一种药物组合物在制备铜绿假单胞菌耐药菌株生物膜抑制剂中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物组合物在制备铜绿假单胞菌耐药菌株生物膜抑制剂中的应用。


背景技术：

2.铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)是一种非发酵机会性致病革兰阴性杆菌，广泛存在于周围环境中，常引发医院内感染。据统计，铜绿假单胞感染占医院获得性感染的20-30％，且呈逐年增高的趋势，严重危害人类的生命健康。随着科学技术的发展，人们对细菌耐药机制的研究逐渐深入。现代研究表明，铜绿假单胞菌的耐药机制主要分为改变抗菌药物作用靶点，形成生物膜，主动外排系统、主动外排泵系统等机制。其中，生物膜耐药是其典型的适应性耐药机制之一，生物膜能帮助pa躲避人体免疫系统清除和抗生素攻击，对常用抗菌药物产生耐药性，给临床治疗带来了极大的挑战。
3.生物膜(bf)是细菌生长的一种自然形式，在自然环境中无所不在。其主要由细菌自身和其分泌的蛋白质、细胞外多糖、磷脂、肽聚糖等物质共同组成，成熟后形成蘑菇状膜结构，黏附在生命体腔道或无生命物质的表面，且黏附性强，可不断再生，极难被清除。研究表明，当细菌形成生物膜后，对抗生素的耐药性可增加10-1000倍，危害极大。此外，据估计，生物膜参与介导人体内65％-80％的感染，其感染人群多为医院内机械通气相关性患者、烧伤科患者和免疫力低下的老年患者，人数庞大，治疗费用高昂，为社会公共医疗体系带来了极大的挑战。
4.近年来的研究报道中，多重耐药、泛耐药和全耐药菌株屡见不鲜，已然对公共卫生安全构成了严重的威胁。随着抗生素的广泛运用，单种抗生素抗菌活性下降，治疗效果不佳。多种抗生素联用的治疗方案可以保证常规剂量下抗生素的抗菌活性，临床治疗效果好。然而多种抗生素联用的治疗方案无法从根源上解决耐药菌产生的问题，还可能为耐药菌的产生提供了合适的条件。此外，研究表明，多种抗生素处于亚抑菌浓度时将诱导细菌生物膜耐药，促进其毒力因子的产生，危害极大。故而，寻找新的药物替换或减少抗生素联用的种类，降低抗生素给药剂量，防治细菌生物膜耐药的给药策略势在必行。


技术实现要素：

5.基于此，本发明提供了一种药物组合物在制备铜绿假单胞菌生物膜抑制剂中的用途，该铜绿假单胞菌包括铜绿假单胞菌标准菌株和/或铜绿假单胞菌耐药菌株，其中该药物组合物包括中药提取物和左氧氟沙星，其中该中药提取物的制备方法包括：分别称取适量的黄芪、金银花、当归、青蒿和虎杖五种中药饮片，通过水提醇沉法制备该中药提取物。
6.根据本发明的另一个方面，提供了一种包含药物组合物的制剂在制备铜绿假单胞菌生物膜抑制剂中的用途，该铜绿假单胞菌包括铜绿假单胞菌标准菌株和/或铜绿假单胞菌耐药菌株，其中该药物组合物包括中药提取物和左氧氟沙星，其中该中药提取物的制备
方法包括：分别称取适量的黄芪、金银花、当归、青蒿和虎杖五种中药饮片，通过水提醇沉法制备该中药提取物。
7.进一步地，该制剂包括一种或多种药学上可接受的药用辅料。
8.进一步地，该药用辅料选自防腐剂、润湿剂、保湿剂、芳香剂、表面活性剂、乳化剂、增稠剂和润滑剂中的一种或多种。
9.进一步地，该五种中药饮片的重量份之比为(8～16):(1～5):(1～5):(1～5):(1～5)。
10.进一步地，该五种中药饮片的重量份之比为(10～14):(2～4):(1～3):(2～4):(1～3)。
11.进一步地，该五种中药饮片的重量份之比为约12:约3:约2:约3:约2。
12.进一步地，该五种中药饮片的重量份之比为(11.4～12.6):(2.85～3.15):(1.9～2.1):(2.85～3.15):(1.9～2.1)。
13.进一步地，该水提醇沉法包括以下步骤：依次使用10～12倍量水回流提取2～4次，每次0.5～2h，合并水提液，混匀，浓缩得到0.5～2.0g/ml生药浓度的浓缩液；待该浓缩液冷却至室温后，加入一定体积的乙醇至醇浓度为50％～70％，2～8℃冷藏静置18～30h；抽滤得到醇沉上清液，将其挥发至无醇味之后，浓缩得到1.0～3.0g/ml生药浓度的中药提取物。
