一种复合凝胶、制备方法及应用与流程

本发明涉及生物医用材料，尤其是涉及一种复合凝胶、制备方法及应用。

背景技术：

1、聚乳酸(pla)，又称聚丙交酯，是以乳酸为主要原料聚合得到的聚酯类聚合物，因其良好的生物相容性、生物可降解性以及易加工等特点被用于与羟基磷灰石结合，用来提高羟基磷灰石的机械性能和生物性能。当前，再生型注射产品已经再全球范围内被广泛接受，而聚乳酸则充当了再生注射产品中的主要材料。聚乳酸在进入人体皮肤之后，能够刺激人体自身组织的再生。通过人体自身的组织再生，起到结构重塑和容积填充的作用，达到抗衰老的目的。能够在被刺激之后再生的组织，主要是成纤维细胞和胶原蛋白这两类。聚乳酸就能够激发自身成纤维细胞分泌胶原蛋白，使填充与修复效果更加自然，同时增加皮肤光泽度，实现整体面部年轻化的目的。但聚乳酸的天然缺陷在于，聚乳酸在人体中降解产生乳酸，而人体对于乳酸的代谢过程较为缓慢，大量的乳酸聚集容易造成无菌性炎症，从而引发一系列不良反应。因此，需要在使用聚乳酸时，添加碱性中和剂，降低由于局部酸性过强而导致的无菌性炎症。因此，呈碱性且具有良好生物相容性的羟基磷灰石则成为了聚乳酸碱性中和剂的不二之选。

2、聚乳酸与无机材料形成的复合材料已经应用于生物材料之中，例如，cn106139256a公开了一种聚乳酸/纳米β-磷酸三钙复合多孔支架，cn111905151a公开了一种介孔生物活性玻璃/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合微球。

3、特别的，对于羟基磷灰石与聚乳酸的复合材料在骨科等领域已经广泛使用。黄梽焕等(复合材料学学报，2021，38：749-760)在研究了纳米hap-聚左旋乳酸(plla)复合材料中发现，添加了hap的plla压缩屈服强度和拉伸强度对比纯plla材料分别提高了9.4％和6.6％，初始分解温度较纯plla分别提高了7.4％和5.6％，结晶度提高了6.7％。由此可见，增加了hap的plla材料在材料学性能方面，较纯的plla材料优势明显。此外，羟基磷灰石可以减弱炎症：与增加了hap的pla材料相比，纯pla的炎症反应更强烈，而hap-pla复合材料在体内仅表现了及轻微的炎性反应。由此可以证明，hap的添加能够中和由于pla降解带来的酸性物质，减少由于酸性带来的无菌性炎症。

4、目前国内外已有相关羟基磷灰石与聚乳酸二元复合材料以及羟基磷灰石与聚乳酸和其他聚合物三元复合材料或者复合微球报道。dong yan(additive manufacturing,2020；34:101305)等人已经制备得到了聚乳酸与纳米级羟基磷灰石共混微球，微球的最小粒径最约100μm，主要用于微载体等研究。专利如一种纳米羟基磷灰石/聚乳酸复合微球的制备方法(cn101590388a)、一种负载羟基磷灰石的聚乳酸多孔微球及制备方法(cn103868658b)、一种骨组织用聚乳酸/羟基磷灰石晶须复合多孔支架及制备方法(cn105797215a)、聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用(cn109749119 a)、一种聚乳酸羟基磷灰石复合微球表面多孔结构的可控化制备方法及应用(cn107519536a)、羟基磷灰石/改性聚乳酸复合微球的制备方法(cn109350768a)以及羟基磷灰石/聚乳酸/壳聚糖复合微球的制备方法(cn102489231b)等主要应用于的骨缺陷的修复、填充和载药性能，并未应用于组织填充领域。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种复合凝胶、制备方法及其应用，所述复合凝胶集透明质酸、聚乳酸以及无机材料三种材料的优势于一体，可用于生物组织的填充与修复。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、一种复合凝胶，由聚乳酸和双相微球与透明质酸交联制得，所述的双相微球为聚乳酸/无机材料双相微球。

