千金藤素及包含其的组合物用于预防或治疗酒精性肝病的应用

1.本发明属于医药领域，具体而言，涉及千金藤素或其药学上可接受的盐以及包含千金藤素或其药学上可接受的盐和美他多辛的组合物在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的应用。


背景技术：

2.酒精性肝病(alcoholic liver disease，ald)是一类由于长期过量饮酒而引起的慢性肝脏疾病。ald发展初期通常表现为酒精性脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。随着经济水平的提高和饮酒人群比例的增多，目前ald已成为肝脏相关疾病发生率和死亡率升高的重要原因之一。
3.肝脏是酒精在体内代谢的主要场所，正常条件下，肝内的乙醇脱氢酶能够将酒精(乙醇)分解为乙醛，乙醛脱氢酶再将乙醛分解为乙酸，从而被细胞进一步代谢。长期大量饮酒会导致体内的酒精代谢异常，使nad+依赖的脂肪酸氧化酶脱氢能力减弱，脂肪酸β氧化速率降低，最终导致肝脏甘油三酯的积累。此外，酒精代谢产生的有毒代谢物乙醛也会不断积累。乙醛通过与微管蛋白结合损害微管介导的胞内转运系统，导致细胞内正常分泌的蛋白质滞留，脂质排泌障碍，加重肝细胞的脂质过度累积。乙醛还能够直接抑制甘油三酯水解和脂肪酸氧化代谢相关因子，从而进一步抑制脂肪酸的β氧化。最终导致酒精性脂肪肝的发生。
4.目前临床上对酒精性脂肪肝的诊断除根据患者饮酒情况外，还通过谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)的水平关系来判断，特别是用于与非酒精性脂肪肝进行区分。与非酒精性脂肪性肝病(nafld)不同，ald患者即使肝损伤严重，alt水平正常或仅轻微升高，通常血清alt水平低于ast水平，故ast/alt＞1，比值常为2～5；而nafld患者alt水平一般会高于ast水平，即alt/ast＞1。即使晚期nafld并伴有肝硬化患者，其ast/alt水平仍低于2。此外，ald的发生主要是以乙醇及其代谢物为主要诱因，而nafld则主要与胰岛素抵抗相关。因此这两种肝病从病因、病理改变和临床表现等方面都有着明显的区别。
5.酒精性肝病是一种多因素疾病，目前酒精性肝病的治疗主要从戒酒、营养支持和药物治疗等方面入手。临床上常用的单一药物治疗虽然能缓解症状但治疗效果仍不甚理想。肝移植仍然是大部分晚期肝病患者的唯一选择。因此，寻找新型治疗酒精性肝病的药物，特别是能够发挥早期干预作用，如抑制酒精性脂肪肝发生的新型药物，对于ald的治疗具有非常重要意义。
6.现有技术文献
7.非专利文献
8.1.中华医学会，等，酒精性肝病基层诊疗指南(2019年)，临床肝胆病杂志,2021.37(1):p.5.
9.2.范建高,酒精性与非酒精性脂肪性肝病，中华肝脏病杂志,2003.11(11):p.1.
10.3.addolorato,g.,et al.,metadoxine in the treatment of acute and chronic alcoholism:a review.international journal of immunopathology and pharmacology,2003.16(3):p.207-214.