14.进一步地，该水提醇沉法包括以下步骤：依次使用12、10、10倍量去离子水回流提取3次，每次约1h，合并3次水提液，混匀，浓缩得到约1.0g/ml生药浓度的浓缩液；待该浓缩液冷却至室温后，加入一定体积的乙醇至醇浓度为约60％，约4℃冷藏静置约24h；抽滤得到醇沉上清液，将其挥发至无醇味之后，浓缩得到约2.0g/ml生药浓度的中药提取物。
15.进一步地，该水提醇沉法包括以下步骤：依次使用12、10、10倍量去离子水回流提取3次，每次0.95～1.05h，合并3次水提液，混匀，浓缩得到0.95～1.05g/ml生药浓度的浓缩液；待该浓缩液冷却至室温后，加入一定体积的乙醇至醇浓度为57％～63％，3.8～4.2℃冷藏静置22.8～25.2h；抽滤得到醇沉上清液，将其挥发至无醇味之后，浓缩得到1.9～2.1g/ml生药浓度的中药提取物。
16.进一步地，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为(90～200):1。
17.进一步地，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为(150～195):1。
18.进一步地，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为(173.85～192.15):1；
19.进一步地，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为约183.3125:1。
20.进一步地，该生物膜抑制剂为阻碍生物膜形成的抑制剂。
21.本发明的有益效果：
22.与左氧氟沙星单用组相比较，中药提取物联用左氧氟沙星组对铜绿假单胞菌耐药菌生物膜形成量明显降低，差异具有统计学意义。研究结果提示，中药提取物可以协同增强左氧氟沙星对铜绿假单胞菌生物膜耐药机制的抑制作用。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求
保护的范围。
24.图1为铜绿假单胞菌活化平板划线结果示意图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
27.除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
28.本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
29.在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
30.正如背景技术部分所描述的，多重耐药、泛耐药和全耐药菌株屡见不鲜，已然对公共卫生安全构成了严重的威胁。随着抗生素的广泛运用，单种抗生素抗菌活性下降，治疗效果不佳。多种抗生素联用的治疗方案可以保证常规剂量下抗生素的抗菌活性，临床治疗效果好。然而多种抗生素联用的治疗方案无法从根源上解决耐药菌产生的问题，还可能为耐药菌的产生提供了合适的条件。此外，研究表明，多种抗生素处于亚抑菌浓度时将诱导细菌生物膜耐药，促进其毒力因子的产生，危害极大。为了解决上述问题，本发明提供了一种药物组合物在制备铜绿假单胞菌生物膜抑制剂中的用途，该铜绿假单胞菌包括铜绿假单胞菌标准菌株和/或铜绿假单胞菌耐药菌株，其中该药物组合物包括中药提取物和左氧氟沙星，其中该中药提取物的制备方法包括：分别称取适量的黄芪、金银花、当归、青蒿和虎杖五种中药饮片，通过水提醇沉法制备该中药提取物。
31.其中铜绿假单胞菌是医院内感染中常见的革兰氏阴性病原菌，其检出率高、治愈率低，耐药机制错综复杂，严重危害人类的生命健康。生物膜(bf)是铜绿假单胞菌适应性耐药机制的典型机制。一旦生物膜成熟，细菌将具有更强的适应外界环境的能力。研究表明，与浮游菌相比，生物膜成熟状态下的病原菌对抗生素的耐药性将高出10-1000倍。由于生物膜耐药具有可逆转性，可用于逆转耐药细菌耐药性的研究，具有极大的研究价值。