4、进一步的，所述的无机材料选自碳酸钙、磷酸钙或酒石酸钙中的一种或多种；进一步的，所述的磷酸钙优选为羟基磷灰石；更进一步的，所述的无机材料为纳米无机材料。

5、在一个实施方案中，所述的无机材料为纳米羟基磷灰石钙。

6、进一步的，所述的透明质酸为交联透明质酸；进一步的，所述的交联透明质酸通过交联剂制备得到，所述的交联剂选自二醛、二硫化物、聚乙二醇(peg)交联剂、二乙烯基砜、二缩水甘油醚、双环氧化物、二胺或多胺中的一种或多种。

7、更进一步的，所述的交联剂选自双碳二亚胺、脂肪二胺、乙二胺、己二胺、内源多胺(精胺或亚精胺)、季戊四醇四缩水甘油醚(petge)、二乙烯砜(dvs)、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)、1，2-双(2，3-环氧丙氧基)乙烯(egdge)、1，2，7，8-二环氧基辛烷(deo)、(亚苯基双-(乙基)-碳二亚胺和1，6-六亚甲基双(乙基碳二亚胺)、己二酸二酰肼(adh)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(bs)、六亚甲基二胺(hmda)、1-(2，3-环氧丙基)-2，3-环氧环己烷、1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油醚氧丁烷、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、1，3-丁二烯二环氧化物、1，2，7，8-二环氧辛烷、1，5-己二烯二环氧化物。优选的，所述的交联剂为二胺或多胺，其反应过程可以参考专利cn99813143.1、us9907739、cn202111326226.7等。

8、进一步的，所述的交联包括双相微球中聚乳酸与透明质酸交联。

9、进一步的，所述的聚乳酸与透明质酸交联包括物理静电交联和化学交联中的任一种。所述化学交联包括将双相微球中的聚乳酸与透明质酸反应形成酰胺键交联反应。所述物理静电交联包括将双相微球进行表面电荷改性后与透明质酸形成静电交联。更进一步的，所述化学交联包括将双相微球中的聚乳酸进行氨基修饰后与透明质酸反应形成酰胺键交联反应，所述物理静电交联包括将双相微球进行表面电荷改性后与具有正离子的交联透明质酸形成静电交联。

10、在一个实施方案中，提供了一种复合凝胶，由聚乳酸和纳米级羟基磷灰石组成的双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球与透明质酸交联制得。

11、一种复合凝胶的制备方法，包括将由双相微球与透明质酸进行交联形成复合凝胶(三相复合凝胶)，所述的双相微球为聚乳酸/无机材料双相微球。

12、进一步的，所述的双相微球与透明质酸交联包括双相微球中聚乳酸与透明质酸交联。

13、进一步的，所述透明质酸为非交联的透明质酸或交联的透明质酸。在一个实施方案中，所述的透明质酸为交联透明质酸，优选为二胺或多胺交联的透明质酸，更优选为内源多胺交联的透明质酸。

14、在一个实施方案中，所述双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球中，羟基磷灰石的质量占微球总质量的0.1-50％，微球除羟基磷灰石外的其余部分均为聚乳酸。

15、在一个实施方案中，以多胺为交联剂制备交联的透明质酸水凝胶，优选地，多胺交联剂占透明质酸总质量的0.5～20％；所述水凝胶中，透明质酸的质量浓度范围为1～35mg/ml。

16、在一个实施方案中，所述透明质酸为由微生物发酵法制备的透明质酸；优选地，所述透明质酸的分子量范围为100kda～3000kda，优选500kda～1500kda。微生物发酵的透明质酸为非动物源透明质酸，其分子量分布更加均一。

17、在一个实施方案中，所述交联为固相交联；进一步地，所述固相交联包括物理静电交联和化学交联中的任一种。

18、在一个实施方案中，所述化学交联包括将双相微球中的聚乳酸进行氨基修饰后，将修饰后的双相微球与透明质酸反应形成酰胺键交联；进一步的，所述的氨基修饰包括将双相微球与胺类化合物反应；更进一步的，酰胺键交联包括将修饰后的双相微球与透明质酸在碳二亚胺活化剂存在下进行偶联反应。

