定的新型乳液。与传统乳液相比，pickering乳液具有生产成本低、储存稳定性好以及独特且可控的流变性质等优势。特别是以多糖和蛋白质等天然来源的胶体纳米粒子稳定的pickering乳液表现出更好的安全性和环保性，拥有较大的可持续发展潜力。
3.脱乙酰基-氧化甲壳素纳米纤维(de-to-chnf)和羧甲基魔芋葡甘聚糖(cmkgm)都是天然多糖的衍生物，具有独特的特性。de-to-chnf 带有氨基和羧基基团，在酸性和碱性条件下分别正电荷和负电荷，具有ph可调控性。而cmkgm带有负电荷，具有较好的水溶性和溶胀率。且cmkgm不能被胃肠道的消化酶水解，但可以被结肠细菌的酶降解，是一种有前景的结肠靶向负载剂。两者在生物活性物质的封装运输中，都具有较大的应用潜力。
4.目前有很多研究报道了虾青素乳液的制备方法，但是仍然存在一些不足。中国发明专利201410665629.8公开了一种高稳定性虾青素酯自微乳剂及其制备方法。但其在制备过程中会应用到乙酸乙酯、吐温、乙醇等试剂，这不利于产品的健康、绿色发展，难以被消费者认可。专利201610375390.x也同样存在这样的问题，且该方法制备的虾青素乳液中虾青素含量较低，输送效率不明确。因此，开发一种健康、绿色、输送效果好的虾青素乳液对于拓宽虾青素的应用具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种健康、绿色、具有结肠靶向传输功能的虾青素pickering乳液及其制备方法和应用。本发明以de-to-chnf和 cmkgm为原料，通过nhs/edc诱导复合体系内分子间形成稳固的共价键与非共价键交联，形成稳定的纳米凝胶。然后以纳米凝胶为乳化剂，富含虾青素的亚麻籽油为油相，制备虾青素pickering乳液，极大地提高了虾青素的生物利用度，并有效的拓展了虾青素在食品、医药等领域的应用范围。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种具有结肠靶向传输功能的虾青素pickering乳液及其制备方法和应用，包括以下步骤：
8.s1 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶的制备：
9.首先向cmkgm溶液中添加nhs和edc以激活羧基，再在磁力搅拌下将等体积的cmkgm
溶液滴加到de-to-chnf悬浮液中形成纳米凝胶。然后以10,000rpm/min速度离心30min收集de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶，并用乙醇和蒸馏水反复洗涤获得的纳米凝胶。最后将收集的 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶冷冻干燥。
10.s2虾青素油相的制备：
11.称取虾青素粉末分散在亚麻籽油中，经过加热超声处理，得到浓度为 12mg/ml的虾青素油相。
12.s3虾青素pickering乳液的制备：
13.将s1中的纳米凝胶以不同浓度分散在水中，调节ph，再分别与虾青素油相混合，然后均质，制得虾青素pickering乳液。
14.进一步的，所述步骤s1中所描述的cmkgm溶液与de-to-chnf悬浮液浓度都为0.25wt％，ph为4.5。
15.进一步的，所述步骤s1中所描述的nhs和edc的加入量为10mmol/l。
16.进一步的，所述步骤s2中所描述的加热温度为50℃，时间2h。
17.进一步的，所述步骤s2中所描述的超声处理时间为2min。
18.进一步的，所述步骤s3中所描述的浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％和 2％(w/v)。
19.进一步的，所述步骤s3中所描述的纳米凝胶溶液与虾青素油相的比例为7:3。
20.进一步的，所述步骤s3中所描述的均质的温度为10℃，速度为12000 rmp/min，均质时间为3min。
21.本发明与现有技术相比，其显著优点:
22.(1)本发明所采用的de-to-chnf与cmkgm都是天然高分子产物，原料价廉易得，具有较好的生物相容性和可降解性，环保经济。
23.(2)本发明将de-to-chnf与cmkgm交联形成的纳米凝胶作为乳化剂具有独特的乳化优势。纳米凝胶颗粒具有独特的流变特性和界面性质，可以较好的提高乳液稳定性。其次，微凝胶纳米凝胶颗粒可以较好吸附在乳液的油水界面上，当聚合物内部的拓扑网络结构和其他吸附颗粒发生相互作用，微凝胶颗粒会发生变形和重排，颗粒间高度结合导致界面层变厚且具有机械弹性，进一步提高pickering乳液的稳定性。
24.(3)本发明所采用的交联剂edc/nhs是无毒、生物相容性良好的交联剂。交联过程中edc/nhs可帮助形成酰胺键，本身没有成为实际交联的一部分，且对于交联过程形成的副产物可以用水冲洗干净，不存在安全、污染的风险。
25.(4)本发明制备的虾青素pickering乳液具有结肠靶向传输功能的。 cmkgm在体内消化过程中不会被位于胃及小肠的酶所降解，而能被结肠部位的β-甘露聚糖酶降解，所以制备的虾青素pickering乳液在胃肠液中释放量低，而在含β-甘露聚糖酶的结肠液中有较高的释放量，具备结肠定位酶降解的特异性，因此能够显著提高虾青素的生物利用度，可拓展虾青素在食品及医药领域的应用范围。
附图说明