32.根据本发明的另一个方面，提供了一种包含药物组合物的制剂在制备铜绿假单胞菌生物膜抑制剂中的用途，该铜绿假单胞菌包括铜绿假单胞菌标准菌株和/或铜绿假单胞菌耐药菌株，其中该药物组合物包括中药提取物和左氧氟沙星，其中该中药提取物的制备
方法包括：分别称取适量的黄芪、金银花、当归、青蒿和虎杖五种中药饮片，通过水提醇沉法制备该中药提取物。
33.在一种优选的实施方式中，该制剂包括一种或多种药学上可接受的药用辅料。
34.在一种优选的实施方式中，该药用辅料选自防腐剂、润湿剂、保湿剂、芳香剂、表面活性剂、乳化剂、增稠剂和润滑剂中的一种或多种。
35.在一种优选的实施方式中，该五种中药饮片的重量份之比为(8～16):(1～5):(1～5):(1～5):(1～5)。
36.在本发明中，比例、当量、浓度、温度、次数、重量份或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“8～16”和“1～5”时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数，并且在上述所公开的范围内均能实现本发明的效果。
37.在一种优选的实施方式中，该五种中药饮片的重量份之比为(10～14):(2～4):(1～3):(2～4):(1～3)。
38.在一种优选的实施方式中，该五种中药饮片的重量份之比为约12:约3:约2:约3:约2。
39.在本发明中，“约”是指一个特定值的
±
5％范围的值。例如，“约12”包括12的
±
5％，即从11.4到12.6；
40.在一种优选的实施方式中，该五种中药饮片的重量份之比为(11.4～12.6):(2.85～3.15):(1.9～2.1):(2.85～3.15):(1.9～2.1)。
41.在一种优选的实施方式中，该水提醇沉法包括以下步骤：依次使用10～12倍量水回流提取2～4次，每次0.5～2h，合并水提液，混匀，浓缩得到0.5～2.0g/ml生药浓度的浓缩液；待该浓缩液冷却至室温后，加入一定体积的乙醇至醇浓度为50％～70％，2～8℃冷藏静置18～30h；抽滤得到醇沉上清液，将其挥发至无醇味之后，浓缩得到1.0～3.0g/ml生药浓度的中药提取物。
42.在一种优选的实施方式中，该水提醇沉法包括以下步骤：依次使用12、10、10倍量去离子水回流提取3次，每次约1h，合并3次水提液，混匀，浓缩得到约1.0g/ml生药浓度的浓缩液；待该浓缩液冷却至室温后，加入一定体积的乙醇至醇浓度为约60％，约4℃冷藏静置约24h；抽滤得到醇沉上清液，将其挥发至无醇味之后，浓缩得到约2.0g/ml生药浓度的中药提取物。
43.在一种优选的实施方式中，该水提醇沉法包括以下步骤：依次使用12、10、10倍量去离子水回流提取3次，每次0.95～1.05h，合并3次水提液，混匀，浓缩得到0.95～1.05g/ml生药浓度的浓缩液；待该浓缩液冷却至室温后，加入一定体积的乙醇至醇浓度为57％～63％，3.8～4.2℃冷藏静置22.8～25.2h；抽滤得到醇沉上清液，将其挥发至无醇味之后，浓缩得到1.9～2.1g/ml生药浓度的中药提取物。
44.在一种优选的实施方式中，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为(90～200):1。
45.在一种优选的实施方式中，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为(150～
195):1。
46.在一种优选的实施方式中，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为(173.85～192.15):1；
47.在一种优选的实施方式中，该中药提取物和该左氧氟沙星的质量之比为约183.3125:1。
48.在一种优选的实施方式中，该生物膜抑制剂为阻碍生物膜形成的抑制剂。