19、在一个实施方案中，所述胺类化合物包含二胺、多胺或多氨基化合物；优选地，所述二胺包括脂族二胺、芳族二胺和杂原子二胺中的任一种；例如但不限于脂肪二胺、乙二胺、己二胺；所述多胺包括脂族多胺、芳族多胺和杂原子多胺中的任一种；例如但不限于内源性多胺如亚精胺、精胺；所述多氨基化合物包括双端氨基化聚乙二醇和末端氨基化多臂聚乙二醇中的任一种；

20、进一步地，所述碳二亚胺活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺、1,3-二[二(甲氧甲基)甲基]碳二亚胺中或其盐的一种或多种。

21、在一个实施方案中，所述制备方法还包含与碳二亚胺活化剂一起联合使用助剂；例如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、叔丁醇等。水溶性碳二亚胺活化剂需要与助剂联合使用以提高交联反应效率，助剂的加入量为碳二亚胺质量的10～30％。

22、在一个实施方案中，所述化学交联中双相微球与所述透明质酸的质量比为1：0.5～20，优选为1：1～10；

23、反应体系中所述胺类化合物的加入量为所述双相微球质量的30～200％；所述胺类化合物的浓度范围为10～1000mg/ml；

24、进一步地，所述碳二亚胺活化剂的加入量为所述透明质酸总质量的10～150％；

25、进一步地，所述透明质酸溶液的浓度为10～100mg/ml；

26、进一步地，所述氨基修饰反应和所述述酰胺键交联反应的温度为5～60℃，反应时间为6～24h；反应体系的ph值范围为5.0～6.0。

27、在一个实施方案中，所述的微球为双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球，所述的化学交联包括将双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球在置于水中分散，加入胺类化合物(多胺衍生剂)，调节ph值，使微球表面的羧基与多胺衍生剂发生表面修饰反应，在表面修饰上氨基；将表面氨基修饰的聚乳酸羟基磷灰石分散微球(pla-hap双相微球)投入到透明质酸溶液中，调节ph值5.0～6.0，同时加入碳二亚胺活化剂与助剂，完成pla-hap双相微球的偶联反应。表面修饰反应温度为5～60℃，反应时间为6～24h；偶联反应的温度为5～60℃，反应时间为6～24h。

28、所述物理静电交联包括将所述双相微球进行表面电荷改性，得到表面携带负离子的改性双相微球，将改性双相微球与具有正离子的交联透明质酸混合，发生静电交联；进一步的，所述的具有正离子的交联透明质酸为具有采用二胺或多胺交联得到的交联透明质酸；更进一步的，所述的双相微球进行表面电荷改性包括将双相微球浸泡于碱性缓冲液中分离得到。

29、进一步，所述物理交联中双相微球与所述交联的透明质酸的质量比为1：1～50；优选为1：1～20；

30、进一步地，所述碱性缓冲液为碱性磷酸盐缓冲液；所述碱性磷酸盐缓冲液的ph范围优选为9.0～11.0。

31、在一个实施方案中，所述的微球为双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球，所述物理交联包括双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球浸泡于ph9.0～11.0的pbs溶液中进行表面电荷改性，使得微球表面携带负电荷，分离取出双相微球，与多胺作为交联剂的交联透明质酸凝胶进行物理混合，使得聚乳酸表面的羧酸根负离子与交联透明质酸中的铵正离子发生静电交联。

32、在一个实施方案中，本发明还包括双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球的制备方法，所述方法包括

33、(a)将聚乳酸(pla)溶于二氯甲烷中充分搅拌溶解配置成溶液，随后过滤除去不溶物；

34、(b)加入羟基磷灰石进行超声，搅拌均匀，使羟基磷灰石完全分散在溶液中，形成羟基磷灰石均匀分散的悬浊液；

35、(c)按照所述二氯甲烷的比例配置聚乙烯醇溶液进行搅拌，在此期间将二氯甲烷悬浊液滴加到该体系中，在搅拌剪切作用以及乳化作用下形成微球；

36、(d)将乳化后的溶液进行水浴、搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后将所得溶液洗涤，过滤。