技术实现要素：

11.本发明的目的在于提供一种能够有效地预防和/或治疗酒精性肝病的药物。本发明人经过深入研究后发现，千金藤素能够显著降低血清中ast和alt以及甘油三酯(tg)的水平，对肝脏细胞空泡化具有明显的改善作用，可显著改善小鼠肝脏脂质蓄积情况，并且能够显著上调脂肪甘油三酯脂酶(atgl)和肉碱棕榈酰转移酶1a(cpt-1a)的基因表达，显示出对酒精性肝病具有显著疗效。另外，千金藤素与美他多辛的组合物通过合理配伍应用可以达到协同增效的目的，在预防和/或治疗酒精性肝病症方面具有良好的开发前景。
12.具体而言，本发明提供：
13.1.千金藤素或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的应用。
14.2.根据上述第1项所述的应用，其中，所述酒精性肝病包括酒精性脂肪肝和酒精性肝炎中的至少一者。
15.3.根据上述第1项或第2项所述的应用，其中，所述千金藤素或其药学上可接受的盐与药学上可接受的添加剂组合从而以药物组合物的形式使用。
16.4.根据上述第3项所述的应用，其中，所述添加剂包括选自赋形剂、崩解剂、润滑剂中的至少一者。
17.5.根据上述第1项或第2项所述的应用，其中，以所述千金藤素或其药学上可接受的盐的质量计，给药剂量为1～200mg/kg，优选为5～40mg/kg。
18.6.一种组合物，其包含千金藤素或其药学上可接受的盐和美他多辛，其中，以质量比计，千金藤素或其药学上可接受的盐与美他多辛的含量之比为1:200至1:1，优选为1:10至1:5。
19.7.根据上述第6项所述的组合物，其中还包括药学上可接受的添加剂。
20.8.根据上述第7项所述的组合物，其中，所述添加剂包括选自赋形剂、崩解剂、润滑剂中的至少一者。
21.9.上述第6至8项中任意一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的应用。
22.10.根据上述第9项所述的应用，其中，所述酒精性肝病包括酒精性脂肪肝和酒精性肝炎中的至少一者。
23.发明效果
24.根据本发明，千金藤素或其药学上可接受的盐能够显著降低血清中ast和alt以及甘油三酯(tg)的水平，对肝脏细胞空泡化具有明显的改善作用，可显著改善小鼠肝脏脂质蓄积情况，并且能够显著上调脂肪甘油三酯脂酶(atgl)和肉碱棕榈酰转移酶1a(cpt-1a)的基因表达，显示出对酒精性肝病具有显著疗效，因而预期可以成为用于治疗酒精性肝病的候选药物。此外，千金藤素易于获得，成本低廉，毒副作用小，相比目前临床上正在应用的同类药物优势明显。
25.另外，根据本发明，千金藤素或其药学上可接受的盐与美他多辛的组合物通过合理配伍应用可以达到协同增效的目的，符合中西药联合使用的临床现状，在酒精性肝病领域具有良好的开发前景。
附图说明
26.图1示出的是小鼠肝脏病理切片he染色结果的显微镜照片。
27.图2示出的是小鼠肝脏病理切片油红o染色结果的显微镜照片。
28.图3示出的是千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物对小鼠肝脏匀浆中总甘油三酯水平的比较结果的柱形图。
29.图4示出的是千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物对小鼠血清生化指标的比较结果的柱形图。
30.图5示出的是千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物对小鼠肝脏脂质分解基因即atgl(脂肪甘油三酯脂酶)和cpt-1a(肉碱棕榈酰转移酶1a)表达水平的比较结果的柱形图。
具体实施方式
31.以下通过具体实施方式的描述对本发明进行详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
32.本发明的第一方面提供千金藤素或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的应用。
33.千金藤素(cepharanthine，cep)是一种双苄基异喹啉类生物碱，化学式为c
37h38
n2o6，其结构式如下述化学式1所示。
34.[化学式1]
[0035][0036]
千金藤素主要来源于防己科千金藤属植物千金藤(stephaniajaponica(thunb.)miers)。作为已上市药物，临床常用来治疗因化疗所致的白细胞减少症。同时，大量研究表明cep具有清热凉血、抗炎、调节免疫、抗肿瘤等作用。目前关于千金藤素的研究主要集中于抗肿瘤和抗病毒方面。尚未有文献报道该化合物在酒精性肝病治疗方面的作用。
[0037]
本发明中，千金藤素可以使用从植物中提取得到的单一化合物，也可以使用市售产品。
[0038]
本发明中，也可以使用千金藤素的盐类。所述盐类可以为药学上可接受的盐。具体而言，可以举出：与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的盐，或者与甲酸、
乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二甲苯酰酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸形成的盐。
[0039]
本发明中，千金藤素或其药学上可接受的盐可以与药学上可接受的添加剂组合而以药物组合物的形式使用。
[0040]
上述药物组合物中，千金藤素或其药学上可接受的盐与药学上可接受的添加剂混合，以得到可以口服或肠胃外给药的药物组合物。药物组合物可以由常规方法来配制。
[0041]
可以采用经口给药的剂型(例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂等)，或者采用非经口给药的剂型(例如注射剂等)来进行给药。
[0042]
作为用于经口给药的固体组合物，可以采用片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等。在这样的固体组合物中，将千金藤素或其药学上可接受的盐与至少一种添加剂混合。上述添加剂包括赋形剂、崩解剂、润滑剂等。
[0043]
赋形剂例如包括乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和/或硅酸铝镁等。
[0044]
崩解剂包括纤维素(例如羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠或结晶纤维素)，淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉或羧甲基淀粉钠)，交联聚乙烯吡咯烷酮等。
[0045]
润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、蔗糖脂肪酸酯、滑石、聚乙二醇等。
[0046]
根据目的，本发明的固体制剂可任选地包含适量的其它添加剂。这些添加剂包括粘合剂、增塑剂、包衣剂、抗絮凝剂、增溶剂、甜味剂、酸化剂、调味剂、ph调节剂、助溶剂、着色剂和增香剂等。粘合剂包括藻酸钠、明胶、糊精、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。增塑剂包括柠檬酸三乙酯、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇等。包衣剂包括乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等。抗絮凝剂包括滑石、硬脂酸钙等。增溶剂包括蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠等。甜味剂包括糖精、甘草酸二钾、甜叶菊等。酸化剂包括柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、富马酸等。调味剂包括1-薄荷醇、氯化钠、蔗糖等。ph调节剂包括柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐等。助溶剂包括环糊精、精氨酸、赖氨酸、三氨基甲烷等。着色剂包括三氧化二铁黄、三氧化二铁、叶绿酸铜钠等。增香剂包括橙油、柠檬油、薄荷油、桉树油等。
[0047]
本发明的片剂可依照片剂生产中的常规方法来制备，例如，可通过以下步骤来制备：i)制备包含千金藤素或其药学上可接受的盐、以及选自由赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、增塑剂、包衣剂、抗絮凝剂、增溶剂、甜味剂、酸化剂、调味剂、ph调节剂、助溶剂、着色剂和增香剂组成的组中的一种或多种添加剂的混合物，然后ii)对在上述i)中所得的混合物进行压制成型。
[0048]
用于非经口给药的注射剂包括无菌的水性或非水性的溶液剂、混悬剂或乳剂。作为水性的溶剂，例如包括注射用蒸馏水或生理盐水。作为非水性的溶剂，例如有丙二醇、聚乙二醇或橄榄油等植物油、乙醇等醇类、或吐温80等。该制剂中还可以含有等渗剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、或溶解助剂。例如可以通过可截留细菌的过滤器进行过滤、加入杀菌剂、或者进行照射而被灭菌。此外，也可以制成无菌的固体物，在使用之前用无菌水或无菌的注射用溶剂进行溶解或混悬后使用。
[0049]
在经口给药时，合适的1天的给药剂量按体重约为1～200mg/kg、优选为1～100mg/kg、进一步优选为1～50mg/kg、更优选为5～40mg/kg，并将该剂量一次服用或者分2～4次服用。考虑症状、年龄、性别等，根据不同的情况，来适当地选择给药剂量。
[0050]
本发明的第二方面提供一种组合物，其包含千金藤素或其药学上可接受的盐和美他多辛作为主要组分。需要说明的是，“主要组分”是指含量为组合物总质量的90％以上(质量分数)的成分，优选为组合物总质量的95％以上，更优选为组合物总质量的99％以上。
[0051]
美他多辛(metadoxine，mdx)，化学名称为吡多醇l-2吡咯烷酮-5-羧酸盐，分子式c8h
11
no3·
c5h7no3，结构式如下述化学式2所示。