49.本发明还提供一种抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的方法，该方法包括给予有效量的上述药物组合物。当然，用药剂量根据给药方式、所需要的治疗和所适用的疾病而不同。
50.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
51.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本技术所要求保护的范围。
52.实施例
53.实验仪器
54.调温电热套，北京中兴伟业仪器有限公司(型号：zdhw)；电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司(型号：cpa2250)；电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司(型号：dhg-9070a)；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司(型号：yxq-100a)；电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司(型号：hh-s6)；循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司(型号：shb-iii)；酶标分析仪，北京朗新技术有限公司(型号：dnm-9602)；微生物可编程培养箱，立德泰勊(上海)科学仪器有限公司(lt-ibx120n)；ii级a2生物安全柜，赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司(型号：1374)；漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司(型号：xw-80a)；微量移液器，德国eppendorf公司；-80℃低温冰箱，美国thermo公司(型号：ult1386-3-v42)；超速离心机，美国sigma公司(型号：sartorius 1-14)；水浴氮吹仪，北京成萌伟业科技有限公司(型号：cm-24)；气浴恒温振荡仪，济宁市翰业机械设备有限公司(型号zd-85)。
55.细菌菌株
56.标准铜绿假单胞菌atcc27853一代菌株(编号bncc337940)，由北京北纳创联生物技术研究院提供；多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株(样本号19pxsp2218)由北京中医药大学东直门医院检验科提供。
57.实验试剂与药物
58.胰蛋白胨大豆肉汤(tsb，批号：20200930)，营养琼脂(na，批号：20200921)，m-h琼脂(mha，批号：20210124)，琼脂粉(批号：20190422)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。m-h肉汤(mhb，批号：1126t031)购自北京索莱宝科技有限公司。蛋白胨(批号：20190102)购自北京博奥拓达科技有限公司。左氧氟沙星标准品(cas#100986-85-4，hplc≥99％)，盐酸环丙沙星(cas#93107-08-5，hplc≥98％)，苔黑酚(3,5-二羟基甲苯，ar，批号：s30251)，0.4％草酸铵结晶紫染液(批号：r20710)，2.5％戊二醛固定液(批号：l26o11g128919)，氯化镁(ar，批号：s01a10y84450)，甘油(ar)，硫酸钾(ar)，均购自上海源叶生物技术有限公司。95％乙醇，乙酸乙酯(ar)购自北京虹湖联用化工产品有限公司。氯化钠注射液(批号：1905052103)购自石家庄四药有限公司。浓硫酸(ar)，浓盐酸(ar)，氯仿
(ar)由北京中医药大学危化品管理仓库提供。
