氯硝柳胺在制备治疗缓解小头症药物中的应用

1.本发明属于医药领域，涉及一种化合物的医药用途，尤其涉及氯硝柳胺在制备治疗缓解小头症药物中的应用。


背景技术：

2.氯硝柳胺一般是作为一种杀鳗剂(iampricide)，也是一种灭螺剂(molluscicide)，为水杨酰胺类衍生物，其抗虫机制为抑制虫体细胞内线粒体氧化磷酸化过程，能量物质atp生成减少，使绦虫的头节和邻近节片变质，虫体从肠壁脱落随粪便排出体外。对虫卵无效。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供氯硝柳胺的一种新用途。
4.氯硝柳胺在制备治疗缓解小头症药物中的应用。
5.具体的，所述氯硝柳胺在制备治疗缓解寨卡病毒感染所致小头症药物中的应用。
6.所述氯硝柳胺具有功能为，激活线粒体吞噬，清除被病毒感染的线粒体，抑制zikv感染小头畸形患者血液和脑组织中zikv的复制。
7.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含氯硝柳胺及常规药用载体。
8.所述药物组合物被制成药学上可接受的剂型。具体的所述药学上可接受的剂型选自混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂。
附图说明
9.图1a为实施例氯硝硫胺治疗使小鼠脑重在感染第7天增加；
10.图1b为实施例氯硝硫胺治疗使小鼠脑重在感染第14天增加；
11.图2a为实施例氯硝硫胺治疗后小鼠血液rna的含量下降；
12.图2b为实施例氯硝硫胺治疗后小鼠脑组织中病毒rna的含量下降；
13.图3a为实施例氯硝硫胺治疗后小鼠脑组织自噬水平增强，寨卡病毒蛋白表达下降；
14.图3b为实施例氯硝硫胺治疗后激活pink1磷酸化；
15.图3c为实施例氯硝硫胺治疗后诱导lc3b增加。
具体实施方式
16.以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
17.实验一：
18.采用1日龄野生型balb/c小鼠，10pfu寨卡病毒经颅内注射给药。氯硝柳胺溶于cmc-na制成悬浊液，首次给药经腹腔注射给药，后每三天口服一次，剂量为50mg/kg。在注射
第7天和第14天采集血液和脑组织样本。将同一窝1日龄野生型新生小鼠分为4组:正常组(un)、寨卡病毒感染组(zv)、安慰剂治疗组(nc)和病毒感染后氯硝柳胺治疗组(nic)。与未感染的小鼠相比，病毒感染导致脑组织横径减小，质地柔软松散。氯硝柳胺治疗后的小鼠脑组织在大小上与正常脑组织相似，且具有明显的韧性。
19.实验二：
20.脑组织样品用苏木精-伊红(he)染色。将脑组织用4％ pfa固定24h以上，在脱水机中用乙醇梯度脱水后包入蜡中，用厚度为3μm的石蜡切片机切片。将切片漂浮在40℃的水中展开，在60℃的烤箱中烘烤。切片依次放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-75％乙醇5min，然后用自来水冲洗。然后用苏木精染色3-5min，盐酸溶液，氨水溶液染色。分别在85％和95％梯度乙醇中脱水，伊红染色5min。切片依次放入无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-无水乙醇ⅲ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min至透明，用中性胶密封。
21.低倍镜下，正常脑组织结构完整清晰，整体染色均匀。然而，感染zikv的脑组织结构不完整、模糊，整体染色较轻。皮质与髓质交界处细胞成分增多，染色较深。
22.此外，氯硝柳胺治疗的小鼠脑组织结构完整清晰，整体染色呈深色，小脑下壁细胞下细胞明显增多。
23.高倍镜下，寨卡感染组和氯硝柳胺治疗组均出现明显炎症、细胞变性或坏死、血管舒张、充血、出血、充血、透明质变性等病理损害。其中，未经治疗的小鼠大脑组织结构丧失、细胞坏死、炎症反应更为严重。如图1a和图1b，感染后第7天和第14天脑组织重量均有所下降，药物治疗后脑组织重量有所增加，感染第14天的结果有意义。
24.实验三：
25.real-time pcr检测小鼠血液和脑组织中的病毒rna。用trizoltm ls提取血液中的rna，用trizoltm按照说明书提取a549细胞或脑组织的细胞总rna，用1μg提取的rna用revertraqpcr rt master mix进行第一链cdna合成。用sybr green real-time master mix和特异性引物对反应混合物(20μl)进行实时定量pcr分析。cdna扩增经过95℃变性15s，引物60℃退火30s，循环40次。使用2-δδct方法计算ct值，用于基因表达的相对定量。rna水平归一化为β-actin rna。如图2a和图2b，氯硝柳胺治疗后，血液和脑组织中zikv ns5 rna均下降。
26.实验四：
27.采用两组抗体(pink1和tomm20，parkin和tomm20)对安慰剂和氯硝柳胺治疗小鼠脑组织石蜡切片进行免疫荧光染色。用tris-edta(50x)抗原修复缓冲液(ph9.0)填充小鼠脑组织修复盒，进行抗原修复。中火加热8min，保温8min，小火加热7min。玻片冷却后置于pbs(ph7.4)中，摇洗3次，每次5min。用组织自身荧光猝灭剂a覆盖组织，室温孵育30分钟，清洗。然后将组织在室温5％山羊血清中封闭30min。轻轻抖去阻塞液，按比例将制备好的一抗(lc3b-1:10 00/zikv capsid-1:10 00/parkinson-1:20 00/pink1-1:10 00/tom20-1:40 00,4℃预冷)加入切片中。切片在4℃的湿箱中平孵育过夜。pbs(ph值7.2～7.4)冲洗3次，每次摇晃5min脱色。切片微干后，组织表面覆盖与一抗对应的二抗(fitc/cy3标记)，室温孵育50min。pbs(ph7.4)摇洗3次，每次5min。切片微干后，在室温暗室中用dapi孵育10min。洗3次，每次5分钟。用组织自身荧光淬灭剂b覆盖组织，室温黑暗孵育5分钟。切片微干后用抗荧
光淬灭片密封。
28.分别分析两种蛋白与线粒体外膜蛋白tomm20的共定位程度。可以看到，在安慰剂组中，pink1或parkin与tomm20的定位是离散的，而药物治疗后，共定位程度增加，说明氯硝柳胺诱导pink1和parkin向线粒体外膜转移，启动线粒体自噬。
29.实验五：
30.采用western blot检测蛋白水平氯硝柳胺线粒体自噬的作用。脑组织样本在ripa缓冲液中与1％磷酸酶抑制剂和1％蛋白酶抑制剂重悬。采用bca蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。电泳时，将20μg蛋白质提取物加载到sds-聚丙烯酰胺凝胶上，然后转移到pvdf膜上。先用5％的牛血清白蛋白阻断细胞膜，然后用一抗在4℃下检测过夜。用tbst(tbs+0.1％tween 20)冲洗3次，然后用二抗(辣根过氧化物酶偶联抗小鼠或抗兔igg)室温孵育1h。用tbst冲洗膜3次后。在imagequant las 4000mini(ge，美国)上使用ecl化学发光底物溶液检测免疫反应带。
31.如图3a到图3c所示，结果证明寨卡病毒感染抑制了pink1 ser228位点的磷酸化。氯硝柳胺治疗则激活被寨卡病毒感染所抑制的磷酸化，进而激活泛素磷酸化，并诱导lc3b的增加，从而抑制寨卡病毒蛋白表达。