[0052]
[化学式2]
[0053][0054]
美他多辛是已上市的临床治疗酒精性肝病的药物，属于促乙醇代谢类药物，可以恢复乙醛脱氢酶的活性并增加还原型谷胱甘肽的水平，促进机体中乙醇、乙醛的代谢，降低血液中乙醇浓度，减少乙醇在机体停留时间，从而减少因酒精及其有毒代谢物的蓄积而对肝脏造成的损伤。迄今为止没有文献报道千金藤素或其药学上可接受的盐与美他多辛组合用于预防和/或治疗酒精性肝病。
[0055]
本发明中，美他多辛作为市售产品可以容易地获得。
[0056]
在上述组合物中，以质量比计，千金藤素或其药学上可接受的盐相对于美他多辛的含量之比为1:200至1:1，优选为1:100至1:1，进一步优选为1:50至1:1，更优选为1:10至1:5。当千金藤素或其药学上可接受的盐相对于美他多辛的含量之比在上述范围内时，能够有效地预防和/或治疗酒精性肝病。
[0057]
千金藤素或其药学上可接受的盐和美他多辛可以与药学上可接受的添加剂混合，以得到可以口服或肠胃外给药的药物组合物。药物组合物可以由常规方法来配制。
[0058]
可以采用经口给药的剂型(例如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂等)，或者采用非经口给药的剂型(例如关节内、静脉内、肌肉内等的注射剂，栓剂，滴眼剂，眼软膏，经皮吸收的液体制剂，软膏剂，经皮吸收的贴剂，经粘膜吸收的液体制剂，经粘膜吸收的贴剂，吸入剂等)来进行给药。优选采用经口给药的剂型，更优选采用片剂、胶囊剂、或颗粒剂。
[0059]
各剂型的制备方法可以采用与前述的包含千金藤素或其药学上可接受的盐的剂型的制备方法相似的方法。
[0060]
在经口给药时，合适的1天的给药剂量按体重约为1～200mg/kg、优选为1～100mg/kg、进一步优选为1～50mg/kg、更优选为5～40mg/kg，并将该剂量一次服用或者分2～4次服用。考虑症状、年龄、性别等，根据不同的情况，来适当地选择给药剂量。
[0061]
另外，本发明的上述药物组合物的制剂也可以与其它的酒精性肝病治疗剂合用。合用时，可以同时给药，或者分别连续地、或按所希望的时间间隔给药。
[0062]
本发明的第三方面涉及上述第二方面的组合物用于预防和/或治疗酒精性肝病治
疗剂的应用。
[0063]
本发明的上述包含千金藤素或其药学上可接受的盐和美他多辛的药物组合物通过合理配伍应用可以达到协同增效的目的，可以有效地用于预防和/或治疗酒精性肝病。
[0064]
酒精性肝病是一类由于长期过量饮酒而引起的慢性肝脏疾病。本发明中，千金藤素或其药学上可接受的盐、以及千金藤素或其药学上可接受的盐和美他多辛的组合物对于包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎在内的酒精性肝病的预防和/或治疗是有效的。
[0065]
实施例
[0066]
以下通过例子进一步解释或说明本发明的内容，但是这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。
[0067]
需要说明的是，以下实施例中所用的各种试剂等是本领域已知的，可通过商购得到。
[0068]
1、酒精性肝病小鼠模型的建立
[0069]
参照下述现有文献1，采用慢性兼急性乙醇喂养的方法来模拟临床上慢性饮酒兼单次暴饮造成的酒精性肝病模型。实验所用小鼠为spf级雄性c57bl/6j小鼠，8周龄，体重20-24g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0070]
文献1：bertola a,mathews s,ki sh,wang h,gao b.mouse model of chronic and binge ethanol feeding(the niaaa model).nature protocols 2013,8(3):627-637.
[0071]
2、实验分组及给药
[0072]
美他多辛：购自mce(medchemexpress)，货号：hy-b1898。
[0073]
千金藤素：购自topscience，货号：t0131。
[0074]
动物适应性喂养一周后，将小鼠按体重分为9组：空白对照组、酒精模型、美他多辛组、cep-5mg/kg组、cep-10mg/kg组、cep-20mg/kg组、cep-40mg/kg组、cep-20mg/kg与美他多辛200mg/kg组合用药组、cep-40mg/kg与美他多辛200mg/kg组合用药组。详见表1。实验均采用lieber-decarli液体饲料喂养，空白对照组采用不含酒精的等热量液体饲料喂养，实验对照组及给药组采用5％的酒精液体饲料喂养。为减少酒精对小鼠的刺激，降低模型小鼠的死亡率，实验前3天各组动物均采用不含酒精的等热量对照饲料适应喂养，而后实验对照组和给药组每两天增加一次酒精浓度，酒精浓度分别为2％、3％、4％，随后11天酒精浓度增加到5％，进入造模期，同时灌胃给予各给药组不同浓度的药物处理，空白对照组则给予生理盐水作为对照。在第12天早上8点，灌胃给予实验对照组和给药组30％浓度的酒精，空白对照组给予等热量的麦芽糊精，9小时后将小鼠安乐死，取小鼠血清及肝脏组织。实验期间，小鼠饲养在12个小时明暗循环的spf环境里，每天下午4点左右更换新的饲料，不附加给水，小鼠自由进食。