59.中药饮片黄芪，北京三和药业有限公司(产地：甘肃，批号：90541102)；中药饮片金银花，北京三和药业有限公司(产地：河南，批号：93451002)；中药饮片当归，北京三和药业有限公司(产地：甘肃，批号：90280901)；中药饮片青蒿，北京三和药业有限公司(产地：河北，批号：93051001)；中药饮片虎杖，北京三和药业有限公司(产地：江苏，批号：90510501)。
60.实验器材
61.60mm无菌培养皿，柏丞科技(北京)有限公司；24孔培养板，美国corning-costar公司(货号：3524)；96孔u底培养板，美国corning-costar公司(货号：3799)；96孔培养板，美国corning-costar公司(货号：3599)；50ml无菌离心管，美国corning-costar公司(货号：430828)；15ml无菌离心管，美国corning-costar公司(货号：430791)；针筒式过滤器，赛普锐思(北京)科技有限公司(货号：gl1320sx)。
62.相关器械：大鼠灌胃针，负压真空无菌采血管，无菌棉球，医用一次性使用采血针、1ml注射器、棉柔巾、1.5ml离心管盒、12ml无菌摇菌管、5ml无菌摇菌管、镊子、搪瓷盘、接种环、铝制消毒盒、针筒式过滤器等均购自赛普锐思(北京)科技有限公司。
63.数据处理
64.采用spss statistics 21.0和origin2021分别进行数据统计和作图，计量资料采用表示，符合正态分布且方差齐时采用单因素方差分析，组间比较采用lsd-t法，符合正态分布方差不齐时采用单因素方差分析，组间比较采用dunnett-t3法，对不符合正态分布的计量资料采用非参数检验，以p＜0.05表示差异有统计学意义。
65.实施例一铜绿假单胞菌活化情况观察
66.1实验方法
67.1.1菌悬液制备
68.1.1.1培养基的配制
69.按说明书30.0g/l比例用电子天平称取tsb培养基(成分：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、葡萄糖，ph值＝7.3
±
0.2)1.5g，置于150ml锥形瓶中，加入50ml蒸馏水充分溶解后，将耐高温组培封口膜置于锥形瓶口，棉绳打结封紧，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压灭菌15min，自然冷却至室温后摇匀，于酒精灯旁打开，灼烧瓶口后分装于12ml无菌摇菌管，每管5-6ml，封口膜密封保存于4℃冰箱中备用。
70.按说明书33.0g/l比例用电子天平称取na培养基(成分：蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠、琼脂，ph值＝7.3
±
0.1)3.3g，置于250ml锥形瓶中，加入100ml蒸馏水充分溶解后，将耐高温组培封口膜置于锥形瓶口，棉绳打结封紧，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压灭菌15min，自然冷却至触摸不烫手后摇匀，于酒精灯旁打开，灼烧瓶口后倾倒入直径为60mm的无菌培养皿中铺平，使得培养基厚度为5mm左右，待其自然冷却凝固后，保存于4℃冰箱中备用。
71.1.1.2菌株的准备
72.(1)菌株活化：先准备1支含有5-6ml的tsb培养基的无菌摇菌管，室温下放置，待温度回升。去除装有铜绿假单胞菌冻干菌粉的冻干管管身标签，用含75％酒精的湿润棉球擦拭管壁后移入生物安全柜。点燃酒精灯，于酒精灯旁10cm无菌范围内进行打管。用小砂轮在管身1/2处划两圈，用含75％酒精的湿润棉球擦拭，再将冻干管顶部置于酒精灯火焰上灼
烧，然后迅速滴加较低温度的无菌生理盐水使得管壁破裂，用镊子轻轻敲去碎玻璃。吸取0.5ml的tsb培养基注入冻干管，轻轻吹打几次，充分溶解后重新打回摇菌管，混匀。将含菌的tsb摇菌管置于恒温箱中37℃培养16-20h。