26.图1为本发明虾青素pickering乳液的制备工艺流程图。
27.图2为本发明中纳米凝胶制备的交联机理图。
28.图3为本发明虾青素pickering乳液的荧光显微图。
具体实施方式
29.以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
30.本发明中所需材料和溶液的制备方法如下：
31.脱乙酰基-氧化甲壳素纳米纤维(de-to-chnf)的制备：将5g甲壳素粉末置于250ml33％(w/v)的naoh溶液中，再加入15mg的硼氢化钠，在90℃的水浴中磁力搅拌8h。再经抽滤、洗涤后将得到的滤渣加到500ml磷酸钠缓冲液(ph＝6.8)中，加入0.08g2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(tempo)、6.78g亚氯酸钠和0.37g次氯酸钠溶液，立即塞紧烧瓶，在60℃水浴中磁力搅拌8h。反应结束后再进行抽滤、洗涤，将得到的滤渣置于适量去离子水中，调节ph到3左右，超声 0.5h，再将超声后的溶液冷冻干燥，得到de-to-chnf。
32.羧甲基魔芋葡甘聚糖(cmkgm)的制备：将5g魔芋粉末溶解在50 ml85％(v/v)含水乙醇中。然后在魔芋溶液中加入5g氯乙酸，磁力搅拌1.5h，控制温度为25℃。随后，升温至50℃，向混合体系中滴加6gnaoh(溶于30ml85％(v/v)乙醇中)进行碱化(4h)。反应后真空抽滤，滤渣用不同梯度的乙醇溶液洗涤数次，再将样品60℃下干燥并研磨获得cmkgm。
33.模拟胃液的制备：取6ml浓盐酸，用去离子水定容至1l，用0.1 mol/lhcl调节溶液ph至1.2后，加入胃蛋白酶使其含量达到9600 u/l，溶液过滤后备用。
34.模拟小肠液的制备：取0.2mol/l磷酸氢二钠49ml和0.2mol/l磷酸二氢钠51ml均匀混合后，加入800ml去离子水，用0.1mol/lnaoh 调节溶液ph至6.8，最后用去离子水定容至1l，再加入胰蛋白酶使其含量达到25000u/l，溶液过滤后备用。
35.模拟结肠液的制备：取0.2mol/l磷酸氢二钠81ml和19ml磷酸二氢钠51ml均匀混合后，加入800ml去离子水，用0.1mol/lnaoh 调节溶液ph至7.4，最后用去离子水定容至1l，再加入β～甘露聚糖酶使其含量达到600u/l，溶液过滤后备用。
36.如图1所示，具有结肠靶向传输功能的虾青素pickering乳液的制备方法包括以下步骤：
37.s1 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶的制备：
38.首先向cmkgm溶液中添加nhs和edc以激活羧基，再在磁力搅拌下将等体积的cmkgm溶液滴加到de-to-chnf悬浮液中形成纳米凝胶。然后以10,000rpm/min速度离心30min收集de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶，并用乙醇和蒸馏水反复洗涤获得的纳米凝胶。最后将收集的 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶冷冻干燥。
39.s2虾青素油相的制备：
40.称取虾青素粉末分散在亚麻籽油中，经过加热超声处理，得到浓度为 12mg/ml的虾青素油相。
41.s3虾青素pickering乳液的制备：
42.将s1中的纳米凝胶以不同浓度分散在水中，调节ph，再分别与虾青素油相混合，然后均质，制得虾青素pickering乳液。
43.在本发明中，s1中所描述的cmkgm溶液与de-to-chnf悬浮液浓度都为0.25wt％，ph为4.5。
44.在本发明中，s1中所描述的nhs和edc的加入量为10mmol/l。
45.在本发明中，s2中所描述的加热温度为50℃，时间2h。
46.在本发明中，s2中所描述的超声处理时间为2min。
47.在本发明中，s3中所描述的浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％和 2％(w/v)。
48.在本发明中，s3中所描述的纳米凝胶溶液与虾青素油相的比例为 7:3。
49.在本发明中，s3中所描述的均质的温度为10℃，速度为12000 rmp/min，均质时间为3min。
50.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
51.实施例1
52.s1 de-to-chnf/cmkgm复合纳米凝胶的制备：
53.首先向cmkgm溶液中添加nhs和edc以激活羧基。再在磁力搅拌下将等体积的cmkgm溶液滴加到de-to-chnf悬浮液中形成纳米凝胶。然后以10,000rpm/min速度离心30min收集de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶，并用乙醇和蒸馏水反复洗涤获得的纳米凝胶。最后将收集的 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶冷冻干燥。
54.s2虾青素油相的制备：
55.称取虾青素粉末分散在亚麻籽油中，经过加热超声处理，得到浓度为 12mg/ml的虾青素油相。
56.s3虾青素pickering乳液的制备
57.将s1中的纳米凝胶以0.5％浓度分散在水中，调节ph，再分别与虾青素油相混合，然后均质，制得虾青素pickering乳液。