37、在一个具体的实施方案中，所述步骤(a)中，优选地，所述pla的二氯甲烷溶液浓度为10mg/ml～80mg/ml，包括但不限于：15mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，60mg/ml和80mg/ml。

38、优选地，所述pla包含聚左旋乳酸(plla)、聚消旋乳酸(pdlla)以及聚右旋乳酸(pdla)中的一种或多种的混合物。

39、优选地，所述pla的分子量范围为10kda～150kda。

40、在一个具体的实施方案中，所述步骤(b)中，优选地，所述羟基磷灰石质量分数1％～20％，保证其能够完全结合到聚乳酸微球中。

41、优选地，所述超声能量为1-300kj，优选能量为1-20kj，超声能量计算公式如下：

42、超声能量(kj)＝超声功率(w)×超声时间(s)/1000。

43、在一个具体的实施方案中，所述步骤(c)中，优选地，所述聚乙烯醇溶液浓度为5mg/ml～30mg/ml，在此浓度区间可以保证乳化效果，控制微球尺寸。

44、优选地，所述二氯甲烷溶液与聚乙烯醇溶液比例为1/2-1/10。

45、优选地，所述的搅拌设备中搅拌桨的转速为100～600rpm/min，在此转速区间，能够保证持续乳化，形成良好的乳浊液。

46、在一个具体的实施方案中，在步骤(d)中，优选地，所述水浴温度为20～37℃，在此温度区间可以控制二氯甲烷挥发速率，从而优化微球的中空效果以及表面微孔构造；在步骤(d)后，将所得滤饼进行干燥即可得到双相聚乳酸羟基磷灰石纳米分散微球；优选地，所述干燥过程包括真空烘干和冷冻干燥两种方式，真空干燥是利用在近似真空条件下，水沸点下降，在较低的温度下将水分挥发出来，冷冻干燥法是利用冰晶升华的原理，避免了固相组分液化过程对微球内部结构的破坏，能够更好地保持制备得到的聚乳酸微球的空间结构。

47、在一个实施方案中，本发明复合凝胶的平均弹性模量为400至1000pa。

48、在一个实施方式中，本发明复合凝胶的灭菌前后弹性模量损失率低于30％，更优选的，低于20％。在另一个方面，本发明保护所述制备方法制得的复合凝胶。

49、在再一个方面，本发明还保护复合凝胶在制备药物载体、组织填充物或组织修复材料中的应用。

50、进一步的，所述的药物载体可以为生物药物、化学药物或天然提取药物的药物载体。

51、有益效果：

52、(1)本发明通过先制备聚乳酸-无机材料双相微球，再利用固相交联技术将双相微球中聚乳酸末端的羧基基团与透明质酸进行物理静电交联或化学交联，形成三相复合凝胶稳定性高，生物相容性好，可用于生物组织的填充与修复。

53、(2)本发明中的双相微球，由于加入了亲水的钙盐无机材料(如羟基磷灰石、磷酸钙、酒石酸钙等)，进一步提高了聚乳酸微球的亲水性。并且双相微球中钙基无机材料可以以微米级的聚乳酸为载体，引入到宏观的交联透明质酸的网络结构中(交联透明质酸的颗粒也是微米级别)，通过钙离子与透明质酸中的羧基和羟基的络合作用，填补了交联透明质酸之间的网络缝隙，使得三相凝胶具有更紧密的网络结构；同时借助钙基无机材料与透明质酸的络合作用，拉近了聚乳酸与透明质酸分子链之间的距离，从而提高两者交联反应效率，提高三相复合凝胶的机械强度与热稳定性。

54、(3)本发明制备方法工艺简单，操作方便，易于实现产业化。

55、(4)本发明制得的复合凝胶可发挥透明质酸的即时填充作用、聚乳酸的胶原再生作用以及钙基无机材料如羟基磷灰石骨性填充与中和乳酸的作用，集三种材料的优势于一体。