73.(2)分区划线：将琼脂平板倒扣置于酒精灯旁10cm无菌范围内，右手持接种环用酒精灯外火焰灼烧接种环至通红，在范围内冷却5-6秒。左手取出含菌的tsb摇菌管，取下封口膜，用右手小指和无名指打开摇菌管盖，酒精灯外火焰快速灼烧管口。右手持接种环挑取少量pa菌液，左手快速打开培养皿，尽量使其垂直于桌面。将平板分为a、b、c和d共4区，在a区z字型划数条连续的平行线，快速将皿底倒扣在皿盖上方，灼烧去除接种环上残菌，避免菌量过多影响分离效果。待接种环冷却5-6秒，转动培养皿约75
°
角，将b区转到上方，接种环经a区将菌带至b区，z字型划数条连续的平行线，完成第二次平行划线。使用相同方法，依次完成从b区到c区的第三次平行划线和从c区到d区的第四次平行划线后，将含菌的tsa琼脂平板置于恒温箱中37℃培养16-20h，观察pa的生长情况。注意d区是否分离出单菌落，并观察菌落外观特征(形状、大小、表面、边缘、颜色及透明度等性状)。
74.2实验结果
75.经37℃恒温培养16-20h后，观察发现转种标准铜绿假单胞菌菌株及临床多重耐药铜绿假单胞菌菌株的摇菌管中tsb培养基均由澄清变为浑浊。菌液划线琼脂平板经37℃恒温培养16-20h后，可见典型pa菌落，菌落大小不一，约2-4mm，颜色浅黄，形状扁平，边缘不规则，中间凸起，质地湿润粘稠。平板有生姜气味，大部分区域明显变绿。如图1所示。本实验pa菌株复活性良好，菌落形态符合要求。
76.实施例二中药提取物联用左氧氟沙星对耐药菌生物膜的影响
77.1实验方法
78.1.1菌悬液制备
79.1.1.1培养基的配制
80.按说明书42.0g/l比例用电子天平称取mha培养基(成分：酪蛋白胨、牛肉浸粉、可溶性淀粉、琼脂，ph值＝7.3
±
0.1)12.6g，置于锥形瓶中，加入300ml蒸馏水充分溶解后，将耐高温组培封口膜置于锥形瓶口，棉绳打结封紧，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压灭菌15min，自然冷却至触摸不烫手后摇匀，于酒精灯旁打开，灼烧瓶口后倾倒入直径为60mm的无菌培养皿中铺平，使得培养基厚度为5mm左右，待其自然冷却凝固后，保存于4℃冰箱中备用。
81.1.1.2菌液的准备
82.挑取单个铜绿假单胞耐药菌菌落，采用分区划线的方法接种至mha平板上，置于恒温培养箱中37℃培养16-20h后。准备好1支12ml的无菌摇菌管，用注射器抽取3-4ml的生理盐水注入。酒精灯外焰灼烧接种环至通红，在酒精灯旁10cm范围内冷却5-6秒，挑取mha平板d区的典型pa单菌落，用右手小指和无名指打开摇菌管盖，左手持摇菌管，用酒精灯外火焰快速灼烧管口后，将接种环置于摇菌管管壁上，将黏稠的菌落研磨分散，并取一支无菌3ml滴管，反复吹打使pa混悬，采用remel0.5麦氏比浊管进行目测比浊，待菌液浓度调节至0.5麦氏浓度(1.5
×
108cfu/ml)，用移液枪反复吹打混匀，移取200μl加入96孔板中，设置3个复孔，测定波长600nm下的吸光度值(od600＝0.11)。4mcf浓度菌液配制方法相同，当其稀释8倍后浓度为0.5mcf，即配制完成。每次实验时菌悬液均现配现用。
83.1.2干预药液的制备
84.1.2.1中药提取物的制备
85.按重量份比例(12:3:2:3:2)分别称取黄芪、金银花、当归、青蒿和虎杖共五种中药饮片。采用水提醇沉法制备中药提取物：依次采用12、10、10倍量去离子水回流提取3次，每次1h，合并3次水提液，置于2l烧杯中混匀，倒入蒸发皿中置于水浴锅上浓缩，得到1.0g/ml生药浓度的浓缩液；待该浓缩液冷却至室温后，加入一定体积的乙醇至醇浓度为60％，4℃冷藏静置24h(加醇过程注意慢加快搅，以避免产生大颗粒絮状物，影响醇沉效果)；抽滤得到醇沉上清液后，倒入蒸发皿中置于水浴锅上挥至无醇味后，浓缩至2.0g/ml生药浓度，密封，-80℃保存。
86.1.2.2左氧氟沙星药液配制
87.取80mg左氧氟沙星标准品，精密称定，用移液器吸取1ml生理盐水充分溶解，采用生理盐水进一步稀释药液，0.22μl微孔滤膜除菌，制备得到200μg/ml左氧氟沙星标准品溶液，密封，-20℃保存。