58.实施例2
59.s1 de-to-chnf/cmkgm复合纳米凝胶的制备：
60.首先向cmkgm溶液中添加nhs和edc以激活羧基。再在磁力搅拌下将等体积的cmkgm溶液滴加到de-to-chnf悬浮液中形成纳米凝胶。然后以10,000rpm/min速度离心30min收集de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶，并用乙醇和蒸馏水反复洗涤获得的纳米凝胶。最后将收集的 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶冷冻干燥。
61.s2虾青素油相的制备：
62.称取虾青素粉末分散在亚麻籽油中，经过加热超声处理，得到浓度为 12mg/ml的虾青素油相。
63.s3虾青素pickering乳液的制备
64.将s1中的纳米凝胶以1％浓度分散在水中，调节ph，再分别与虾青素油相混合，然后均质，制得虾青素pickering乳液。
65.实施例3
66.s1 de-to-chnf/cmkgm复合纳米凝胶的制备：
67.首先向cmkgm溶液中添加nhs和edc以激活羧基。再在磁力搅拌下将等体积的cmkgm溶液滴加到de-to-chnf悬浮液中形成纳米凝胶。然后以10,000rpm/min速度离心30min收集de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶，并用乙醇和蒸馏水反复洗涤获得的纳米凝胶。最后将收集的 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶冷冻干燥。
68.s2虾青素油相的制备：
69.称取虾青素粉末分散在亚麻籽油中，经过加热超声处理，得到浓度为 12mg/ml的虾青素油相。
70.s3虾青素pickering乳液的制备：
71.将s1中的纳米凝胶以1.5％浓度分散在水中，调节ph，再分别与虾青素油相混合，然后均质，制得虾青素pickering乳液。
72.实施例4
73.s1 de-to-chnf/cmkgm复合纳米凝胶的制备：
74.首先向cmkgm溶液中添加nhs和edc以激活羧基。再在磁力搅拌下将等体积的cmkgm溶液滴加到de-to-chnf悬浮液中形成纳米凝胶。然后以10,000rpm速度离心30min收集de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶，并用乙醇和蒸馏水反复洗涤获得的纳米凝胶。最后将收集的 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶冷冻干燥。
75.s2虾青素油相的制备：
76.称取虾青素粉末分散在亚麻籽油中，经过加热超声处理，得到浓度为12mg/ml的虾青素油相。
77.s3虾青素pickering乳液的制备：
78.将s1中的纳米凝胶以1.5％浓度分散在水中，调节ph，再分别与虾青素油相混合，然后均质，制得虾青素pickering乳液。
79.实施例2
80.s1 de-to-chnf/cmkgm复合纳米凝胶的制备：
81.首先向cmkgm溶液中添加nhs和edc以激活羧基。再在磁力搅拌下将等体积的cmkgm溶液滴加到de-to-chnf悬浮液中形成纳米凝胶。然后以10,000rpm/min速度离心30min收集de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶，并用乙醇和蒸馏水反复洗涤获得的纳米凝胶。最后将收集的 de-to-chnf/cmkgm纳米凝胶冷冻干燥。
82.s2虾青素油相的制备：
83.称取虾青素粉末分散在亚麻籽油中，经过加热超声处理，得到浓度为 12mg/ml的虾青素油相。
84.s3虾青素pickering乳液的制备：
85.将s1中的纳米凝胶以2％浓度分散在水中，调节ph，再分别与虾青素油相混合，然后均质，制得虾青素pickering乳液。
86.对制备的虾青素pickering乳液进行性能检测：
87.(1)乳析指数
88.乳析指数(ci)用于量化表征乳状液的稳定性。将样品放置于4℃的冰箱中，间隔一定时间后分别乳液的乳析层的高度和乳液总高度。ci 采用以下公式进行计算
89.其中hl为乳析层的高度，th为乳液总高度。
90.(2)液滴粒径
91.在室温下通过马尔文粒度仪测定乳液的液滴大小。
92.(3)体外释放率
93.在37℃温度下将乳液分别置于模拟胃液、模拟肠液和模拟结肠液中，以150rpm/min速度震荡3h，然后检测虾青素的释放率。
94.(4)形态观察
95.使用共聚焦激光扫描显微镜记录样品的微观形态。在制备乳液之前，虾青素油相和纳米凝胶分用尼罗红(0.5毫克/毫升)和尼罗蓝(1毫克/毫升)进行标记。此外，尼罗红和尼罗蓝的激发波长分别被设定为488和633nm。
96.部分实验结果如下：
97.表1不同浓度纳米凝胶制备乳液的乳析指数
[0098][0099]
表2不同浓度纳米凝胶制备乳液的粒径
[0100][0101][0102]
表3不同浓度纳米凝胶制备乳液的体外释放率
[0103][0104]
虾青素pickering乳液的荧显微图见图3。
[0105]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。