[0075]
表1实验分组及给药
[0076]
组别给药剂量空白对照——酒精模型——美他多辛200mg/kg千金藤素-55mg/kg
千金藤素-1010mg/kg千金藤素-2020mg/kg千金藤素-4040mg/kg组合物组-120mg/kg千金藤素+200mg/kg美他多辛组合物组-240mg/kg千金藤素+200mg/kg美他多辛
[0077]
3、试验结果
[0078]
3.1千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物给药后的小鼠肝脏病理切片he染色结果
[0079]
如图1所示，小鼠肝脏病理切片he染色结果表明慢性兼急性酒精喂养会导致小鼠肝脏细胞严重空泡化等病理改变，千金藤素给药对肝脏细胞空泡化具有明显的改善作用，并且可以看出千金藤素与美他多辛组合给药改善作用更为明显。
[0080]
3.2千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物给药后的小鼠肝脏病理切片油红o染色结果
[0081]
图2的油红o染色显示，经慢性兼急性乙醇喂养后，小鼠肝脏出现严重的脂质蓄积，单独给予美他多辛或不同浓度的千金藤素治疗可显著改善小鼠肝脏脂质蓄积情况。千金藤素和美他多辛组合应用使小鼠肝脏脂质蓄积情况得到进一步改善。
[0082]
3.3千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物给药后对小鼠肝脏匀浆中总甘油三酯(tg)水平的影响
[0083]
试验结果参见表2，并且直观地示于图3。
[0084]
表2.小鼠肝脏总甘油三酯水平
[0085][0086]
注：*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001，与酒精模型组比；
[0087]
#表示与对应浓度的千金藤组比，p＜0.05；
[0088]
&表示与美他多辛组比，p＜0.05
[0089]
由表2和图3可知，通过对肝脏匀浆指标进行检测，在慢性兼急性酒精喂养条件下，与空白对照组小鼠相比，酒精模型组小鼠肝脏tg含量显著升高。给予美他多辛或千金藤素治疗均能降低肝脏中的tg水平，且千金藤素降低作用更为明显，在千金藤素20mg/kg给药条件下降脂作用显著(*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001，与酒精模型组比)。组合物1给药组药效与对应浓度千金藤素单独给药相比，对肝脏tg具有更明显的降低作用(#p＜0.05，与对
应浓度千金藤组比)；且二者组合给药药效与美他多辛单独给药组相比，对肝脏tg也具有更显著的降低作用(&p＜0.05，与美他多辛组比)。表明本技术中组合物给药对酒精性脂肪肝的药效要优于单一药物使用，且具有明显的协同作用，其中组合物组1作用效果更为明显。
[0090]
3.4千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物给药后对小鼠血清生化指标的影响
[0091]
通过日立7020生化分析仪检测小鼠血清各生化指标。结果如图4所示。给予慢性酒精喂食以及单次酒精打击能显著增加血清ast和alt的水平(图4中的a和b)，且ast/alt比值均大于3(图4中的c)。千金藤素给药能够显著降低血清中ast和alt的水平(*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001，与酒精模型组比)，且组合物组1具有更好的药效(#p＜0.05，与对应浓度千金藤组比)。酒精喂食还会显著增加血清中的甘油三酯(tg)水平，千金藤素给药能显著降低tg水平，且组合物组1具有更好的药效(#p＜0.05，与对应浓度千金藤组比)(图4中的d)。
[0092]
3.5千金藤素以及包含千金藤素和美他多辛的组合物给药后对atgl(脂肪甘油三酯脂酶)和cpt-1a(肉碱棕榈酰转移酶1a)表达水平的影响
[0093]
atgl和cpt-1a在肝脏脂质分解和脂肪酸氧化中发挥重要作用。atgl负责甘油三酯分解代谢的第一步，是tg水解关键限速酶。而cpt-1a则是负责水解产生的长链脂肪酸向线粒体转运，进而使其氧化分解的关键酶。通过实时定量rt-pcr，检测两个脂质分解关键基因。结果如图5所示。可以发现，经慢性兼急性酒精诱导后，酒精模型组小鼠肝脏中脂质分解相关基因的表达水平显著降低。千金藤素单独处理或与美他多辛组合给药均能显著上调atgl和cpt-1a的基因表达(*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001，与酒精模型组比)。二者组合给药与美他多辛单独给药组相比，能更显著地诱导肝脏中两个脂质分解关键基因的表达(&p＜0.05，与美他多辛组比)，从而改善慢性兼急性酒精诱导所致的小鼠酒精性脂肪肝病。