88.1.3生物膜形成量的测定
89.1.3.1培养基的配制
90.按说明书24.0g/l比例用电子天平称取mhb培养基(成分：牛肉浸粉、淀粉、酪蛋白水解物，ph值＝7.2
±
0.2)7.2g，置于锥形瓶中，加入300ml蒸馏水充分溶解后，将耐高温组培封口膜置于锥形瓶口，棉绳打结封紧，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压灭菌15min，自然冷却至室温后备用。
91.1.3.2耐药菌生物膜干预药液的配制
92.(1)左氧氟沙星(lev)组：用mhb培养基将200μg/ml左氧氟沙星标准品溶液稀释成4.0和2.0μg/ml的左氧氟沙星药液，分别对应于高浓度左氧氟沙星药液和低浓度左氧氟沙星药液。
93.(2)中药提取物联用左氧氟沙星(lev+zy)组：用mhb培养基将200μg/ml左氧氟沙星标准品溶液稀释成8.0和4.0μg/ml的左氧氟沙星药液。然后用mhb培养基将2g/ml的中药提取物稀释成1466.7和733.3μg/ml的中药提取物药液。依次将上述浓度的左氧氟沙星组和中药提取物药液从高浓度到低浓度配对等体积混合，最终得到2种联用组药液，分别对应于高浓度联用组药液和低浓度联用组药液。
94.1.3.3结晶紫染色法测定生物膜
95.(1)细菌的接种：分别在1ml的左氧氟沙星组、中药提取物联用左氧氟沙星组药液中接种10μl的0.5mcf铜绿假单胞菌菌液，吹打混匀后，吸取200μl的含菌溶液加入u底96孔板中，并设置阳性对照孔和阴性对照孔，每组设置6个复孔，重复实验3次。
96.(2)生物膜的建立：将上述(1)中的96孔板放入恒温培养箱中37℃培养。铜绿假单胞菌标准菌培养时间为24h，铜绿假单胞菌耐药菌培养时间为48h。
97.(3)结晶紫染色：待上述(2)培养结束，将96孔板取出，小心倒掉孔内菌液，用排枪吸取200μl生理盐水加入孔中，加液动作轻柔缓慢，共洗涤2次，即去除浮游菌。96孔板上铺上3层棉柔巾，倒扣吸去孔内剩余液体，加入200μl的2.5％戊二醛固定20min(避光)，固定完成后将液体小心倒掉。96孔板上铺上3层棉柔巾，倒扣吸去孔内剩余液体。排枪吸取200μl生理盐水加入孔中，加液动作轻柔缓慢，共洗涤2次。96孔板上铺上3层棉柔巾，倒扣吸去孔内
液体。排枪吸取200μl的0.4％结晶紫染色液加入孔中，染色15min(避光)。染色完成后将液体小心倒掉。排枪吸取200μl生理盐水清洗96孔板3-4次，将可见杂质清洗干净。96孔板上铺上3层棉柔巾，倒扣吸去孔内液体，室温下避光放置干燥，待孔内无明显液体，排枪吸取200μl95％乙醇加入孔中脱色溶解生物膜中结晶紫10分钟，用酶标仪检测595nm波长下吸光度值。
98.2实验结果
99.中药提取物联用左氧氟沙星对铜绿假单胞菌耐药菌株生物膜的影响结果如表1所示。测定结果表明，与空白对照组(即耐药菌株未加入任何药组)相比，左氧氟沙星单用组铜绿假单胞菌耐药菌株生物膜形成量均显著减少(p＜0.01)；与空白对照组相比，中药提取物联用左氧氟沙星各浓度组生物膜形成量明显减少(p＜0.01)。与左氧氟沙星单用组相比，中药提取物联用左氧氟沙星组生物膜形成量均明显减少(p＜0.01)，表现出明显的协同效应。
100.表1中药提取物联用左氧氟沙星对pa耐药菌株生物膜形成量(od595)的影响(n＝5)
[0101][0102][0103]
注：
*
：vs空白对照p＜0.05；
**
：vs空白对照p＜0.01；
#
：vs lev p＜0.05；
##
：vs lev p＜0.01。
[0104]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体构造及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
[0105]
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。